Helcells Inspelningar från hjärnan hos vuxna Drosophila

Summary

Denna video demonstrerar förfarandet för att isolera hela hjärnor från vuxna Drosophila för att förbereda inspelning från enskilda nervceller med hjälp av vanliga hela cellteknologi. Den innehåller bilder av GFP märkta celler och neuroner visade under inspelningen.

Abstract

I denna video visar vi förfarandet för att isolera hela hjärnor från vuxna Drosophila för att förbereda inspelning från enstaka nervceller. Vi börjar med att beskriva dissekera lösningen och tillfångatagandet av den vuxna honor som används i våra studier. Förfarandet för att ta bort hela hjärnan intakt, inklusive både optiska loberna, illustreras. Dissekering av den överliggande luftstrupen visas också. De isolerade Hjärnan är inte bara liten, men behöver särskild vård i hanteringen i detta skede för att förhindra skador på nervceller, av vilka många ligger nära den yttre ytan av vävnaden. Vi visar hur en speciell hållare vi utvecklat används för att stabilisera hjärnan i inspelningen kammaren. En standard elektrofysiologi inrättat används för inspelning från enstaka nervceller eller par av nervceller. En fluorescerande bild, sedd genom inspelning mikroskop, från en GAL4 linje körning GFP uttryck (GH146) illustrerar hur projektion neuron (PNS) identifieras i den levande hjärnan. En hög effekt Nomarski bild visar en vy av en enda neuron som blir måltavla för hela cellen inspelning. När hjärnan är framgångsrikt bort utan att skada, de flesta av nervceller är spontant aktiva, bränning aktionspotentialer och / eller uppvisar spontan synaptisk input. Detta på plats beredning, i vilken helcells inspelning av identifierade nervceller i hela hjärnan kan kombineras med genetiska och farmakologiska manipulationer, är en användbar modell för att utforska cellulär fysiologi och plasticitet i den vuxna CNS.

Protocol

I. dissektion av hjärnor från vuxna flyga

1. Placera en liten droppe (~ 100 l) av dissekera lösning i centrum av en 35 mm petriskål.
2. Catch vuxen hona med aspirator. Enligt dissekera mikroskop, använder två kanyler att halshugga flugan.
3. Placera huvudet i en liten droppe dissekera saltlösning (med papain läggs till) i en petriskål.
4. Placera huvudet med med SNABEL vänd ner i skålen.
5. Håll nagelbanden täcker vänstra förening ögat med nål 1. Gör ett diagonalt snitt som sträcker sig från rygg till ventrala ytan med nål 2, bara mediala till st 1.
6. Håll mouthparts med nål 1 och använd kanyl 2 för att göra en horisontell klippa som sträcker sig från ventrala yta vänster öga till höger öga, på samma nivå som basen av snabel.
7. Håll nagelbanden täcker rätt förening ögat med nål 1. Gör ett diagonalt snitt som sträcker sig från rygg till ventrala ytan med nål 2, precis mediala av nål 1.
8. Vrid huvudet så att rostralt sidan är på petriskålen ytan. In kanylen 1 mellan rostralt nagelband och hjärnan, och använd kanyl 2 att följa samma väg som den första nålen. Helst ska kapseln att skala bort från hjärnan med både optisk loberna bifogas eftersom dessa är viktiga för att stabilisera hjärnan för inspelning.
9. Luftstrupen, luftblåsor och andra bindväv avlägsnas omsorgsfullt med hjälp av två fin spets pincett.
10. Hela dissektion bör ta 3-10 minuter

II. Montering av CNS

1. Hjärnan överförs till inspelningen kammaren med hjälp av en gul spets pipett.
2. I inspelningen kammaren, är hjärnan stabiliseras genom att placera platina ram så att två fina hårkorset få kontakt med vävnaden i korsningen mellan optiska loberna och centrala hjärnan regionen.
3. Varje hjärnan får vila i inspelningen kammaren med kontinuerlig perfusion med syresatt saltlösning (95% syre och 5% koldioxid) i minst 10 minuter. Genomblödningen i kammaren med syresatt saltvatten fortsätter fram under inspelningstiden. Förberedelse är visualiseras med en upprätt mikroskop (Axioskop 2FS, Zeiss, Oberkochen, Tyskland) med en fast scen och ett 40x nedsänkning i vatten mål (Achroplan, numerisk bländare 0,8, Zeiss) och Nomarski optik. GFP sågs med en BP 505-530 fluorescens filter.

III. Elektrofysiologi

1. Pipetter av 8-14 Mohm används för hela cellen inspelningar
2. Aktuell-clamp och spänning-clamp inspelningar görs med en lista EPC7 eller en Axopatch 200B förstärkare, en Digidata 1322A DA-omvandlare (Molecular Devices, Foster City, CA), en Dell Dimension 8200 dator (Dell Computer, Round Rock, TX), och pClamp 9 programvara (Molecular Devices).

Discussion

De isolerade hela hjärnan förberedelser illustrerar vi i den här videon gör bedömning av cellulära mekanismer som ligger bakom retbarhet och synaptisk överföring i identifierade nervceller, inklusive de i den lukt bearbetning vägar, i den vuxna Drosophila hjärnan (Gu och O Dowd, 2006). Denna metod är ett komplement till studier av neuronal aktivitet i hjärnan av intakt vuxna Drosophila (Wilson et alla 2004), ungefär på samma sätt inspelningar från nervceller i ett däggdjur hjärna skiva är ett komplement till inspelningar i vakna beter däggdjur. Det finns två stora fördelar med in situ flyga hjärnan förberedelser jämfört med däggdjur skivor. Första hela flugan hjärnan får lätt plats i inspelningen kammaren så det är inte nödvändigt att punktskatt en liten bit vävnad från en större neural krets som uppstår när man gör däggdjur hjärnan skivor. Därför neuronala kretsar i den isolerade Drospohila hjärnan i stort sett intakt. För det andra cellen organ för de flesta av nervceller är nära hjärnans yta, lätt åtkomliga för helcells inspelning och de förblir funktionellt aktiv när kontinuerlig perfusion med syrerikt saltvatten i flera timmar.

Med hjälp av ett glas kammare botten inspelning tillåter också identifiering av specifika nervceller på grundval av deras placering och / eller GFP uttryck. I denna beredning, inspelningen under genomblödning kräver stabilisering av hjärnan. Detta är inte förenligt med normala förfaranden, inklusive strategiskt placerade guldtråd eller nylon mesh, som är effektiva för vävnader såsom hippocampus skivor, på grund av den begränsade storleken på hela hjärnan (~ 1 mm). Därför har vi en designad hållare med en platina ram och nylon hår över positionerat för att ta kontakt med hjärnan på bara två platser för att minimera skador på nervceller ligger nära hjärnans yta. Detta stabiliserar hjärnan, med antingen främre eller bakre ytan vänd uppåt och den motsatta ytan bara lätt vilar på golvet av inspelningen kammaren. Med hjälp av denna enhet har vi möjlighet att rutinmässigt bibehålla en stabil helcells inspelningar upp till en timme, även från små neuroner inklusive Kenyon celler, medan du gör farmakologiska manipulationer som kräver bad tillämpning av särskilda läkemedel. Innehavaren ska också vara användbara för att säkra andra små vävnadsprover för elektrofysiologiska studier såsom ryggmärgen skivor från nyfödda gnagare.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices