アダルトショウジョウバエの脳から全細胞レコーディング

Summary

このビデオでは、標準のセル全体の技術を使用して単一ニューロンから記録するための準備のために成人のショウジョウバエから全脳を単離するための手順を示しています。それは、記録中に表示したGFP標識された細胞と神経細胞のイメージが含まれます。

Abstract

このビデオでは、我々は、単一のニューロンからの記録の準備のために成人のショウジョウバエから全脳を単離するための手順を示しています。我々は我々の研究で使用されている成人女性の解剖ソリューションとキャプチャを記述することから始めます。 、両方の光のローブを含む、脳全体をそのまま削除するための手順が示されている。上を覆う気管の解剖も表示されます。分離された脳は小さくはないだけですが、神経細胞の損傷を防ぐために、この段階では取り扱いに特別な注意が必要、その多くは、組織の外表面に近づいています。私達は私達が開発した特殊なホルダーが録音室内の脳を安定させるために使用される方法を示します。標準的な電気生理学セットまでは、ニューロンの単一ニューロンまたはペアからレコーディングに使用されます。 GFPの発現を駆動するGAL4ラインから録音顕微鏡を通して見た蛍光画像は、、（GH146）投射ニューロン（PNS）はライブで脳内で識別される方法を示します。ハイパワーノマルスキー画像は、全細胞記録を対象とされている単一のニューロンのビューを示しています。脳が正常に損傷することなく削除されると、ニューロンの大半は、活動電位を焼成及び/または自発的なシナプス入力を示す、自発的にアクティブになります。脳全体で特定された神経細胞の全細胞記録は遺伝的および薬理学的操作と組み合わせることができる現場準備、でこれは、成体中枢神経系の細胞生理と可塑性を探索するための有用なモデルです。

Protocol

大人ハエの脳のI.の解剖

1. 35ミリメートルペトリ皿の中央にソリューションを解剖の小滴（〜100μl）を置きます。
2. アスピレーターを使用して大人の女性をキャッチ。顕微鏡解剖の下に、ハエを斬るには2つの注射針を使用してください。
3. ペトリ皿の解剖生理食塩水の小滴（パパインが追加された）の場所の頭部。
4. 皿の底に直面して口吻を持つと位置のヘッド。
5. 針1で左の複眼をカバーするキューティクルを保持する。針1〜ちょうど内側、ニードル2と背側から腹側表面に対角線カットを行います。
6. 針1と口器を持ち、口吻の基部のレベルで、右眼、左眼の腹側表面から延びる水平カットをするために針2を使用してください。
7. 針1で右側の複眼をカバーするキューティクルを保持する。針1のちょうど内側、ニードル2と背側から腹側表面に対角線カットを行います。
8. 吻側側は、ペトリ皿の表面になるようにヘッドを回転させます。吻側キューティクルと脳の間に針1を挿入し、最初の針と同じパスに従うように針2を使用してください。理想的には、カプセルは、これらの録音のための脳の安定化に重要なので、接続されている光のローブの両方で脳から皮離れてになります。
9. 気管、空気嚢、および他の結合組織を注意深くtwo微細な先端の鉗子を使用して削除されます。
10. 全体の解剖は3-10分を取る必要があります

II。 CNSの取り付け

1. 脳は、黄色の先端のピペットを使用して録音室に転送されます。
2. 録音室では、脳は2つの微細な十​​字線が光のローブと中央脳の領域間の接合部における組織と接触するように、プラチナのフレームを配置することによって安定化される。
3. それぞれの脳は、少なくとも10分間酸素を生理食塩水で連続灌流（95％酸素、5％二酸化炭素）で録音室で休むように許可されています。酸素生理食塩水によるチャンバーの潅流は、記録期間を通じて継続される。とノマルスキー光学系固定段階と40倍の水浸対物レンズ（;開口数、0.8ツァイスAchroplan）で、準備が正立顕微鏡（Zeiss社、オーバーコッヘン、ドイツAxioskop 2FS）を用いて可視化されています。 GFPは、BP 505から530まで蛍光フィルターを使用して表示されました。

III。電気生理学

1. 8月14日Mohmをのピペットは、細胞全体の記録に使用されます。
2. 電流クランプと電圧​​クランプ記録は、リストEPC7またはAxopatch 200Bアンプ、Digidata 1322A DA変換器（Molecular Devices社、フォスターシティー、CA）、デルのディメンション8200コンピュータ（デルコンピュータ、ラウンドロック、テキサス州）を、使用して実行されますおよび9ソフトウェア（Molecular Devices社）をpClamp。

Discussion

我々はこのビデオで説明する分離された全脳標本は成体ショウジョウバエの脳（区とOダウド、2006）における嗅覚の処理経路のもの、を含む、同定されたニューロン、の興奮性とシナプス伝達の根底にある細胞メカニズムの評価を可能にする。このアプローチは、そのまま大人ショウジョウバエ（Wilsonら全2004）の脳内の神経活動の研究に相補的である、ほぼ同じ方法で、哺乳類の脳スライスの神経細胞からの録音は、覚醒行動を哺乳類の記録に相補的である。哺乳類のスライスと比較してその場その場の脳標本での二つの大きな利点があります。それは消費税哺乳類の脳のスライスを作るときに発生する大規模な神経回路から組織の小片を切る必要はありませんので、最初に全体のハエの脳は、録音室に簡単に収まります。したがって、孤立Drospohilaの脳内の神経回路は、大部分はそのまま残ります。第二に、神経細胞のほとんどの細胞体は、脳の表面付近の全細胞記録のための容易にアクセス可能であり、連続して数時間のための酸素を生理食塩水で灌流するとき、それらは機能的にはアクティブのまま。

グラスボトム録音室を使用してもその位置および/またはGFP発現に基づいて、特定のニューロンの同定を可能にする。この準備では、灌流時の録音は、脳の安定化を必要とします。これは、脳全体のサイズが小さい（〜1mm）のが原因で海馬のスライス、などの組織のための効果的戦略的に置かれた金ワイヤまたはナイロンメッシュを含む標準的な手順、互換性がありません。したがって、我々のプラチナ枠と脳の表面近くに位置する神経細胞の損傷を最小限に抑えるためにのみ2つの場所に脳に連絡するように配置ナイロンの十字線でデザインされたホルダー。これはどちらかの面を上に前部または後部表面と反対側の面だけで軽く録音室の床で休んで、脳を安定させます。この装置を用いて、我々は、特定の薬のバスのアプリケーションを必要とする薬理学的操作を行いながら定期的に、さらにケニヨン細胞を含む小さなニューロンから、時間までの安定した全細胞記録を維持することができます。ホルダーはまた、新生児げっ歯類から脊髄のスライスなどの電気生理学的研究のために他の小さな組織サンプルを確保する上で有用であると考えられる。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices