Summary
שיטה גמישה ויעילה לאפיון של לוקליזציה סוג ספציפי חלבון התא nucleocytoplasmic הלוך ושוב מתואר. גישה זו משתמשת heterokaryon חלבונים היתוך fluorescently-שכותרתו לגרסאות המגוירות חלבון תמונה לאחר איחוי תאים. פרוטוקול ניתנת היציב לגרסאות המגוירות או קביעות יותר דינמי המבוסס על הדמיה תא חי.
Abstract
מספר משמעותי של חלבונים מוסדרים על ידי סחר subcellular או nucleocytolasmic הלוך ושוב. חלבונים אלה להציג מגוון רחב של תפקודים תאיים כולל לייבא גרעיני / יצוא של רנ"א וחלבונים, תקנה תעתיק, ו אפופטוזיס. מעניין, וארגון מחדש הסלולר הגדולות, כולל חלוקת התא, בידול ושינוי, לעתים קרובות כרוך פעילויות כגון 3,4,8,10. מחקר מפורט של החלבונים האלה מנגנוני הרגולציה שלהם יכול להיות מאתגר כמו גירוי על שינויים אלה לוקליזציה יכול להיות חמקמק, והתנועות עצמם יכולים להיות דינמי די קשה לעקוב. מחקרים שכללו oncogenesis הסלולר, למשל, ממשיכים ליהנות מסלולים הבנה ופעילויות חלבון שונים בין תאים ראשוניים נורמליים ותאי שינה 6,7,11,12. כאשר חלבונים רבים מראים לוקליזציה שינו במהלך טרנספורמציה או כתוצאה של שינוי, שיטות כדי לאפיין ביעילות אלה חלבונים המסלולים שבהם הם משתתפים עומדים לשפר את ההבנה של oncogenesis ושטחים פתוחים תרופה חדשה המיקוד.
כאן אנו מציגים שיטה לניתוח סחר חלבון הלוך ושוב בין פעילות בתאי יונקים העיקרי והפך. שיטה זו משלבת את דור fusions heterokaryon עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספק פרוטוקול גמיש שניתן להשתמש בהם כדי לזהות לגרסאות המגוירות חלבון היציב או דינמי. כפי שמוצג באיור 1, שני סוגי תאים נפרדים transfected transiently עם בונה פלסמיד הנושא גן fluoroprotein המצורפת הגן של עניין. אחרי הביטוי, התאים הם התמזגו באמצעות פוליאתילן גליקול, ואת לגרסאות המגוירות חלבון עלול אז להיות צילמו באמצעות מגוון של שיטות. הפרוטוקול המובא כאן הוא גישה בסיסית אשר בטכניקות מיוחדות ניתן להוסיף.
Protocol
1. Transfection של שורות תאים
Transfection שיטה 1
(Lonza Nucleofection עבור מוגברת יעילות התא הראשוני transfection)
- תאים צריכים להיות מעבר האחרונות בצמיחה יומן שלב לפני transfection. שטפו תאים phophate שנאגרו מלוחים (PBS) ותאי הקציר ידי trypsinization.
- איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 5 דקות.
- הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6 באר. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. מקום 1.5 מ"ל של התקשורת בתרבות (במקרה זה מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)) לתוך כל טוב לאזן את התקשורת בחממה.
- קציר התאים על ידי trypsinization ו resuspend בהיקף מינימלי של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
- ספירת התאים צנטריפוגות את הסכום הנכון של resuspension לספק ~ 5x10 5 תאים לדגימה.
- Resuspend התאים בקפידה 100 הטמפרטורה μL פתרון Nucleofector החדר המדגם.
- מערבבים 100 μL ההשעיה תא עם דנ"א 5 מיקרוגרם פלסמיד ולהעביר את המדגם כדי קובט Nucleofector נזהר שלא לכלול בועות אוויר.
- בחר את תוכנית Nucleofector המתאים (זה עשוי לדרוש בדיקה קודמת להקים transfection יעילות אופטימלית עם תמותה מינימלית).
- הכנס את קובט המכיל את ההשעיה תא / דנ"א לתוך המחזיק קובט Nucleofector ולהתחיל בתוכנית שנבחרה.
- בסיום, להסיר את קובט ולהוסיף ~ 500 μL של טרום equilibrated התקשורת בתרבות אליו (נלקח מתוך צלחת 6-היטב).
- מיד להעביר את הדגימה לתוך צלחת 6-היטב עם נפח סופי של 1.5 מ"ל לכל טוב. תאים צריכים להיות מצופה באחת אוכלוסיות מעורבות או בנפרד, עבור פקדי.
Transfection שיטה 2
(Qiagen transfection Effectene עבור שורות תאים)
- הכן מתחמי transfection באמצעות מגיב Effectene Qiagen ידי הראשון מוסיף 0.8 מיקרוגרם של כל דגימה DNA פלסמיד למאגר 200 EC μL.
- הוסף 6.4 μL מגיב משפר מדגם זה, מערבבים בקצרה על ידי מצליף את הצינור, ואת דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 20 מגיב Effectene μL לערבב כל המדגם, על ידי מצליף את הצינור, ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- במהלך הדגירה זה, להכין את שתי שורות תאים של עניין transfection. שטפו תאים passaged לאחרונה (<80 מפגש%) פעם שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). הוסף גב 1.5 טרי מ"ל התחמם equilibrated צמיחה בינוני (במקרה זה שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)).
- לאחר מתחמי transfection יש מודגרות למשך 15 דקות, להעביר 1.2 מ"ל של התקשורת מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting, ומיד להעביר ~ 700 μL של קומפלקסים לכל אחד שתי בארות בצלחת 6-הבאר. הוסף dropwise, ומערבבים בעדינות ידי על ידי מתערבל את הצלחת. אפשר התאים transfect לפחות 3 שעות (עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא).
- הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6-באר חדשה. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת.
- אחרי התאים יש transfected, לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולאסוף את התאים על ידי trysinization מינימלי על ידי הוספת כ -100 פתרון טריפסין μL זה טוב, בקצרה להסעיר את הצלחת מעיל מלא כל טוב, ומיד aspirating את טריפסין. ברגע שהתאים נוקף, להוסיף 1.5 התקשורת טרי מ"ל.
- בשלב זה, התאים צריכים להיות מצופה באוכלוסיות או מעורבת או נפרדת (עבור פקדי) על גבי תלושי כיסוי סטרילי.
- אפשר לשחזר את התאים למשך 12 שעות.
2. תא Fusion
- הסר מדיה תרבות מן התאים ולשטוף פעמיים עם PBS.
- בשלב זה, מומלץ לטפל בתאים עם cycloheximide (100 מיקרוגרם / מ"ל) לעכב את סינתזת החלבון. אפשר התאים כדי לדגור על 2 שעות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
- נתיך תאים על ידי חשיפת אותם בתמיסה של 50% פוליאתילן גליקול 1000 (PEG 1000) בסרום ללא DMEM עבור 125 שניות בטמפרטורת החדר.
- שטפו תאים עם PBS להסיר את הפתרון 1000 PEG, ולהוסיף 2 מ"ל חימם טרי התקשורת equilibrated.
- אפשר תאים כדי לדגור במשך 18 - 24 שעות.
Fluorescence מיקרוסקופית
- הסר את המדיה והתרבות, לשטוף את התאים פעמיים PBS.
- תקן תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) היטב כל אחד. להתסיס בעדינות במשך 15 דקות.
- לשטוף את התאים קבוע פעמיים PBS.
- הסר בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת, הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת הרכבה בינונית (90% גליצרול, 100mm טריס pH 7.5, DABCO 2% (1,4-diazabicoyclo אוקטן) DAPI המכיל (4 ',6-diamidino-2-phenylindole).
- הסר בינוני הרכבה עודף משקופיות, ואת החותם שיתוףver מחליק עם לק.
- דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal או epifluorescence.
3. נציג תוצאות
תרשים 2 מציג דוגמה heterokaryon הניסוי באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים סרטן ריאות מסוג תאים תאים. החלבון של עניין בניסוי הזה (אנמיה עוף Virus-VP3) מציג לוקליזציה cytoplasmic בעיקר סוגי תאים ראשוניים לוקליזציה גרעיני סוגי תאים טרנספורמציה כמו דמיינו ידי מיקרוסקופיה epifluorescence. החלבון מבוטא היתוך כדי או GFP (pEGFP-N1 וקטור, Clontech) ב fibroblasts העורלה הראשי (קרן היסוד) או dsRed (dsRed-N1 וקטור, Clontech) ב H1299 תאים. דגימות בקרת מעורבים עצמית fusions (שתי שורות למעלה) להציג תאים multinucleated ללא שינוי היציב דפוסי לוקליזציה. שינויים כאלה שעלולות להתרחש עקב רגישות לתנאי היתוך או היווצרות של syncitia. Fusions Heterokaryon (השורה התחתונה) להפגין כניסה הגרעיני של חלבון ה-GFP-התמזגו תאים שמקורם הראשוני colocalization עם חלבון dsRed-התמזגו בתגובה הקדמה של חומר תא שינה. הדוגמה המוצגת היא שילוב heterokaryon נדיר יחסית הנובעת רק שני תאים, אחד מכל סוג, כפי שמודגם על ידי נוכחות של שני אותות fluoroprotein. בנוסף לגילוי סוגים אלה של מעברים לוקליזציה, פעילות הלוך ושוב nucleocytoplasmic ניתן לאתר בקלות על ידי נוכחות של fluorophore יחיד גרעינים שניהם. זה סוג של נחישות ברורה כאשר בוחנים 01:01 fusions התא תלוי עיכוב של התרגום.
באיור 1. תרשים זרימה של השיטה heterokaryon באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים קרצינומה של תאים סלולריים. הגן של עניין הוא משובטים כדי לייצר היתוך מסגרת אחת של שני גנים חלבון פלואורסצנטי. קווים סלולריים הם אז transfected transiently עם לבנות או ואיפשר להתאושש. היווצרות Heterokaryon הוא המושרה על ידי טיפול קצר עם פוליאתילן גליקול (PEG) ואחריו דגירה נוסף. לבסוף, לוקליזציה המשנה הסלולר של החלבון של עניין הוא ציין באמצעות צורות שונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
איור 2. סחר Nucleocytoplasmic ו הלוך ושוב פעילות של חלבון אנמיה עוף וירוס VP3 דמיינו ידי היתוך heterokaryon. שורה עליונה: תמונות נציג עצמית התמזגו H1299 תאים להביע dsRed-VP3 שורה התיכון:.. תמונות epifluorescence נציג העיקרי תאים פיברובלסטים העורלה (קרן היסוד) להביע את ה-GFP-VP3 לאחר היתוך PEG שורה תחתונה: פיוז'ן Heterokaryon של קרן היסוד ו H1299 תאים. צהוב עולה colocalization-GFP אותות dsRed. תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי AF6000E לייקה לייקה ותוכנות הדמיה.
Discussion
פרוטוקול heterokaryon המובא כאן מספק שיטה יעילה לפרש בקלות עבור אפיון של התנהגות מסוג מסוים לוקליזציה התא וכן פעילות nucleocytoplasmic הלוך ושוב. שיטה זו מנצלת את הרגישות של ניתוח הקרינה, כמו גם את היכולת תאים התמונה לחיות ולבצע מחקרים של הדינמיקה חלבון. הטכניקה היא מותאמת בקלות הרבה סוגי תאים שונים, והוא מקובל גם הדמיה תא חי וקבוע. לדוגמה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך יכול לשמש הדמיה לחיות זמן לשגות לכידת וידאו. לעומת זאת, התאים רכוב ניתן להשתמש במיקרוסקופ או epifluorescence לקביעת מצב יציב לגרסאות המגוירות או הדמיה confocal מפורטת יותר של לגרסאות המגוירות בדידים. יתר על כן, טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), או הפסד הקרינה photobleaching (FLIP) יכול לשמש בקביעת קינטיקה לוקליזציה 1. שילוב של fluorophores חלופי בפרוטוקול תאפשר אינטראקציה ניסויים כגון חלבון פלואורסצנטי תהודה העברת אנרגיה (סריג), שתבוצע בקונצרט 2. מעכבי שונים של סחר בבני הסלולר כגון B leptomycin או דומיננטי שלילי רן בונה GTPase ניתן להשתמש כדי להקים את התלות ביבוא מסוים או מסלולים יצוא 5,6,9.
- בניסויים מסוימים מעורבים בפעילות הלוך ושוב, יש להקפיד כדי למנוע תופעות לוקליזציה בשל סינתזה של חלבונים חדשים. במקרים אלה, מעכבי תרגום או נקודות זמן מוגבל חייב לשמש. עם זאת, הממצאים בשל עיכוב translational להישאר אפשרות. Fusions תא המכיל אחד מכל סוג התא המבוקש ביותר לפרשנות ברורה של הלוך ושוב והתנהגות לוקליזציה. אופטימיזציה של מספר תאים התנאים היתוך (תזמון וריכוז) עשוי להיות נחוץ כדי לקדם אירועים כאלה נוחים 01:01 היתוך.
- חשוב לציין כי אופטימיזציה של צעדים מסוימים בפרוטוקול יהיה צורך בהתאם לסוגי תאים מסוים בשימוש. היבטים בהליך ניסיוני כגון איחוי יעילות, יעילות transfection, ואת הכדאיות לאחר המיזוג עשוי להשתנות במידה רבה בין סוגי תאים. בפרט, סוגי התאים העיקריים יכול להיות מאתגר לנהל בשל התנאים תרבות מורכבת transfection יעילות נמוכה. שימוש בטכנולוגיות כגון מכשיר Lonza Nucleofector יכול לאפשר עיבוד מהיר של התאים, כמו גם יעילות transfection עלה באופן דרמטי. בנוסף, שיטות electroporation לאפשר העברה קלה של תאים השעיה אל השלבים הבאים היתוך.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות הפוליטכני וורצ'סטר מכון המחלקה לכימיה וביוכימיה למימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
