Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

Summary

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Isolierung von ganzen Gehirnen von adulten Drosophila in Vorbereitung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen mit Standard ganzen Zelle-Technologie. Es enthält Bilder von GFP-markierten Zellen und Neuronen während der Aufnahme angesehen.

Abstract

In diesem Video zeigen wir, das Verfahren zur Isolierung von ganzen Gehirnen von adulten Drosophila in Vorbereitung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen. Wir beginnen mit einer Beschreibung der Anatomie-Lösung und der Einnahme der erwachsenen Frauen in unseren Studien verwendet. Das Verfahren für das Entfernen der gesamten Gehirns intakt, sowohl Sehlappen, dargestellt. Dissection der darüberliegenden Luftröhre wird ebenfalls angezeigt. Das isolierte Gehirn ist nicht nur klein, sondern braucht besondere Pflege im Umgang mit in dieser Phase, um Schäden an den Nervenzellen zu verhindern, von denen viele in der Nähe der äußeren Oberfläche des Gewebes. Wir zeigen, wie eine spezielle Halterung haben wir benutzt, um das Gehirn in der Aufnahme Kammer zu stabilisieren. Ein Standard-Elektrophysiologie Einrichtung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen oder Paaren von Neuronen verwendet wird. Ein fluoreszierendes Bild, durch die Aufnahme Mikroskop betrachtet, aus einer GAL4 Linie fahren GFP-Expression (GH146) zeigt, wie Projektion Neuronen (PNs) in der Live-Gehirn identifiziert. Eine hohe Leistung Nomarski Bild zeigt eine Ansicht eines einzelnen Neurons, die für ganze Zelle Aufnahme wird angestrebt. Wenn das Gehirn erfolgreich ist ohne Beschädigung entfernt werden, sind die Mehrheit der Neuronen spontan aktiv, feuern Aktionspotentiale und / oder ausstellen spontane synaptische Eingang. Diese in-situ-Herstellung, in der ganzen Zelle die Aufnahme von identifizierten Neuronen in das gesamte Gehirn mit genetischen und pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden können, ist ein nützliches Modell für die Erkundung zellulären Physiologie und Plastizität im adulten ZNS.

Protocol

I. Präparation Gehirne von Erwachsenen fliegen

1. Legen Sie einen kleinen Tropfen (~ 100 ul) zu sezieren Lösung in der Mitte einer 35 mm Petrischale.
2. Fangen erwachsenen Weibchen mit Aspirator. Unter Präpariermikroskop, verwenden Sie zwei Spritzen-Nadeln, die Fliege zu enthaupten.
3. Place-Kopf in einen kleinen Tropfen zu sezieren Kochsalzlösung (mit Papain hinzugefügt) in einer Petrischale.
4. Position Kopf mit Rüssel mit Blick auf Boden der Schale.
5. Halten Sie die Nagelhaut Deckung der linken Facettenauge mit Nadel 1. Machen Sie einen diagonalen Schnitt, der aus dem dorsalen erstreckt sich auf die Ventralfläche mit Nadel 2, nur medial Nadel 1.
6. Halten Sie die Mundwerkzeuge mit Nadel 1 und die Verwendung Nadel 2 eine horizontale Schnitt, der von der ventralen Fläche des linken Auges erstreckt sich auch auf dem rechten Auge, auf der Ebene der Basis des Rüssels zu machen.
7. Halten Sie die Nagelhaut für die richtige Mischung Auge mit Nadel 1. Machen Sie einen diagonalen Schnitt, der aus dem dorsalen erstreckt sich auf die Ventralfläche mit Nadel 2, knapp medial der Nadel 1.
8. Drehen Sie den Kopf so, dass der rostral Seite auf der Petrischale Oberfläche ist. Setzen Sie die Nadel 1 zwischen den rostralen Kutikula und Gehirn, und verwenden Sie Nadel 2, den gleichen Weg wie die erste Nadel zu folgen. Im Idealfall wird die Kapsel abziehen aus dem Gehirn mit den beiden optischen Loben, da diese anzubringen sind bei der Stabilisierung des Gehirns für die Aufnahme wichtig.
9. Die Luftröhre, Luftsäcke und anderen Bindegeweben sind vorsichtig mit zwei feinen Spitze Pinzette.
10. Whole Dissektion sollte 3-10 Minuten

II. Montage des ZNS

1. Das Gehirn ist, um die Aufnahme Kammer mit einer gelben Spitze Pipette übertragen.
2. In der Aufzeichnung Kammer, ist das Gehirn, indem sie die Platin-Rahmen, so dass zwei feine Fadenkreuz Kontakt mit dem Gewebe an der Kreuzung zwischen der optischen Loben und zentrale Hirnregion stabilisiert.
3. Jedes Gehirn ist berechtigt, in der Aufnahme Kammer mit kontinuierlicher Perfusion mit Sauerstoff Kochsalzlösung (95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid) ruhen für mindestens 10 Minuten. Perfusion der Kammer mit Sauerstoff Kochsalzlösung während der Aufzeichnungsdauer fortgesetzt. Die Vorbereitung ist sichtbar mit einem aufrechten Mikroskop (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit einer festen Bühne und ein 40x Wasserimmersionsobjektiv (Achroplan; numerische Apertur, 0,8; Zeiss) und Nomarski-Optik. GFP wurde mit einem BP 505-530 Fluoreszenzfilter angesehen.

III. Elektrophysiologie

1. Pipetten von 8-14 MOhm sind für die gesamte Zelle Aufnahmen verwendet
2. Current-Clamp-und Voltage-Clamp-Aufnahmen werden mit Hilfe einer List EPC7 oder Axopatch 200B Verstärker, ein Digidata 1322a DA-Wandler (Molecular Devices, Foster City, CA), ein Dell Dimension 8200-Computer (Dell Computer, Round Rock, TX), und pClamp 9-Software (Molecular Devices).

Discussion

Die isolierte ganze Gehirn Vorbereitung illustrieren wir in diesem Video ermöglicht die Beurteilung der zellulären Mechanismen, die Erregbarkeit und synaptische Übertragung in identifizierten Neuronen, einschließlich derjenigen in den olfaktorischen Verarbeitung Wege, in der erwachsenen Drosophila Gehirn (Gu und O Dowd, 2006). Dieser Ansatz ist komplementär zu der neuronalen Aktivität im Gehirn der intakten, erwachsenen Drosophila (Wilson et all 2004) Studie, in der gleichen Weise Aufnahmen von Neuronen im Gehirn von Säugetieren Scheibe sind komplementär zu Aufnahmen in wach verhalten Säugetiere. Es gibt zwei wesentliche Vorteile der in-situ-fly Gehirn Vorbereitung, wenn der Säugetier-Scheiben verglichen. Zuerst wird die gesamte fliegen Gehirn passt problemlos in die Aufnahme Kammer so ist es nicht notwendig ist, Verbrauchsteuern ein kleines Stück Gewebe aus einem größeren neuronalen Schaltkreis, der bei Herstellung Gehirn von Säugetieren Scheiben auftritt. Deshalb ist die neuronalen Schaltkreise im Gehirn isoliert Drospohila bleiben weitgehend erhalten. Zweitens sind die Zellkörper der meisten Nervenzellen in der Nähe der Hirnoberfläche, leicht zugänglich für die gesamte Zelle Aufnahme und bleiben sie funktionell aktiv, wenn sie kontinuierlich mit sauerstoffreichem Kochsalzlösung für mehrere Stunden perfundiert.

Mit einem Glasboden Aufnahme Kammer auch eine Identifizierung von spezifischen Neuronen auf der Grundlage von deren Standort und / oder GFP-Expression. In dieser Vorbereitung, Aufnahme während der Perfusion erfordert Stabilisierung des Gehirns. Dies ist nicht kompatibel mit Standard-Verfahren, einschließlich der strategisch platzierten Golddraht oder Nylon-Mesh, dass eine wirksame für Gewebe wie Hippocampus Scheiben sind aufgrund der geringen Größe des gesamten Gehirns (~ 1mm). Deshalb wir ein gestalteten Etui mit einem Platin-Rahmen und Nylon Fadenkreuz positioniert, um das Gehirn in nur zwei Standorte Kontakt, um Schäden an Neuronen in der Nähe der Hirnoberfläche entfernt zu minimieren. Dies stabilisiert das Gehirn, entweder mit dem vorderen oder hinteren Fläche nach oben und der gegenüberliegenden Fläche nur leicht ruht auf dem Boden der Aufnahme Kammer. Mit diesem Gerät können wir routinemäßig stabil halten Ganzzell Aufnahmen bis zu einer Stunde, auch aus kleinen Neuronen einschließlich Kenyon-Zellen, während sie pharmakologischen Manipulationen, Bad Anwendung bestimmter Medikamente benötigen. Der Halter sollte auch nützlich sein bei der Sicherung andere kleine Gewebeproben für elektrophysiologische Untersuchungen wie Rückenmark Scheiben von Neugeborenen Nagetiere.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices