Hele Cell Opnamen van Brain van Adult Drosophila

Summary

Deze video toont de procedure voor het isoleren van hele hersenen van volwassen Drosophila als voorbereiding voor het opnemen van enkele neuronen met behulp van standaard hele cel-technologie. Het bevat beelden van GFP gelabelde cellen en neuronen bekeken tijdens het opnemen.

Abstract

In deze video, tonen we de procedure voor het isoleren van hele hersenen van volwassen Drosophila als voorbereiding voor het opnemen van enkele neuronen. We beginnen met het beschrijven van de oplossing ontleden en inname van de volwassen vrouwtjes in onze studies. De procedure voor het verwijderen van de hele hersenen intact, met inbegrip van zowel optische kwabben, wordt geïllustreerd. Dissectie van de bovenliggende trachea wordt ook getoond. De geïsoleerde brein is niet alleen klein, maar heeft speciale zorg in de behandeling in dit stadium om schade aan de neuronen te voorkomen, waarvan vele zich dicht bij de buitenkant van het weefsel. We laten zien hoe een speciale houder ontwikkeld wordt gebruikt om de hersenen in de opname kamer te stabiliseren. Een standaard elektrofysiologie opgezet wordt gebruikt voor het opnemen van enkele neuronen of paren van neuronen. Een TL-beeld, gezien door de opname microscoop, uit een GAL4 lijn rijden GFP-expressie (GH146) illustreert hoe projectie neuronen (PNS) worden geïdentificeerd in de live hersenen. Een hoog vermogen Nomarski beeld toont een weergave van een enkel neuron die wordt gericht op hele cel opnemen. Wanneer de hersenen met succes is verwijderd zonder schade, de meerderheid van de neuronen zijn spontaan actief, vuren actiepotentialen en / of de uitstalling van spontane synaptische input. Deze in situ voorbereiding, waarin whole cell-opname van de geïdentificeerde neuronen in de hele hersenen kunnen worden gecombineerd met genetische en farmacologische manipulaties, is een bruikbaar model voor het verkennen van cellulaire fysiologie en plasticiteit in het volwassen CZS.

Protocol

I. dissectie van hersenen van volwassen vliegen

1. Plaats een kleine druppel (~ 100 ul) van het ontleden van oplossing in het midden van een 35 mm petrischaal.
2. Catch volwassen vrouwelijke gebruik aspirator. Onder dissectiemicroscoop, gebruik maken van twee injectienaalden met de vlieg onthoofden.
3. Plaats het hoofd in een kleine daling van het ontleden van zout (met papaïne toegevoegd) in een petrischaal.
4. Positie van hoofd met de slurf naar bodem van de schaal.
5. Houd de cuticula met betrekking tot de linker samengestelde oog met naald 1. Maak een diagonale snit die van het dorsale zich uitstrekt tot de ventrale oppervlak met naald 2, net mediaal om de naald 1.
6. Houd de monddelen met naald 1 en 2 gebruik van naald tot een horizontale snit die uit het ventrale oppervlak van het linker oog strekt zich uit tot het rechter oog, op het niveau van de basis van proboscis te maken.
7. Houd de cuticula met betrekking tot de juiste compound oog met naald 1. Maak een diagonale snit die van het dorsale zich uitstrekt tot de ventrale oppervlak met naald 2, net mediale van de naald 1.
8. Draai het hoofd, zodat de rostrale zijde is op het petrischaaltje oppervlak. Breng de naald 1 tussen de rostrale cuticula en de hersenen, en het gebruik van naald 2 om hetzelfde pad volgen als de eerste naald. In het ideale geval zal de capsule worden afpellen van de hersenen met zowel optische kwabben bevestigd, omdat deze van belang zijn bij het stabiliseren van de hersenen voor de opname.
9. De luchtpijp, luchtzakken, en andere bindweefsels worden zorgvuldig verwijderd met behulp van twee fijne punt tang.
10. Hele dissectie moet 3-10 minuten

II. Montage van de CNS

1. De hersenen wordt overgebracht naar de opname kamer met behulp van een gele tip pipet.
2. In de opname kamer, is het brein gestabiliseerd door het plaatsen van de platina kader zodanig dat twee fijne dradenkruis contact te maken met het weefsel op de kruising tussen de optische lobben en de centrale hersengebied.
3. Elk brein is toegestaan ​​om in de opname kamer rest met continue perfusie met zuurstofrijk zoutoplossing (95% zuurstof en 5% kooldioxide) gedurende minstens 10 minuten. Perfusie van de kamer met zuurstofrijk zoutoplossing wordt voortgezet gedurende de opname periode. Voorbereiding is gevisualiseerd met behulp van een rechtop microscoop (Axioskop 2FS, Zeiss, Oberkochen, Duitsland) met een vaste podium en een 40x water immersie objectief (Achroplan, numerieke apertuur, 0.8, Zeiss) en Nomarski optica. GFP werd bekeken met een BP-505-530 fluorescentie filter.

III. Elektrofysiologie

1. Pipetten van 8-14 Mohm worden gebruikt voor de hele cel opnames
2. De huidige-klem en voltage-clamp opnames worden uitgevoerd met behulp van een lijst EPC7 of een Axopatch 200B versterker, een Digidata 1322A DA converter (Molecular Devices, Foster City, CA), een Dell Dimension 8200 computer (Dell Computer, Round Rock, TX), en pClamp 9 software (Molecular Devices).

Discussion

De geïsoleerde hele brein voorbereiding illustreren we in deze video laat de beoordeling van cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen prikkelbaarheid en synaptische transmissie in geïdentificeerde neuronen, inclusief die in de olfactorische verwerking paden, in de volwassen Drosophila hersenen (Gu en O Dowd, 2006). Deze aanpak is complementair aan van de neuronale activiteit studie in de hersenen van intacte volwassen Drosophila (Wilson et al 2004), in vrijwel dezelfde manier opnamen van neuronen in een plakje hersenen van zoogdieren zijn complementair aan opnames in wakker te gedragen zoogdieren. Er zijn twee grote voordelen van de in situ vliegen hersenen voorbereiding ten opzichte van de zoogdieren plakken. Eerst de hele vlieg hersenen past gemakkelijk in de opname kamer dus het is niet nodig om accijnzen een klein stukje weefsel van een grotere neurale circuit dat optreedt bij het maken van de hersenen van zoogdieren plakjes. Daarom is de neuronale circuits binnen de geïsoleerde Drospohila hersenen blijven grotendeels intact. Ten tweede, de cellichamen van de meeste neuronen zijn in de buurt van de hersenen oppervlak, gemakkelijk toegankelijk voor de hele cel opnemen en blijven ze functioneel actief indien continu geperfuseerd met zuurstofrijk zoutoplossing gedurende enkele uren.

Met behulp van een glazen bodem opname kamer maakt het ook mogelijk de identificatie van specifieke neuronen op basis van hun locatie en / of GFP expressie. In deze voorbereiding, opname tijdens perfusie vereist stabilisatie van de hersenen. Dit is niet compatibel met standaard procedures, met inbegrip van strategisch geplaatste gouden draad of nylon gaas, die effectief zijn voor weefsels zoals de hippocampus plakken, te wijten aan de geringe omvang van de gehele hersenen (~ 1 mm). Daarom hebben we een ontworpen houder met een platinum frame en nylon dradenkruis gepositioneerd om de hersenen contact op slechts twee locaties om schade aan de neuronen in de buurt van de hersenen oppervlak te minimaliseren. Dit stabiliseert de hersenen, met ofwel de voorste of achterste oppervlak naar boven en het tegenoverliggende oppervlak gewoon lichtjes rusten op de vloer van de opname kamer. Met behulp van dit apparaat zijn we in staat om routinematig een stabiele whole cell-opnames te behouden voor maximaal een uur, zelfs van kleine neuronen waaronder Kenyon cellen, terwijl het doen van farmacologische manipulaties die bad toepassing van specifieke geneesmiddelen nodig hebben. De houder moet ook nuttig zijn bij het veiligstellen van andere kleine weefselmonsters voor elektrofysiologische studies, zoals het ruggenmerg segmenten van neonatale knaagdieren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices