Summary
였죠 셀 유형 - 특정 단백질 현지화 및 nucleocytoplasmic의 특성화를위한 유연하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 heterokaryon 접근은 세포 융합 후 이미지 단백질 localizations에 찬란 - 표시 융합 단백질을 사용합니다. 프로토콜은 정상 상태 localizations 또는 라이브 셀 이미징을 기반으로보다 역동적인 결정 의무가 있습니다.
Abstract
단백질의 상당수는 subcellular 매매 또는 였죠 nucleocytolasmic에 의해 규제됩니다. 이러한 단백질은 핵 수입 / RNA와 단백질의 수출, transcriptional 규제 및 apoptosis를 포함한 세포 기능의 다양한 배열을 표시합니다. 흥미롭게도, 세포 분열, 분화 및 변형 등 주요 휴대폰 reorganizations는 종종 그러한 활동을 할 3,4,8,10를 포함. 이러한 단백질과 해당 규제 메커니즘의 상세한 연구는 이러한 현지화 변경 기묘한 수에 대한 자극하고, 스스로 추적하는 매우 역동적이고 어려울 수있는 움직임으로 도전하실 수 있습니다. 세포 oncogenesis과 관련된 연구는 예를 들어, 이해의 경로와 정상 세포 및 기본 세포 변형 6,7,11,12 다를 단백질 활동의 혜택을 계속합니다. 많은 단백질은 변경 변형 동안이나 변환의 결과로 현지화 효율적으로이 단백질을 특성화 방법과 그들이 마약 타겟팅 oncogenesis 및 오픈 새로운 영역에 대한 이해를 향상시키기 위해 서 참여하는 경로를 보여으로.
여기 단백질 인신 매매의 분석을위한 방법을 제시하고 기본 및 변형 포유 동물 세포 사이의 활동을 였죠. 이 방법은 정상 상태 또는 동적 단백질 localizations를 감지하는 데 사용할 수있는 유연한 프로토콜을 제공하기 위해 형광 현미경과 heterokaryon의 fusions의 생성을 결합한 제품입니다. 그림 1과 같이, 두 개의 세포 종류 transiently 관심의 유전자에 부착된 fluoroprotein의 유전자를 플라스미드 베어링 구성과 transfected 있습니다. 표현 후, 전지는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 융합하고, 단백질 localizations 그런 다음 다양한 방법을 사용하여 몇 군데있을 수 있습니다. 여기에 제시 프로토콜은 전문 기술이 추가될 수도 있습니다에 대한 근본적인 접근 방식이다.
Protocol
1. 세포 라인의 Transfection
Transfection 방법 1
(증가 기본 세포 transfection 효율을위한 Lonza의 Nucleofection)
- 세포는 최근 통과 사전 transfection 로그 위상 성장해야합니다. phophate의 세포를 세척하는 것은 trypsinization하여 생리 (PBS)와 수확 세포를 버퍼.
- 5 분 1,500 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
- 6 잘 플레이트에 살균 커버 전표를 추가합니다. 커버 풀렸는데이 향상 세포 접착을위한 코팅 수 있습니다. 플레이스 1.5 문화 미디어의 ML (이 경우에는 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)) 각 우물에와 인큐베이터에있는 미디어를 평형.
- 인산염의 최소 볼륨에서 trypsinization와 resuspend하여 세포를 수확하는 것은 (PBS) 살린 버퍼.
- 세포를 카운트하고 샘플 당 ~ 5x10 5 세포를 제공하기 위해 resuspension의 정확한 금액을 원심 분리기.
- 샘플 당 100 μL 실내 온도 Nucleofector 솔루션에 신중하게 세포를 Resuspend.
- 5 μg 플라스미드 DNA와 세포 현탁액을 100 μL을 결합하고 기포를 포함하지 않도록주의되는 Nucleofector 쿠베트에 샘플을 전송합니다.
- 해당 Nucleofector 프로그램 (이것은 최소한의 사망률과 최적의 transfection 효율을 수립 이전에 테스트를 요구할 수 있습니다)를 선택합니다.
- Nucleofector 쿠베트 홀더에 세포 / DNA 정지를 포함하는 쿠베트를 삽입하고 선택한 프로그램을 시작합니다.
- 완료되면, 쿠베트을 제거하고 (6 - 음 판에서 가져온)로 사전 equilibrated 문화 미디어의 ~ 500 μL를 추가합니다.
- 즉시 잘 당 1.5 ML의 최종 볼륨 6 잘 플레이트에 샘플을 전송합니다. 전지는 컨트롤, 혼합 또는 별도로 인구 중으로 도금되어야합니다.
Transfection의 방법 2
(세포 라인에 대한 Qiagen Effectene의 transfection)
- 첫번째 200 μL EC 버퍼 각 플라스미드 DNA 샘플의 0.8 μg을 추가하여 Qiagen Effectene 시약을 사용하여 transfection의 단지를 준비합니다.
- 각 샘플에 6.4 μL 향상제 시약을 추가, 튜브를 flicking하여 간략하게 혼합하고, 실온에서 2 분 알을 품다.
- 튜브를 flicking하여 각 샘플, 혼합 20 μL Effectene 시약을 추가하고, 실온에서 15 분 동안 품어.
- 이 부화하는 동안 transfection에 대한 관심의 두 세포 라인을 준비합니다. 한번 인산염 최근 passaged 세포를 (<80 % 합류) 세척 식염수 (PBS)가 버퍼. 다시 1.5 ML 신선한 예열 및 equilibrated 성장 매체를 추가하십시오 (이 경우에는 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)).
- transfection의 단지 15 분 동안 incubated 후에는, 각 샘플 미디어 1.2 ML를 전송합니다. pipetting, 즉시 6 자 판에서 두 우물의 각 단지의 ~ 700 μL를 전송하여 섞는다. dropwise 추가하고 번호판을 소용돌이로 부드럽게하여 섞는다. 세포가 적어도 3 시간 동안 transfect 수 있도록 허용 (세포 유형과 다를 수 있습니다.)
- 새로운 6 - 잘 플레이트에 살균 커버 전표를 추가합니다. 커버 풀렸는데이 향상 세포 접착을위한 코팅 수 있습니다.
- 세포 transfected 후, 각 잘하는 약 100 μL 트립신 솔루션을 추가 간단히 완전히 코트 각각 잘 수있는 접시 agitating, 즉시 트립신을 aspirating하여 PBS로 두 번 세포를 씻어하고 최소한의 trysinization하여 세포를 수확. 세포가 해제되면, 1.5 ML 신선한 미디어를 추가할 수 있습니다.
- 이 시점에서, 세포는 멸균 커버 전표에 혼합 또는 별도의 중 인구 (컨트롤)에 도금되어야합니다.
- 세포는 12 시간 복구할 수 있습니다.
2. 세포 융합
- 세포에서 문화 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 씻는다.
- 이 시점에서, 그것은 단백질 합성을 억제하기 위해 cycloheximide (100 μg / ML)로 세포를 치료하는 것이 좋습니다. 세포 2 시간 동안 부화 후 PBS로 두 번 세포를 씻어 수 있습니다.
- 상온에서 1백25초에 대한 혈청없는 DMEM에 50% 폴리에틸렌 글리콜 1000 (PEG 1000)의 솔루션을 노출하여 퓨즈 세포.
- PEG 1000 솔루션을 제거하고 신선한 예열 및 equilibrated 미디어이 ML을 추가하는 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 24시간 - 세포가 18 품어 수 있습니다.
형광 현미경
- 문화 미디어를 제거하고, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 각각 잘 수있는 4 % paraformaldehyde 용액 (PBS)를 1 ML를 추가하여 세포를 수정. 부드럽게 15 분 동안 선동.
- 두 번 PBS에 고정 세포를 씻으십시오.
- 조심스럽게 접시에서 커버 전표를 제거, 여분의 PBS에서 심지. 현미경에 장착 매체 중 하나를 드롭 (90 % 글리세롤, 100mM 트리스 산도 7.5, 2% DABCO (1,4 - diazabicoyclo - 옥탄)이있는 DAPI (4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole)와로드 슬라이드. 반전
- 슬라이드에서 초과 장착 매체를 제거하고, 인감 공동버전은 매니큐어와 전표.
- 공촛점 또는 epifluorescence 현미경을 통해 세포를 시각화.
3. 대표 결과
그림 2는 기본 섬유아 세포 및 H1299 비 작은 세포 폐 암종 세포를 사용하는 예제 heterokaryon 실험을 보여줍니다. 본 실험에 대한 관심의 단백질 (치킨 빈혈 바이러스 - VP3)는 epifluorescence 현미경에 의해 시각으로 기본 셀 형식에 주로 세포질 현지화 및 변형 세포 유형에 핵 지방화를 표시합니다. 단백질은 H1299 세포의 기본 포피의 섬유아 세포 (PFF) 또는 dsRed에서 GFP 중 하나에 융합 (pEGFP - N1 벡터, Clontech) (dsRed - N1 벡터, Clontech)로 표시됩니다. 자기 fusions 관련된 컨트롤 샘플 (상위 2 행)은 정상 상태 로컬 라이제이션 패턴에는 변화와 multinucleated 세포를 표시합니다. 이러한 변경 사항은 별도로 융합 조건이나 syncitia의 형성에 감도로 인해 발생할 수 있습니다. Heterokaryon의 fusions (하단 행)는 GFP - 융합 기본 셀 - 파생 단백질과 변형 세포 물질의 도입에 대응 dsRed - 융합 단백질로 colocalization의 핵 항목을 보여줍니다. 표시 예제는 두 fluoroprotein 신호의 존재에 의해 입증 두 세포, 각 유형 중 하나에서 발생하는 비교적 드문 heterokaryon 융합이다. 현지화 전환 이러한 유형의 탐지뿐만 아니라, nucleocytoplasmic 였죠 활동은 쉽게 두 핵 사이에 하나의 형광단의 존재에 의해 감지가 가능하다. 1시 1분 세포 fusions을 검토하고 번역의 억제에 따라 것이다 때 결정이 유형의 분명하다.
그림 1. 기본 섬유아 세포 및 H1299 비 작은 세포 암종 세포를 사용하여 heterokaryon 방식의 플로우 차트. 관심 유전자 두 형광 단백질 유전자 중 하나의 프레임 융합을 생산하기 위해 복제됩니다. 셀 라인은 다음 transiently 중 구조로 transfected하고 복구하는 허용됩니다. Heterokaryon 형성은 더욱 부화 다음 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 간단한 치료에 의해 유발됩니다. 마지막으로, 관심의 단백질의 하위 세포 로컬 리 제이션은 형광 현미경의 다양한 형태를 사용하여 관찰합니다.
그림 2. Nucleocytoplasmic 밀매와 치킨 빈혈 바이러스 VP3 단백질의 활동을 였죠은 heterokaryon 융합에 의해 시각. 끝줄 : dsRed - VP3을 표현 자체 융합 H1299 세포의 대표 이미지 중간 행 :.. PEG 융합 후 GFP - VP3을 표현하는 기본 포피의 fibroblast 세포 (PFF) 대표 epifluorescence 이미지 아래 행 : PFF 및 H1299 세포의 Heterokaryon 융합. 노란색은 GFP와 dsRed 신호 colocalization을 나타냅니다. 전지 Leica AF6000E 형광 현미경 및 Leica 이미징 소프트웨어를 사용하여 몇 군데 있었다.
Discussion
heterokaryon 프로토콜은 세포 유형의 특정 현지화 행동뿐만 아니라 nucleocytoplasmic 였죠 활동의 특성화를위한 효율적이고 쉽게 interpretable 방법을 제공 여기를 발표했다. 이 방법은 형광 분석의 감도뿐만 아니라 기능 영상 라이브 세포와 단백질 역학 연구를 수행을 활용합니다. 기술은 쉽게 다양한 세포 유형에 적응하고 생활하고 고정 세포 이미징 모두 의무입니다. 예를 들어, 거꾸로 형광 현미경은 라이브 이미징 및 시간 저속 비디오 캡처에 사용할 수 있습니다. 반대로, 탑재 전지가 정상 상태 localizations 또는 개별 localizations의 상세한 공촛점 이미징의 결정 모두에 대해 epifluorescence 현미경에 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 photobleaching 후 형광 복구 (FRAP) 또는 photobleaching에 형광 손실 (플립)와 같은 기술은 현지화 속도론 1의 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 대체 fluorophores의 결합 콘서트 2 수행하는 형광 공명 에너지 전달 (무서워) 같은 단백질 상호 작용 실험을 허용합니다. 이러한 leptomycin의 B 또는 부정적인 지배와 같은 세포 인신 매매의 다양한 억제제는 GTPase 구성 요소가 특정 가져 오거나 내보내기 경로 5,6,9에 의존을 확립하는 데 사용할 수있는 랜.
- 활동을 였죠 관련된 특정 실험에서, 관리는 새로운 단백질의 합성에 의한 현지화 효과를 피하기 위해 이동해야합니다. 이러한 경우에는 번역 억제제 또는 제한된 시간 포인트를 사용해야합니다. 그러나, translational 억제로 인해 유물은 가능성이 남아있다. 각 세포 유형 중 하나를 포함하는 셀 fusions은 대부분 였죠 및 현지화 문제의 명확한 해석에 대해 원하는합니다. 휴대폰 번호 및 융합 조건 (타이밍 및 농도)의 최적화는 유리한 1:1 퓨전 이벤트를 홍보해야 할 수도 있습니다.
- 프로토콜의 특정 단계의 최적화를 사용하는 특정 세포 종류에 따라 필요합니다에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 융합 효율, transfection 효율, 그리고 퓨전 후 생존 능력으로 실험 절차 측면 세포 유형 간의 큰 차이가있을 수 있습니다. 특히, 기본 세포 유형은 복합 문화 조건과 낮은 transfection 효율성으로 인해 관리하기 위해 도전하실 수 있습니다. 같은 Lonza Nucleofector 장치로 기술의 사용은 세포의 신속한 처리를 위해뿐만 아니라 급격하게 증가 transfection 효율 허용할 수 있습니다. 또한, electroporation 방법은 다음과 융합의 단계를 중지 세포 쉽게 전송하실 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 자금에 대한 화학 생화학의 우스터 폴리 테크닉 연구소 부서를 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
