Summary
Um protocolo otimizado para o isolamento de células-tronco a partir da glândula salivar do mouse é descrito. O método emprega digestão enzimática e mecânica, e permite o isolamento de salispheres contendo células com características de células-tronco.
Abstract
Madura glândulas salivares de origem humana e do rato compreendem um mínimo de cinco tipos de células, cada qual facilita a produção e excreção de saliva na cavidade oral. Células acinares serosas e as mucosas são as proteínas e fábricas que produzem muco da glândula, respectivamente, e representam a origem da produção de saliva. Uma vez sintetizados, os vários enzimática e outros componentes proteicas de saliva são secretados por uma série de células epiteliais ductais rolamentos do tipo morfologia, até que a eventual expulsão da saliva através de um duto grande para a cavidade da boca. A composição da saliva também é modificado pelas células ductais durante este processo.
Na manifestação de doenças como a síndrome de Sjögren, e em algumas situações clínicas, tais como o tratamento de radioterapia para câncer de cabeça e pescoço, a produção de saliva pelas glândulas é drasticamente reduzido 1,2. A xerostomia resultante, uma sensação subjetiva de boca seca, afeta não só a capacidade do paciente de engolir e falar, mas também incentiva o desenvolvimento de cárie dentária e pode ser socialmente debilitante para o sofredor.
A restauração da produção de saliva nas condições acima mencionadas clínica, portanto, representa uma necessidade não atendida clínica, e, como tal, vários estudos têm demonstrado a capacidade de regeneração das glândulas salivares 3-5. Mais para o isolamento de células-tronco como as populações de células de vários tecidos dentro do mouse e corpos humanos 6-8, temos mostrado usando o método descrito que as células-tronco isoladas das glândulas salivares do mouse pode ser usado para resgatar a produção de saliva na salivares irradiadas glândulas 9,10. Esta descoberta abre o caminho para o desenvolvimento de células-tronco terapias baseadas no tratamento de condições xerostomic em seres humanos, e também para a exploração da glândula salivar como um microambiente contendo células multipotentes com capacidades de auto-renovação.
Protocol
1. Preparação Regent
- Buffer: 1% (w / v) de soro albumina bovina em solução salina balanceada de Hank
- Enzimas reconstituir. Enzima hialuronidase: 40mg / mL, dissolvido em tampão. Colagenase II: 23mg / mL, dissolvido em tampão. Utilizar soluções recentemente enzima preparado fresco para cada isolamento. Quando dissolvido loja, a 4 ° C até o uso para a digestão.
- 50 mM de cloreto de cálcio em água destilada. Filtro de esterilização através de um filtro tamanho 0,2 uM poros.
- Glândulas salivares do rato meio de cultura (MSG): DMEM: F12 com penicilina (100 UI / mL), estreptomicina (100 mg / mL), Glutamax (2 mM), fator de crescimento epidérmico-2 (20 ng / mL), fator de crescimento de fibroblastos -2 (20 ng / mL), N2 suplemento (1%), a insulina (10 mcg / mL) e dexametasona (1 mM).
2. A digestão enzimática do tecido mecânico e
- Pesar as glândulas salivares dissecadas.
- Pique glândulas em uma polpa homogênea usando uma tesoura esterilizada dissecção curvas em uma pequena placa de Petri.
- Coletar tecido picada em 14 mL tubos, usando 1mL de tampão por tecido submandibular 80mg. Lave os pratos de Petri limpa de tecido usando algumas das buffer.
- Adicionar outro 1 mL de tampão por 80 mg de tecido, seguido de 25 mL de solução de enzima colagenase II, 25 mL de solução de enzima hialuronidase e 250 mL de solução de cloreto de cálcio por 80 mg de tecido. Se trabalhar com grandes quantidades de tecido, as etapas 2,4-2,9 pode ser realizada em frascos de cultura de tecidos T25 por conveniência.
- Incubar em banho-maria agitando-se a 37 ° C por 20 minutos. Remova os tubos e triturar com uma pipeta para misturar completamente enzima através do tecido novo.
- Substituir em banho-maria por mais 20 minutos.
- Coletar tecido por centrifugação a 400 xg, por 8 minutos. Elimine o sobrenadante.
- Ressuspender em 2 mL de tampão para cada tecido de 80 mg, e repita enzima ea adição de cloreto de cálcio como acima. Incubar 20 minutos em banho-maria agitando. Remova os tubos e triturar com uma pipeta para misturar enzimas completamente.
- Incubar por 20 minutos finais em tremendo banho de água. Coletar células por centrifugação, tal como acima, elimine o sobrenadante.
3. Etapas de lavagem
- Ressuspender cada 80 mg de tecido em 2 mL de tampão e pipetar para lavar tecidos livres de enzimas.
- Centrífuga como antes para coletar. Elimine o sobrenadante.
- Repita lavagem usando um tampão por 80 mL de tecido mg. Centrífuga para coletar, elimine o sobrenadante.
4. Filtragem
- Ressuspender solução tecido em 1 mL de tampão por 80 mg de tecido.
- Adicionar solução para filtro de 100 mm de poro de tamanho colocado mais de 50 tubos Falcon mL. Não aplique mais de 3 mL de solução de tecido picada por coluna, como filtros podem ficar bloqueados. Permitir a vazar. Remover o material filtrado pendurado na parte de baixo do filtro, com uma pipeta, e adicionar ao filtrado.
- Use seringa com agulha de calibre 26 para tomar a partir de 50 mL filtrado tubos e aplicar filtros para 50 mm tamanho dos poros, em 5 tubos mL. Permitem filtrar, auxiliando soltando tampas, se necessário.
- Tubos de centrífuga como antes para coletar. Elimine o sobrenadante.
5. Revestimento e Médio
- Combine todos os pellets em um volume. Contagem usando contador de células automatizado ou hemocitómetro.
- Células da placa com uma densidade de 0,4 x 10 6 células por poço, de 12 bem-placa, ou 2,67 x 10 6 células por frasco de cultura de tecidos T25. Adicionar um meio MSG mL em cada poço ou 6 ml para cada frasco T25.
- Incubar a 37 ° C. Esferas devem ser claramente visível de dia 2.
6. Resultados representativos:
Depois de 2-3 dias em cultura, pequenos agregados de células (salispheres) será evidente nas culturas. Salispheres continuará a crescer em tamanho ao longo de um período de 10 dias em cultura. Representante fase de imagens de microscopia de contraste de salispheres são mostrados na Figura 1. Células em proliferação expressando as proteínas de células-tronco associada marcador pode ser isolado de tais esferas, otimamente entre os dias de isolamento pós 3-5, e são capazes de diferenciação em funcionais, saliva células acinares produzindo.
Figura 1. Salisphere formação in vitro. Após a digestão mecânica e enzimática utilizando o protocolo atual, esferas de tamanho crescente pode ser encontrado nas culturas flutuante. Os painéis são representativos fase de imagens de microscopia de contraste de esferas de dias 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra de escala = 50 mm.
Discussion
O método de cultura de tecidos descrito aqui representa um protocolo reprodutível para o isolamento de células-tronco contêm salispheres das glândulas salivares de ratos. Estudos utilizando células isoladas desta forma têm destacado a capacidade regenerativa das células da glândula salivar-tronco 9. Transplante de uma centena de células + c-Kit derivado do salispheres induzida a recuperação funcional das glândulas salivares de ratos irradiados. Estes dados são estimulantes e fornecer um ponto de partida para a investigação de células-tronco para terapia baseada xerostomia. Muitos caminhos ainda precisam ser exploradas no entanto, incluindo a plena perfil de expressão do marcador de proteína das células-tronco, a capacidade das glândulas submandibulares de resgatar a função das glândulas salivares parótidas irradiadas e vice-versa, ea caracterização da suposta in vivo nicho de células-tronco de as células. Em última análise, a tradução deste protocolo para amostras de tecido humano eo potencial subseqüente para o tratamento da xerostomia em pacientes humanos utilizando células isoladas é a aplicação mais empolgante do método descrito.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
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