Summary
一个细胞类型特异性的蛋白定位和穿梭核质特性的灵活和有效的方法是描述。这异核体的方法是使用荧光标记的融合蛋白细胞融合后图像蛋白质本地化。该协议是经得起稳态本地化或活细胞成像的基础上更具活力的测定。
Abstract
大量的蛋白质，是受细胞内贩卖或nucleocytolasmic穿梭。这些蛋白质显示了包括核进口/出口RNA和蛋白质，转录调控和细胞凋亡的细胞功能的多样化。有趣的是，主要包括细胞分裂，分化和改造的细胞重组，往往涉及这类活动 3,4,8,10 。这些蛋白质和各自的监管机制的详细研究是具有挑战性的，这些本地化的变化可以难以捉摸的刺激，和运动本身可以是相当动态的，难以跟踪。涉及细胞癌变的研究，例如，继续受益于理解的途径和蛋白质的活动之间的正常原代细胞和转化细胞6,7,11,12不同。由于许多蛋白质在改变本地化改造或作为一个转型的结果，有效地描述这些蛋白质的方法和途径其所参与的立场，以改善癌变和靶向药物开辟新的领域的理解。
这里我们提出一个分析蛋白质贩运的方法，小学和转化哺乳动物细胞之间的穿梭活动。这种方法结合荧光显微镜的异核体融合的生成提供了一个灵活的协议，可用于检测的稳态或动态的蛋白质本地化。正如图1所示，两个独立的细胞类型，瞬时转染轴承氟蛋白基因连接到感兴趣的基因质粒结构。表达后，细胞融合使用聚乙二醇，蛋白质本地化可能使用多种方法进行成像。这里介绍的协议可能会增加专业技术的一个根本途径。
Protocol
1。转染细胞系
转染法1
（龙沙Nucleofection为增加原代细胞的转染效率）
- 细胞应该是最近通过的，并在转染前数期增长。洗净phophate细胞缓冲液（PBS）和收获细胞由胰蛋白酶。
- 在1500 XG 5分钟，离心收集细胞。
- 添加消毒盖玻片的6孔板。盖玻片，可增强细胞粘附涂层。广场1.5毫升培养基（在这种情况下贝科的改良Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS），）每孔和平衡在孵化器的媒体。
- 收获细胞胰蛋白酶和悬浮在最小的体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 计数细胞，离心再悬浮的正确金额，提供 5％〜5X10样品细胞。
- 仔细的细胞重悬于100μL室温每个样品Nucleofector解决方案。
- 联合收割机100μL的细胞悬液与5μg质粒DNA和样品转移到Nucleofector试管，小心不要包括气泡。
- 选择适当Nucleofector的程序（这可能需要以前的测试，以确定最佳的转染效率与死亡率最低）。
- Nucleofector试管架含有悬浮细胞/ DNA插入试管，并开始选择的程序。
- 完成后，取出试管，并添加〜500μL预平衡文化传媒（6孔板）。
- 立即转移到6孔板终体积为1.5毫升，每孔样品。细胞应该是镀在任一混合种群或单独控制。
转染法2
（Qiagen公司Effectene转染细胞系）
- 准备使用Qiagen公司Effectene试剂的转染复合物，由先加入每个质粒DNA样本的0.8微克至200μL欧共体缓冲区。
- 每个样品中加入6.4μL，增强试剂，混合短暂弹管，为2分钟，在室温下孵育。
- 每个样品中，混合加入20μLEffectene试剂弹管，15分钟在室温下孵育。
- 在此孵化，准备转染细胞系的利益。最近传代细胞（<80％汇合）洗一次在磷酸盐缓冲液（PBS）。在这种情况下加回1.5毫升新鲜的温暖和平衡增长中期（贝科改良Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS））。
- 一旦转染复合物孵育15分钟，1.2毫升的媒体转移到每个样品。混合吹打，并立即传送〜700μL的配合，在6孔板每两个水井。加入滴加，旋流板，轻轻混匀。允许细胞转染至少3个小时（可能会随细胞类型）来完成。
- 消毒盖玻片添加到一个新的6孔板。盖玻片，可增强细胞粘附涂层。
- 转染细胞后，洗细胞两次，用PBS和收获最小的trysinization细胞，每孔加入约100μL胰蛋白酶溶液，简要搅拌充分大衣每口井的板，并立即吸胰蛋白酶。一旦细胞已经解除，加1.5毫升的新鲜传媒。
- 此时，细胞混合或单独到无菌盖玻片的人口（控制）应镀。
- 让细胞恢复了12个小时。
2。细胞融合
- 删除从细胞的培养基，用PBS洗两次。
- 在这一点上，它是建议治疗与放线菌酮（100微克/毫升）的细胞，抑制蛋白质的合成。允许细胞孵育2小时，然后用PBS洗涤细胞两次。
- 保险丝细胞暴露在室温为125秒，50％聚乙二醇1000（PEG 1000），在无血清DMEM溶液。
- 用PBS清洗细胞，以消除聚乙二醇1000解决方案，并加入2 ml新鲜温暖和平衡的媒体。
- 允许细胞孵育18 - 24小时。
荧光显微镜
- 取出培养基，并在PBS洗细胞两次。
- 加入1毫升4％多聚甲醛溶液（PBS）的每口井，修复细胞。轻轻搅拌15分钟。
- 在PBS洗两次固定细胞。
- 小心地从板盖玻片，灯芯多余的PBS。反转到显微镜玻片上装有安装介质的下降（90％甘油，100MM的Tris pH值7.5，2％的DABCO（1,4 - diazabicoyclo辛烷值）含有的DAPI（4',6 - diamidino - 2 -苯基吲哚）。
- 从幻灯片中删除多余的安装介质，密封合作VER单用指甲油。
- 通过共聚焦或epifluorescence显微镜可视化的细胞。
3。代表性的成果
图2显示了一个例子异核实验，使用的主要的成纤维细胞和H1299非小细胞肺癌细胞。在这个实验的兴趣蛋白（鸡贫血病毒VP3）epifluorescence显微镜观察显示本地化主要是细胞质的主要细胞类型，并在转化细胞类型的核本地化。作为一个融合（无论是绿色荧光蛋白的pEGFP - N1载体，Clontech公司）在主包皮成纤维细胞（PFF）或DsRed的H1299细胞（DsRed的N1载体，Clontech公司）的蛋白表达。控制样品涉及自我融合（前两行）显示多核细胞，在稳定状态下的本土化模式没有改变。这种变化，否则可能出现由于融合条件或syncitia形成的敏感性。异核体的融合（下排）证明GFP融合的主要细胞衍生的蛋白质和引进转化的细胞材料DsRed的融合蛋白的共定位核项目。显示的例子是一种比较罕见的只有两个单元，每个类型之一存在两个氟蛋白信号表明，异核体融合。除了检测本地化转换这些类型，核质穿梭活动，可以很容易被发现在两个细胞核的单荧光团的存在。这种类型的决心是明确的审查1:1细胞融合时，将取决于抑制翻译。
图1。流程图异核体使用主成纤维细胞和非小细胞肺癌细胞H1299的方法 。感兴趣的基因被克隆产生帧融合两个荧光蛋白基因之一。要么构造，然后瞬时转染细胞系，并允许恢复。异核体的形成是诱发进一步孵化与聚乙二醇（PEG）进行了简短的治疗。最后，感兴趣的蛋白质的亚细胞定位是使用各种形式的荧光显微镜观察。
图2。胞核贩运和鸡贫血病毒VP3蛋白的穿梭活动可视化的异核体的融合。首行：代表的图像，中间一排的自我融合H1299细胞表达DsRed的- VP3：小学包皮成纤维细胞的PEG融合后表达GFP - VP3（PFF）代表epifluorescence 图像底部行 ：PFF和H1299细胞的异核体的融合。黄色表示的绿色荧光蛋白DsRed的信号的共定位。细胞成像使用徕卡AF6000E荧光显微镜和Leica成像软件。
Discussion
这里介绍的异核协议提供了一个高效和容易解释的方法对细胞的特定类型的本地化行为，以及核质穿梭活动表征。此方法采用荧光分析的灵敏度，以及图像的活细胞和执行蛋白质动力学的研究能力的优势。该技术是很容易适应许多不同类型的细胞，是适合生活和固定细胞成像。例如，倒置荧光显微镜可用于实时成像和时间的推移视频采集。相比之下，安装细胞可用于epifluorescence显微镜无论是稳态本地化或更详细的共焦成像离散本地化的决心。此外，如荧光漂白后恢复（FRAP），或在漂白荧光丢失（FLIP）的技术可用于确定本地化动力学 1 。协议的替代荧光团的法团，将允许的蛋白质相互作用的实验荧光共振能量转移（FRET） 将在演唱会2进行。 leptomycin B或显性负，如蜂窝贩运的各种抑制剂冉GTP酶的结构，可以用来建立对特定进口或出口的途径5,6,9的依赖。
- 在某些实验涉及穿梭活动中，必须小心，以避免由于新的蛋白质合成的本地化效果。在这种情况下，转换酶抑制剂或有限的时间点必须使用。然而，由于翻译抑制的文物仍然是一个可能性。含有不同的细胞类型的细胞融合是最想要的穿梭和本地化的行为明确的解释。优化细胞的数量和融合条件（时机和浓度）可能是必要的，以促进这种良好的1:1融合事件。
- 重要的是要注意，在协议中的某些步骤的优化，将需要使用特定的细胞类型而定。在实验过程中，如融合效率，转染效率，融合后的生存能力方面会有很大的改变之间的细胞类型。尤其是主要的细胞类型可以是具有挑战性的管理，由于复杂的文化条件和转染效率低。龙沙Nucleofector设备，如技术的使用可以使细胞的快速处理，以及转染效率显着提高。此外，电的方法，使悬浮液中的细胞融合的后续步骤，便于转移。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢资助的伍斯特理工学院化学与生物化学系。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
