Summary
En flexibel och effektiv metod för karakterisering av celltyp specifika proteiner lokalisering och nucleocytoplasmic skytteltrafik beskrivs. Denna heterokaryon tillvägagångssätt använder fluorescerande-märkta fusionsproteiner till lokaliseringar bilden protein efter cellfusion. Protokollet är mottaglig för steady-state lokaliseringar eller mer dynamiskt bestämningar baserade på levande cell imaging.
Abstract
Ett stort antal proteiner regleras av subcellulära människohandel eller nucleocytolasmic skytteltrafik. Dessa proteiner visa en mångfald av cellulära funktioner inklusive kärnkraft import / export av RNA och protein, transkriptionell reglering, och apoptos. Intressant stora cellulära omorganisationer, inklusive celldelning, differentiering och transformation, innebär ofta sådan verksamhet 3,4,8,10. Den detaljerade studier av dessa proteiner och deras respektive reglerande mekanismer kan vara en utmaning som stimulans för dessa lokalisering ändringar kan vara svårfångade, och rörelserna själva kan vara ganska dynamisk och svår att spåra. Studier med cellulära onkogenes, till exempel, fortsätta att dra nytta förståelse vägar och aktiviteter protein som skiljer mellan normala primära celler och omvandlas celler 6,7,11,12. Eftersom många proteiner visa förändrade lokalisering under omvandling eller som en följd av transformation, metoder för att effektivt karaktärisera dessa proteiner och de vägar som de deltar står för att förbättra förståelsen för onkogenes och öppna nya områden för läkemedelsutveckling inriktning.
Här presenterar vi en metod för analys av protein människohandel och skytteltrafik aktivitet mellan primär och transformerade däggdjursceller. Denna metod kombinerar generationen heterokaryon fusioner med fluorescensmikroskopi att ge ett flexibelt protokoll som kan användas för att detektera steady-state eller dynamisk protein lokaliseringar. Som visas i figur 1, är två olika celltyper övergående transfererats med plasmiden konstruktioner med en fluoroprotein gen knuten till genen av intresse. Efter uttryck, är de celler som smält med polyetylenglykol och protein lokaliseringar kan sedan avbildas med en rad olika metoder. Protokollet presenteras här är ett grundläggande synsätt som specialiserade tekniker kan läggas till.
Protocol
1. Transfektion av cellinjer
Transfektion Metod 1
(Lonza Nucleofection för ökad primärcell transfektion effektivitet)
- Celler bör vara av senaste passage och i log fas tillväxt före transfektion. Tvätta cellerna i fosfatbuffert saltlösning (PBS) och celler skörd av trypsinization.
- Samla cellerna genom centrifugering vid 1500 xgi 5 minuter.
- Lägg till steriliserade täckglas till en 6-brunnar. Täckglas kan vara belagda för ökad cell adhesion. Placera 1,5 ml av kulturen medier (i detta fall Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS)) i varje brunn och balansera media i inkubatorn.
- Harvest cellerna genom trypsinization och återsuspendera i en minimal mängd av fosfat saltlösning (PBS).
- Räkna celler och centrifugera rätt mängd resuspension att ge ~ 5x10 5 celler per prov.
- Resuspendera cellerna försiktigt i 100 mikroliter rumstemperatur Nucleofector lösning per prov.
- Kombinera 100 mikroliter cellsuspension med 5 mikrogram plasmid-DNA och överföra provet till ett Nucleofector Cuvette försiktigt så att inte inkludera luftbubblor.
- Välj rätt Nucleofector Program (detta kan kräva tidigare prover för att fastställa optimal transfektion effektivitet med minimal dödlighet).
- Sätt i kyvetten som innehåller cellen / DNA suspensionen i Nucleofector kuvettsläden och börja det valda programmet.
- Efter avslutad, avlägsna kyvetten och lägga ~ 500 mikroliter av pre-jämvikt odlingsmedia till det (hämtade från 6-brunnar).
- Överför omedelbart provet till 6-brunnar med slutlig volym på 1,5 ml per brunn. Celler bör vara klädd i antingen blandade populationer eller separat, för kontroller.
Transfektion Metod 2
(Qiagen Effectene transfektion för cell-linjer)
- Förbered transfektion komplex med Qiagen Effectene Reagent genom att först lägga 0,8 mikrogram av varje plasmid DNA-prov till 200 mikroliter EG buffert.
- Tillsätt 6,4 mikroliter förstärkare reagens till varje prov, blanda kort genom att ställa röret, och inkubera i 2 minuter i rumstemperatur.
- Tillsätt 20 mikroliter Effectene reagens till varje prov, blanda genom att ställa röret, och inkubera i 15 minuter i rumstemperatur.
- Under denna inkubation, förbereda två cellinjer av intresse för transfektion. Tvätta nyligen passerats celler (<80% confluence) en gång i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lägg tillbaka 1,5 ml färsk varm och jämvikt tillväxt medium (i detta fall Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS)).
- När transfektion komplex inkuberas i 15 minuter, överföring 1,2 ml media till varje prov. Blanda genom att pipettera, och omedelbart överföra ~ 700 mikroliter av komplex för att var och en av två brunnar i 6-brunnar. Tillsätt droppvis och blanda genom att försiktigt genom att snurra plattan. Låt cellerna transfektera i minst 3 timmar (kan variera med celltyp).
- Lägg till steriliserade täckglas till en ny 6-brunnar. Täckglas kan vara belagda för ökad cell adhesion.
- När cellerna har transfekterade, tvätta cellerna två gånger med PBS och skörda celler genom minimala trysinization genom att ca 100 mikroliter trypsin lösning till varje brunn, kort omskakning av plattan helt päls varje brunn, och omedelbart aspirerande bort trypsin. När cellerna har lyft, tillsätt 1,5 ml färsk medier.
- Vid det här laget bör celler klädd i antingen blandade eller separata populationer (för kontroller) på den sterila täckglas.
- Låt cellerna att återhämta sig under 12 timmar.
2. Cellfusion
- Ta bort odlingsmedia från cellerna och tvätta två gånger med PBS.
- Vid denna punkt, är det rekommenderat att behandla celler med cykloheximid (100 mikrogram / ml) för att hämma proteinsyntesen. Låt cellerna att inkubera i 2 timmar och sedan tvätta cellerna två gånger med PBS.
- Säkring celler genom att utsätta dem för en lösning av 50% polyetylenglykol 1000 (PEG 1000) i serum-fri DMEM för 125 sekunder vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med PBS för att ta bort PEG 1000-lösning, och tillsätt 2 ml färsk varm och jämvikt medier.
- Låt cellerna att inkubera i 18 - 24 timmar.
Fluorescensmikroskopi
- Ta bort kulturmedia och tvätta cellerna två gånger i PBS.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 1 mL av en 4% paraformaldehyd lösning (i PBS) i varje brunn. Skaka försiktigt i 15 minuter.
- Tvätta fasta celler två gånger i PBS.
- Ta försiktigt bort locket glider från plattan, veken av överflödigt PBS. Invertera på objektglas laddad med en droppe monteringsmedium (90% glycerol, 100mm Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-oktan) som innehåller DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole).
- Ta bort överflödigt monteringsmedium från bilder och sigill cover glider med nagellack.
- Visualisera cellerna via konfokala eller epifluorescence mikroskopi.
3. Representativa resultat
Figur 2 visar ett experiment exempel heterokaryon med primär fibroblaster och H1299 icke-småcellig lungcancer celler carcinoma. Proteinet av intresse i detta experiment (Kyckling Anemi Virus-VP3) visar främst cytoplasmiska lokalisering i primära celltyper och nukleära lokalisering i förvandlas celltyper som visualiseras genom epifluorescence mikroskopi. Proteinet uttrycks som en fusion antingen GFP (pEGFP-N1 vektor, Clontech) i obearbetad förhuden fibroblaster (PFF) eller dsRed (dsRed-N1 vektor, Clontech) i H1299 celler. Kontrollprover med själv-fusioner (de två översta raderna) display flerkärniga celler med någon förändring i steady-state lokalisering mönster. Sådana förändringar kan annars inträffa på grund av känslighet för fusion villkor eller bildandet av syncitia. Heterokaryon fusioner (nedersta raden) visar nukleära inmatning av GFP-smält primär-cellerna protein och colocalization med dsRed-smält protein som svar på införandet av omvandlas cellen material. Exemplet som visas är en relativt sällsynt heterokaryon fusion följd av endast två celler, en av varje typ, vilket framgår av närvaro av både fluoroprotein signaler. Förutom att upptäcka dessa typer av lokalisering övergångar kan nucleocytoplasmic skytteltrafik aktivitet lätt upptäckas genom närvaron av en enda fluoroforen i båda kärnor. Denna typ av beslutsamhet är tydlig när man undersöker 01:01 cell fusioner och bero på hämning av översättning.
Figur 1. Flödesschema av heterokaryon metod med primär fibroblaster och H1299 icke-småcellig celler carcinoma. Genen av intresse är klonade för att producera en i-frame fusion till en av två fluorescerande proteinet gener. Cellinjer sedan övergående transfererats med antingen konstruera och får möjlighet att återhämta sig. Heterokaryon bildningen är orsakad av kortvarig behandling med polyetylenglykol (PEG) följt av ytterligare inkubation. Slutligen är den sub-cellulära lokalisering av proteinet av intresse observerats med hjälp av olika former av fluorescerande mikroskopi.
Figur 2. Nucleocytoplasmic människohandel och skytteltrafik aktivitet Kyckling anemi Virus VP3 protein visualiseras genom heterokaryon fusion. Övre raden: Bilderna är av själv-smält H1299 celler som uttrycker dsRed-VP3 Mellersta raden:.. Representant epifluorescence bilder av galvaniska element förhuden fibroblast (PFF) som uttrycker GFP-VP3 efter PEG fusion Nedre raden: Heterokaryon fusion av PFF och H1299 celler. Gult anger colocalization av GFP och dsRed signaler. Celler avbildas med en Leica AF6000E fluorescensmikroskop och Leica bildprogram.
Discussion
Den heterokaryon protokollet presenteras här ger en effektiv och lätt tolkningsbara metod för karakterisering av cell typspecifika lokalisering beteende samt nucleocytoplasmic skytteltrafik aktivitet. Denna metod utnyttjar känsligheten av fluorescens analys samt förmåga att bilden levande celler och utföra studier av protein dynamik. Tekniken är lätt anpassas för många olika celltyper och är mottaglig för både live och fasta cell imaging. Till exempel kan inverteras fluorescensmikroskopi användas för live-avbildning och tid förfaller video. Däremot kan monteras celler kan användas i antingen epifluorescence mikroskopi för bestämning av steady-state lokaliseringar eller mer detaljerad konfokal avbildning av diskreta lokaliseringar. Dessutom kan tekniker såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) eller fluorescens förlust i fotoblekning (Flip) användas vid fastställandet av lokalisering kinetik 1. Införandet av alternativa fluoroforer i protokollet skulle möjliggöra experiment proteininteraktioner som fluorescens resonans energi överföring (FRET) skall genomföras i samråd 2. Olika hämmare av cellulära handel såsom leptomycin B eller dominerande negativa Ran GTPase konstruktioner kan användas för att fastställa beroende av viss import eller vägar export 5,6,9.
- I vissa försök med skytteltrafik verksamhet måste vara försiktig för att undvika lokalisering effekter på grund av syntes av nya proteiner. I dessa fall måste översättning hämmare eller avgränsade ställen tiden användas. Men artefakter på grund av translationell hämning kvarstå som en möjlighet. Cell fusioner innehåller en av varje celltyp är mest önskade en tydlig tolkning av skytteltrafik och lokalisering beteende. Optimering av mobilnummer och villkor fusion (timing och koncentration) kan vara nödvändigt att främja en sådan gynnsam 01:01 fusion händelser.
- Det är viktigt att notera att optimering av vissa steg i protokollet kommer att bli nödvändigt beroende på den särskilda används celltyper. Aspekter i den experimentella förfarande såsom fusion effektivitet, transfektion effektivitet och livskraft efter fusion kan variera kraftigt mellan celltyper. I synnerhet kan primära celltyper vara en utmaning att hantera på grund av komplex kultur och låga effektivitet transfektion. Användningen av teknik som Lonza Nucleofector enheten kan möjliggöra en snabb handläggning av celler samt dramatiskt ökad effektivitet transfektion. Dessutom elektroporation metoder möjliggör enkel överföring av celler i suspension till fusion stegen som följer.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Worcester Polytechnic Institute Institutionen för kemi och biokemi för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
