Summary
細胞タイプ特異的タンパク質の局在化の特性評価と核細胞質間輸送のための柔軟かつ効率的な方法が記載されている。このヘテロカリオンのアプローチは、細胞融合後の画像の蛋白質のローカリゼーションへの蛍光標識融合タンパク質を使用しています。プロトコルは、定常状態の局在やライブセルイメージングに基づいて、より動的な決定に適している。
Abstract
タンパク質のかなりの数は、細胞内輸送やシャトルnucleocytolasmicによって規制されている。これらのタンパク質は、核のインポート/ RNAとタンパク質の輸出、転写調節、およびアポトーシスを含む細胞機能の多様な配列を表示します。興味深いことに、細胞分裂、分化および変換を含む、主要な携帯電話再編は、多くの場合、3,4,8,10などの活動を含む。これらのタンパク質と、それぞれの調節機構の詳細な研究は、これらの局在の変化のための刺激は、とらえどころのないことができるよう挑戦し、そして自分自身が非常にダイナミックで追跡することが困難な場合も動作することができます。携帯電話発癌を対象とした研究は、例えば、理解の経路と6,7,11,12正常な初代培養細胞や形質転換細胞間で異なるタンパク質の活動の恩恵を受け続けることでしょう。として多くのタンパク質は、方法が効率的にこれらのタンパク質と彼らは薬剤が標的とするため発癌とのオープン新たな分野への理解を向上させるために立って参加する経路を特徴づけるために、変換中または変換の結果として局在変化を示す。
ここでは、タンパク質輸送の解析方法を提示し、プライマリおよび形質転換哺乳動物の細胞間のアクティビティを往復。このメソッドは、定常状態または動的なタンパク質の局在を検出するために使用できる柔軟なプロトコルを提供するために、蛍光顕微鏡によるヘテロカリオンの融合の生成を兼ね備えています。図1に示すように、2つの別個の細胞型は、一時的に目的の遺伝子に接続されているfluoroproteinの遺伝子を有するプラスミド構築物でトランスフェクトされています。発現後、細胞をポリエチレングリコールを用いて融合させ、及びタンパク質の局在は、その後の様々な方法を用いて画像化することができます。ここで紹介するプロトコールは、特別なテクニックが追加される可能性があるために基本的なアプローチです。
Protocol
1。細胞株のトランスフェクション
トランスフェクションの方法1
（増加の主細胞のトランスフェクション効率のためのロンザのNucleofection）
- 細胞は、最近の経過とトランスフェクションの前に、対数増殖期にである必要があります。 phophateで細胞を洗浄するトリプシン処理により生理食塩水（PBS）と収穫のセルをバッファ。
- 5分間1500 × gで遠心分離により細胞を収集する。
- 6ウェルプレートに滅菌カバースリップを追加。カバースリップは、強化された細胞接着のために被覆されてもよい。場所1.5培地の添加（この場合はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS））各ウェルに、インキュベーター内のメディアを平衡。
- （PBS）リン酸緩衝生理食塩水の最小限の量でトリプシン処理し、再懸して細胞を収集する。
- 細胞をカウントし、サンプルあたり〜5 × 10 5細胞を提供するために再懸濁の正しい量を遠心してください。
- サンプルあたり100μl室温のNucleofectorソリューションで慎重に細胞を再懸濁します。
- 5μgのプラスミドDNAを細胞懸濁液100μLを組み合わせると、気泡を含まないように注意しながらNucleofectorキュベットにサンプルを移す。
- 適切なNucleofectorプログラムを選択し（これは最低限の死亡率との最適なトランスフェクション効率を確立する前のテストが必要な場合があります）。
- Nucleofectorキュベットホルダに細胞/ DNA懸濁液を含むキュベットを挿入し、選択したプログラムを開始。
- 完了すると、キュベットを取り出し、（6 - ウェルプレートから撮影）に予め平衡化培地の〜500μLを加える。
- すぐにウェルあたり1.5mlの最終容量で6ウェルプレートに試料を移す。細胞はコントロールのために、混合集団または個別にどちらに播種してください。
トランスフェクションの方法2
（細胞株に対してキアゲンEffecteneトランスフェクション）
- 最初の200μLECのバッファへの各プラスミドDNA試料の0.8μgを添加することによりキアゲンEffectene試薬を用いてトランスフェクション複合体を準備します。
- 各サンプルに6.4μLエンハンサーの試薬を追加、チューブをフリックすることで簡単にミックス、そして室温で2分間インキュベートする。
- チューブをフリックすることにより、各サンプル、ミックスに20μLEffectene試薬を追加し、室温で15分間反応させます。
- このインキュベーションの間、トランスフェクションのために関心のある2つの細胞株を準備する。最近継代細胞（<80％コンフルエント）リン酸で一度洗浄は生理食塩水（PBS）を。バック1.5mLの新鮮な暖めたと平衡化した増殖培地（ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）この場合、10％ウシ胎児血清（FBS））を追加します。
- トランスフェクション複合体は、15分間インキュベートした後、各サンプルにメディアを1.2 mLを転送する。ピペッティング、そしてすぐに6 - ウェルプレートの二つのウェルの各々に複合体の〜700μLを転送して混合。滴下を追加し、プレートを旋回して静かに混和。細胞は少なくとも3時間トランスフェクションすることができます（セルのタイプによって異なる場合があります）。
- 新しい6ウェルプレートに滅菌カバースリップを追加。カバースリップは、強化された細胞接着のために被覆されてもよい。
- 細胞はトランスフェクションした後、各ウェルに約100μLトリプシン溶液を加える簡単に完全にコートの各ウェルをするためにプレートを攪拌し、そして即座にトリプシンをオフに吸引し、PBSで細胞を2回洗浄し、最小限のtrysinizationにより細胞を収穫。細胞が解除したら、1.5 mLの新鮮な培地を加える。
- この時点で、細胞を滅菌カバーグラスの上に混在するか、別の集団（コントロール用）のいずれかでプレーティングする必要があります。
- 細胞は12時間で回復することができます。
2。細胞融合
- 細胞から培地を取り出して、PBSで2回洗浄する。
- この時点で、それはタンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド（100μg/ mL）を持つ細胞を処置することをお勧めします。細胞は2時間インキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄することができます。
- 室温で125秒のために無血清DMEMに50％ポリエチレングリコール1000（PEG 1000）のソリューションに公開することにより細胞を融合させる。
- PEG 1000ソリューションを削除し、そして2mLの新鮮暖めと平衡メディアを追加するには、PBSで細胞を洗浄する。
- 24時間 - 細胞が18のためにインキュベートすることができます。
蛍光顕微鏡
- 文化メディアを取り出し、そしてPBSで細胞を2回洗浄する。
- 各ウェルに4％パラホルムアルデヒド溶液（PBS中）1 mLを加えることによって細胞を固定する。ゆっくりと15分間振とうする。
- PBSで2回固定された細胞を洗う。
- 慎重にプレートからカバースリップを削除する、余分なPBSをオフに放出する。に顕微鏡封入剤の一滴（90％グリセロール、100mMのトリスpH7.5、2％DABCO（1,4 - diazabicoyclo -オクタン）を含むDAPI（4',6 -ジアミジノ-2 - フェニル）を搭載したスライド。反転
- スライド上の過剰なマウンティングメディウムを外し、シールCOverは、マニキュアでスリップ。
- 共焦点または落射蛍光顕微鏡を介して細胞を視覚化する。
3。代表的な結果
図2は、一次線維芽細胞およびH1299非小細胞肺癌細胞を用いて例のヘテロカリオンの実験を示しています。この実験の目的のタンパク質（チキン貧血ウイルス- VP3は）落射蛍光顕微鏡により可視化として、形質転換細胞の種類の一次細胞型および核局在化に主に細胞質局在が表示されます。タンパク質は、H1299細胞における主要な包皮繊維芽細胞（PFF）またはDsRedのGFPのどちらかへの融合（pEGFPを- N1ベクターを、Clontech社）（DsRedを- N1ベクターを、Clontech社）として表されます。自己融合を含むコントロールサンプル（上の2行）は、定常状態の局在パターンの変化なしで多核細胞が表示されます。このような変更は、特に核融合の条件またはsyncitiaの形成に感受性のために発生する可能性があります。ヘテロカリオンの融合（一番下の行）は、GFP融合主細胞由来の形質転換細胞の材料の導入に応じて、DsRedを融合蛋白質と蛋白質と共局在の核エントリを示しています。示した例は、両方fluoroprotein信号の存在によって示される2つだけのセル、各タイプの1つ、に起因する比較的まれなヘテロカリオンの融合です。局在遷移のこれらのタイプの検出に加えて、核 - 細胞質シャトル活動は簡単に両方の核内の単一の蛍光物質の存在によって検出することができます。午前1時01細胞融合を調べて、翻訳の抑制に依存するであろうときに決定のこのタイプは明らかである。
図1。主な線維芽細胞とH1299の非小細胞癌細胞を用いたヘテロカリオンの方法のフローチャート。関心の遺伝子は、二つの蛍光タンパク質遺伝子のいずれかにインフレーム融合を生成するために複製されます。細胞株は、一過性のどちらかコンストラクトをトランスフェクトし、回復するために許可されています。ヘテロカリオンの形成は、さらにインキュベートしたポリエチレングリコール（PEG）による簡単な処理により誘導される。最後に、目的のタンパク質のサブ細胞内局在を蛍光顕微鏡の様々な形態を用いて観察される。
図2。核細胞質人身売買とチキンの貧血ウイルスVP3タンパク質の活性を往復には、ヘテロカリオンの融合により視覚化した。一番上の行：DsRedタンパク質- VP3を発現している自己融合H1299細胞の代表画像中段：。。PEG融合後にGFP - VP3を発現している主要な包皮線維芽細胞（PFF）の代表落射蛍光画像下段：PFFとH1299細胞のヘテロカリオンの融合。黄色は、GFPとDsRedの信号の共局在を示している。細胞は、ライカAF6000E蛍光顕微鏡とライカのイメージングソフトウェアを使用して画像化した。
Discussion
ヘテロカリオンのプロトコルは、細胞型特異的局在の挙動だけでなく、核 - 細胞質シャトル活動の特性評価のための効率的かつ容易に解釈する方法を提供するここに紹介。このメソッドは、蛍光分析の感度だけでなく、画像の生きている細胞の能力を活用し、タンパク質のダイナミクスの研究を行う。技術は簡単に多くの異なる細胞タイプに適応し、ライブや固定細胞のイメージングの両方の影響を受けやすいです。例えば、倒立蛍光顕微鏡は、ライブイメージングやタイムラプスビデオキャプチャに使用することができます。これとは対照的に、マウントされている細胞は、定常状態の局在の決定または離散ローカリゼーションの詳細な共焦点イメージングのための落射蛍光顕微鏡のいずれかで使用することができます。また、このような光退色後の蛍光回復（FRAP）、または退色で蛍光損失（FLIP）などの技法は、ローカリゼーション速度1の判定に使用することができます。プロトコルの代替蛍光色素の取り込みは、コンサート2で実施される蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）などのタンパク質相互作用の実験のためにできるようになります。このようなレプトマイシンBまたはドミナントネガティブとして細胞輸送の様々な阻害剤は、GTPアーゼの構造が特定のインポートまたはエクスポートの経路5,6,9への依存を確立するために使用することができる蘭。
- 往復の活性が関与する特定の実験では、ケアが新たなタンパク質の合成に起因する局在の影響を避けるようにしなければならない。これらのケースでは、翻訳の阻害剤または期間限定ポイントを使用する必要があります。しかし、翻訳阻害に起因するアーティファクトは、可能性は残っている。各セルのタイプのいずれかを含む細胞融合は、ほとんどの往復とローカライゼーションの行動の明確な解釈のために望まれている。細胞数と融合条件（タイミングや濃度）の最適化は、良好な1:1の融合イベントを促進するために必要な場合があります。
- プロトコルの特定のステップの最適化が使用される特定の細胞タイプに応じて必要となることに注意することは重要です。このような融合効率、トランスフェクション効率、および融合後の生存率などの実験手順の側面は、細胞型との間で大きく異なることがあります。特に、主要な細胞型は、複雑な培養条件と低いトランスフェクション効率のために管理するために挑戦することができます。このようなロンザNucleofector装置のような技術の使用は、細胞だけでなく、劇的に増加したトランスフェクション効率の迅速な処理を可能にすることができる。さらに、エレクトロポレーション法は続く核融合のステップへの懸濁液中の細胞を簡単に転送が可能になります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、資金調達のために化学と生化学のウースター工科大学部に感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
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