Summary
כאן אנו מתארים את שיטות הבדיקה C. elegans למידה אסוציאטיבי זיכרון אסוציאטיבי קצר לטווח ארוך. אלה מבחני האוכלוסייה להעסיק את היכולות תולעים chemotax כלפי odorants נדיפים, וליצור אסוציאציות חיוביות על זיווג עם מזון butanone chemoattractant. הגדלת מספר תקופות מיזוג גורם זיכרון לטווח ארוך.
Abstract
הזיכרון של חוויות ומידע נודע הוא קריטי עבור אורגניזמים לקבל החלטות כי הסיוע ההישרדות שלהם. ג elegans מנווט את סביבתו באמצעות זיהוי נוירון ספציפי של ריחות מזון כימיים 1, 2, והוא יכול לשייך מדינות התזונתי עם ריחות כימיים 3, 4 הטמפרטורה, ואת pathogenicity של מקור מזון 5.
כאן אנו מתארים מבחני של C. elegans למידה וזיכרון אסוציאטיבי אסוציאטיבי קצר לטווח ארוך. אנו לשנות פרדיגמה למידה הריח מרתיעה 6 במקום כדי לייצר תגובה חיובית; assay כרוך רעב ~ 400 תולעים, ואז להאכיל את התולעים בנוכחות של נוירון-AWC חש butanone chemoattractant נדיף בריכוז זה מעורר מדד chemotactic נמוך (בדומה כדי Toroyama et al. 7). אוכלוסיית תקן chemotaxis assay1 בדיקות משיכה של תולעים odorant מיד או דקות עד שעות לאחר מיזוג.
לאחר chemotaxis, מיזוג wild-type "חיות לעליות butanone ~ 0.6 אינדקס Chemotaxis יחידות," מדד ללמידה "שלה. למידה אסוציאטיבית תלויה בנוכחות מזון והן butanone במהלך אימון. מזון שיוך ו butanone לתקופה מיזוג יחיד ("הכשרה מרוכזת") מייצרת זיכרון לטווח קצר אסוציאטיבי שנמשך ~ 2 שעות. תקופות מיזוג מרובות עם תקופות מנוחה בין ("אימונים במרווחים") התשואות לטווח ארוך זיכרון אסוציאטיבי (<40 שעות), והוא תלוי את החלבון cAMP Response Element Binding (CREB), 6 גורם שעתוק נדרש זיכרון לטווח ארוך על פני מינים. 8
פרוטוקול שלנו כולל גם ניתוח התמונה שיטות לקביעת מהירה ומדויקת של מדדי chemotaxis. ניגודיות גבוהה תמונות של בעלי חיים על צלחות chemotaxis assay נלכדים ונותחו באמצעות תוכנת תולעת ספירה ב-Matlab. התוכנה מתקנת על רקע אחיד באמצעות שינוי tophat מורפולוגיים. שיטה 9 של Otsu לאחר מכן נעשה שימוש כדי לקבוע סף תולעים נפרד מן הרקע. 10 חלקיקים קטנים מאוד יוסרו באופן אוטומטי גדול תולעת שאינם אזורים (קצוות צלחת או אגרופים אגר) הם הוסר על ידי בחירה ידנית. התוכנה ואז מעריך את הגודל של התולעת יחיד על ידי התעלמות אזורים שהם מעל גודל מרבי המצוין ולקחת את הגודל החציוני של האזורים הנותרים. מספר תולעים נאמד אז על ידי חלוקת סך כל השטח מזוהה שנכבשו על ידי תולעים על ידי גודל מוערך של תולעת אחת.
מצאנו כי לימוד קצר זיכרון לטווח ארוך ניתן להבחין, וכי תהליכים אלה לשתף מולקולות מפתח דומה עם יצורים עילאיים. 6,8 מבחני שלנו יכול במהירות מבחן גנים מועמדים רומן או מולקולות המשפיעות על הלמידה קצר או ארוך זיכרון לטווח ב C. elegans שרלוונטיים פני מינים.
Protocol
אלה ג למידה elegans אסוציאטיביים מבחני זיכרון דורשים הכנה מראש. עבור לוח זמנים הציע הכנה, לראות את ציר הזמן מוצג באיור 1 א. כמו כן שים לב זיכרונות "תולעים יכול להיות מופרע על ידי תסיסה פיזית (pipetting צנטריפוגה מחוספס, vortexing), וכי chemotaxis נאיבי יכול להיות מוטרד ריחות מופרז (בושם וכו ') בסביבה.
1. הכנת בעלי חיים עבור Assay
- טפחו תולעים על 100 מ"מ התקשורת צמיחה גבוה (HGM) צלחות (ראה סעיף 7.1 למתכון) seeded עם 1 מ"ל OP50 E. coli תוך שימוש בשיטות סטנדרטית. 11
- Hypochlorite לטיפול לפחות שתי צלחות מאוכלס בצפיפות HGM של תולעים בוגרות הרה להולדת להשיג האוכלוסייה מסונכרן גדול של ביצים.
הערה: לקבלת התשואות הטובות ביותר, מלבין את הדור הראשון כדי להשיג האוכלוסייה מסונכרן מאוד, אקונומיקה אז הדור השני כמו 2 מבוגרים יום כדי להשיג ביצים עבור השלב שלאחר מכן. - לחלק באופן שווה ביצים לצלחות HGM 3-4 seeded עם 1 מ"ל OP50 E. coli עבור כל מטופל hypochlorite צלחת.
הערה: חשוב התולעים מעובדות עם שפע של מזון טרי כמו רעב יכול להשפיע על תוצאות מבחני חוש הריח. - דגירה תולעים ב 20oC במשך 72 שעות, הזמן שלוקח חיות מגיעים לשלב צעירים.
2. טרום מיזוג להרעיב
- בדוק צלחות HGM שלך עם צעירים כדי לוודא שהתולעים עדיין יש שפע של מזון, כי ישנם תולעים מספיק assay (≥ 200 תולעים לכל צלחת assay).
- לשטוף תולעים מצלחות HGM עם M9 חיץ 11 לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. במשך התסיסה לפחות במהלך שוטף, בעדינות להחיל את החיץ M9 ידי שפיכת כמה מיליליטרים לצלחת HGM, בעדינות מערבולת את הצלחת תולעים חינם מן OP50 חיידקים דביק. בשלב הבא, להטות את הצלחת, להרים את התערובת חיץ / תולעת M9 מפינת הצלחת באמצעות pipetman P1000, ולהעביר את התולעים כדי צינור חרוטי 15 מ"ל. אם התולעים נשארים עדיין על הצלחת, חזור על שלב 1-2X.
הערה: קשוח כביסה חיידקים מזיזה את הצלחת שיכולים להפוך אותו לתוך הצינור עם התולעים. חיידק זה בלתי אפשרי להיפטר והוא יכול להפריע מבחני. אל פיפטה תולעים נגד הצד של הצינור, כמו זה יכול לגרום נזק תולעים להפריע מבחני. - בואו תולעים ליישב על ידי כוח הכבידה (אינם צנטריפוגות). הסר supernatant ידי ואקום ולשטוף עם לפחות 3-4 מ"ל של M9. חזור 2X עבור סכום כולל של 3 שוטף.
הערה: Centrifuging במהלך שוטף ימשוך את כל החיידקים הנותרים לתוך האוכלוסייה התולעת, אשר יכול להפריע מבחני. במקום זאת, בעדינות להוסיף M9 חיץ עבור שוטף לאחר מכן על ידי שפיכת אותו ישירות לתוך הצינור מ"ל 15 חרוטי. תולעים התיישבו בחלק התחתון של הצינור צריך להיות מעורב למאגר M9 עם תוספת שלו. אם תולעים נשאר מיושב, בעדינות להפוך את הצינור לערבב. - לאחר לשטוף השלישי, להשתמש בחלק של האוכלוסייה תולעת עבור מבחני נאיבי chemotaxis (סעיף 5).
הערה: זה קריטי לעבוד די מהר בכל הצעדים לשטוף, כמו תולעים יתחילו לגווע ברעב אם הם יושבים יותר מדי זמן M9 חיץ, אשר יכול להגדיל את chemotaxis נאיבי לקראת butanone. - הוסף 3-4 מ"ל של חיץ M9 אל הצינור מ"ל 15 חרוטי, בואו תולעים להרעיב במאגר M9 בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 (איור 1 ב ', ג').
3. הזיכרון לטווח קצר אסוציאטיבי (התקבצו) אימון
ראה איור 1B עבור לטווח קצר זיכרון עבודה אסוציאטיבי assay.
- בסוף תקופת להרעיב ב M9 חיץ (סעיף 2), 2 פס μL של butanone 10% (ב EtOH 95%) על החלק הפנימי של העפעפיים של 60 מ"מ נמטודות צמיחה מדיה (NGM) 11 צלחות כי כבר זורעים עם 500 μL OP50 E. coli.
הערה: האוכלוסייה התחלה טובה מבחני זיכרון קצר ולטווח הארוך היא ≥ 500 μL של תולעים. צלחות מיזוג מרובות נדרשים לכל גנוטיפ לתמוך האוכלוסייה כולה במהלך אימון. כאשר עובדים עם כימיקלים נדיפים, רק לפתוח מכסים של צלחות כשצריך, להשאיר אותם סגורים בכל עת אחרים. - הסר את supernatant חיץ M9 מהצינור חרוטי 15 מ"ל של תולעים מורעבים על ידי ואקום להשתמש pipetman P1000 ליישם 100-200 μL של תולעים על צלחות מיזוג.
הערה: נסה להסיר כמה נוזל M9 ככל האפשר, כך תולעים יכולים להגיע במהירות למקור מזון OP50 כאשר הועבר צלחות מיזוג. תולעים ידבק הפנימי של קצה פיפטה וניתן נשמרת על ידי pipetting כרכים קטנים יותר. - דגירה צלחות מיזוג בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 (איור 1 ב).
- לשטוף תולעים מצלחות עם ~ 1 מ"ל M9 חיץ לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. בואו תולעים ליישב על ידי כוח הכבידה. לשטוף שוב 1-2X עד חיץ M9 בצינור ברור.
הערה: השתמש בשיטות כביסה עדינה המתואר בסעיף2. הצינור אותו 15 מ"ל חרוטי יכול לשמש מן סעיף 2. - לאחר לשטוף הסופי, להסיר את supernatant חיץ M9 ידי ואקום, ולהשתמש כמה האוכלוסייה תולעת עבור מבחני chemotaxis (סעיף 5) לבדוק 1x (התקבצו) למידה אסוציאטיבי של העמותה מזון butanone מיד לאחר מיזוג (0 נקודת זמן דקה ).
אינדקס למידה (LI) = 0 CI שעה - CI תמים. - העברת האוכלוסייה הנותרים של תולעים עד 60 מ"מ seeded NGM צלחות עם μL 500 של OP50 (להחזיק צלחות). שוב, להחיל 100-200 μL של תולעים לכל צלחת כדי להבטיח ישנם חיידקים מספיק כדי לתמוך באוכלוסייה.
הערה: מספר צלחות להחזיק בשימוש לכל גנוטיפ הוא לפחות מספר לטווח קצר זיכרון אסוציאטיבי זמן נקודות להיבדק. - דגירה שלאחר מיזוג צלחות עבור 0.5, 1 או 2 שעות (לטווח קצר זיכרון אסוציאטיבי זמן נקודות) בטמפרטורת החדר (איור 1B).
הערה: זיכרון לטווח קצר אסוציאטיבי של wild-type חיות מסתיים 2 שעות לאחר האימון. נקודות זמן ייתכן שיהיה צורך מותאם גנוטיפים או בתנאים שונים. - כדי לבדוק זיכרון לטווח קצר אסוציאטיבי של העמותה מזון butanone, אחרי כל נקודה בזמן, לשטוף בעדינות תולעים מצלחות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ושוב 1-2X עם חיץ M9. השתמש תולעים עבור מבחני chemotaxis (סעיף 5). אינדקס למידה (LI) = CI נקודת זמן - CI תמים.
הערה: השתמש בשיטות כביסה עדינה המתואר בסעיף 2. עבור כל נקודת זמן, להתעלם מכל תולעים נוסף שלא משמשים מבחני chemotaxis.
4. זיכרון לטווח ארוך אסוציאטיבי (רווח) אימון
ראה תרשים 1C לטווח ארוך העבודה זיכרון אסוציאטיבי assay.
- בצע את הפעולות 3.1-3.2 בסעיף 3.
- דגירה צלחות מיזוג בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (תרשים 1C).
- עקוב אחר צעד 3.4 בסעיף 3.
הערה: כדי להישאר בתוך פרק זמן של 30 דקות, אפשר להתחיל כל שוטף במהלך האימונים ב ~ 25 דקות. - לאחר לשטוף הסופי, להסיר M9 supernatant ידי תולעים ואקום להעביר unseeded 60 NGM צלחות מ"מ.
הערה: השימוש הצלחות מרובות לכל גנוטיפ אינו נדרש בשלב זה, שכן התולעים נמצאים מורעבים. - להרעיב על 60 צלחות NGM מ"מ בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (תרשים 1C).
- לשטוף עם תולעים M9 חיץ לשפופרת 15 מ"ל חרוטי. בואו תולעים ליישב על ידי כוח הכבידה (אינם צנטריפוגות).
הערה: אמנם לא אמורה להיות חיידקים למאגר בנקודה זו, centrifuging ניתן טיפול שעלול להזיק התולעים, ועלול לשבש לטווח ארוך היווצרות הזיכרון. - חזור על שלבים 4.1-4.6 מספר פעמים, עד סך של 7 בלוקים מיזוג 6 להרעיב בלוקים הושלמו (תרשים 1C). (ר 'טבלה 1 עבור גיליון זמן נציג).
- לשטוף בעדינות תולעים מצלחות לתוך הצינור חרוטי 15 מ"ל ושוב 1-2X עם חיץ M9.
- לאחר לשטוף הסופי, להשתמש בחלק של האוכלוסייה תולעת עבור מבחני chemotaxis (סעיף 5) לבדוק 7x (רווח) למידה אסוציאטיבי של העמותה מזון butanone מיד לאחר מיזוג (0 נקודת זמן שעה). אינדקס למידה (LI) = 0 CI שעה - CI תמים.
- העברת האוכלוסייה הנותרים של תולעים עד 100 מ"מ seeded HGM צלחות עם 1 מ"ל של OP50 (להחזיק צלחות). שוב, להחיל 100-200 μL של תולעים לכל צלחת כדי להבטיח ישנם חיידקים מספיק כדי לתמוך באוכלוסייה.
הערה: מספר צלחות להחזיק בשימוש לכל גנוטיפ הוא לפחות מספר לטווח ארוך זיכרון אסוציאטיבי זמן נקודות להיבדק. 100 צלחות NGM מ"מ יכול לשמש גם לאחר מיזוג צלחות, אבל צריך להיות זהירים מאוד כי יש OP50 מספיק כדי לתמוך את אוכלוסיית תולעים לפחות 16 שעות. - דגירה שלאחר מיזוג צלחות עבור 16, 24, ו - 40 שעות (לטווח ארוך זיכרון אסוציאטיבי זמן נקודות) ב 20oC (תרשים 1C).
הערה: זיכרון לטווח ארוך אסוציאטיבי של wild-type חיות מסתיים 40 שעות לאחר האימון. נקודות זמן ייתכן שיהיה צורך מותאם גנוטיפים או בתנאים שונים. - כדי לבדוק זיכרון לטווח ארוך אסוציאטיבי של העמותה מזון butanone, לשטוף בעדינות תולעים מצלחות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ושוב 1-2X עם חיץ M9 אחרי כל נקודת זמן. השתמש תולעים עבור מבחני chemotaxis (סעיף 5). אינדקס למידה (LI) = CI נקודת זמן - CI תמים.
הערה: השתמש בשיטות כביסה עדינה המתואר בסעיף 2. עבור כל נקודת זמן, להתעלם מכל תולעים נוסף לא בשימוש מבחני chemotaxis.
5. Chemotaxis Assay
- הכינו את הצלחות assay chemotaxis. סמן את החלק התחתון של unseeded 100 צלחות NGM מ"מ עם כתמים בתחתית וכל צד של הצלחת (איור 2 א).
הערה: לפחות 3 משכפל לכל גנוטיפ יש להפעיל כדי להשיג תוצאות מובהקות סטטיסטית. - 1 Spot μL של 1 M NaN 3 ב odorant ובמקום לשלוט (איור 2B).
הערה: אין מקום צלחות עם סוכן זה משתק יותר מ -15 דקות לפני תחילת assay, או 3 NaN יהיה מפוזר הרחק כתמים, וחיות יהפוך משותק לפני שהגיע odorant או נקודות בקרה. להיזהר לא לנקב את אגר בעת החלת NaN 3 מאז תולעים יהיה מאורה באזורים ניקב. - בעוד תולעים הם להתיישב צינור חרוטי לאחר מספר שוטף M9 חיץ (סעיף 2), 1 נקודה μL כל EtOH 95% ו butanone 10% (ראה סעיף 7.2) בשעה הנקודות המתאימות על הצלחת assay מסומן (איור 2C) על גבי NaN הבחין בעבר 3.
הערה: כימיקלים צריך להיות הבחינו לפני הוספת תולעים (סעיף 5.4). רשום לעצמך את המקום שבו יש EtOH או butanone. כאשר עובדים עם אלה כימיקלים נדיפים, להיזהר רק לפתוח את המכסים של צלחות בעת הצורך, ולשמור אותם סגורים בכל עת אחרים. - הסר כמה שיותר למאגר M9 ככל האפשר מן הצינור של תולעים התיישבו. השתמש P20 pipetman עם קצה מראש לחתוך (ראה סעיף 7.3), כדי לספק 3X 5 תולעים μL (200-400 בעלי חיים) למקור הצלחת assay מסומן (איור 2 ד).
הערה: שמור את התולעים שנותרו צינור חרוטי 15 מ"ל לשימוש מיזוג Pre להרעיב מבחני זיכרון (סעיפים 2-4). תולעים ידבק בתוך טיפים פיפטה, כך מוסיף תולעים בצלחת בכמויות קטנות יותר חוסך האוכלוסייה תולעת שלך מפחית את כמות הנוזל שמקבל שוחרר עם תולעים לצלחת assay. - טוויסט הפינה של KimWipe לנקודה קטנה ולהשתמש בו כדי לטשטש את החיץ עודף M9. זה ישחרר את התולעים לצלחת assay (2E איור).
הערה: היזהר שלא לנקב את אגר עם KimWipe, אחרת יהיה תולעים מאורה על המקור. תולעים מסוימים עלולים ללכת לאיבוד בשלב זה כפי שהם נמשכים אל תוך KimWipe עם למאגר M9 כאשר סופג. אם באמצעות הדמיה וניתוח לספור תולעים (סעיף 6), לקחת צלחות לתחנת הדמיה לפני שחרור תולעים מן המקור. תמונה של התולעים על המקור מיד לאחר שחרורו ייתן את המספר הכולל של בעלי חיים צלחת assay. - דגירה assay chemotaxis צלחת 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- ספירת תולעים במקור, EtOH, כתמים butanone (איור 2), וכן את המספר הכולל של תולעים בצלחת assay.
הערה: ככלל, תולעים משותק NaN 3 יהיה ברדיוס ~ 1 ס"מ של כתמים, והוא יופיע מקל ישר עם בעלי חיים רבים מוערמים אחד נגד השני. אם באמצעות דימות ותוכנה ניתוח לספור תולעים (סעיף 6), לקחת תמונות של מוצא, EtOH, כתמים butanone. תמונה של הסכום הכולל של תולעים צריך נלקח בסעיף 5.5. תולעים יכול להיות גם "יד ספרתי". - חישוב "מדד Chemotaxis" (CI). CI = ([(n Butanone) - (n EtOH )]/[( סה"כ-n מקור)].
6. תולעת ספירת על ידי ניתוח תמונה
- קח ניגודיות גבוהה בשחור לבן תמונות של תולעים על צלחות chemotaxis assay (איור 3A, ראה סעיף 7.4 לתיאור ההתקנה מצלמה). כדי לחשב את מדד chemotaxis, תמונות יש צורך ב butanone, EtOH, ומוצא נקודות צלחת assay chemotaxis בסוף assay, כמו גם את המספר הכולל של תולעים (תמונה של תולעים על מוצא מיד לאחר שהם משתחררים M9 חיץ בתחילת assay, סעיף 5.5).
הערה: תמונות של צלחות assay chemotaxis ומכסה כ ברדיוס 2 ס"מ סביב כל נקודה בדרך כלל לתפוס את כל החיות על כל מקום. - ודא את הקבצים לכל ניסויים של נקודת זמן (למשל נאיבי, 0 שעות, וכו ') נמצאים בתיקיה אחת, בשם כראוי.
- קבצים עבור כל צלחת chemotaxis חייב להיות שם בתור שכזה: אבל # png (נקודה butanone, משפט #), אורי # png (, מוצא משפט #), המכון הטכנולוגי # png (במקום אתנול, משפט #), טוט # png.... (, הכולל משפט #). (לדוגמה, אם שני ניסויים נוהלו עבור נקודת זמן, באותה תיקייה את הקבצים הבאים יהיה נוכח: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
- פתח Matlab (ראה סעיף 7.5).
- ב קו "מדריך מקומי" בחלק העליון של החלון Matlab, לחפש תיקיות, ולבחור את "count_worms_v0.5.3" תיקייה (M-קבצים זמינה מידע משלים).
- ב "חלון הפקודה", הקלד "count_worms_directory ()." והקישו על Enter.
הערה: גודל התולעת ברירת המחדל כאשר עבור פקודה זו הוא 10 דקות, מקסימום 80 פיקסלים. כדי להתאים את זה בהתבסס על גנוטיפ מסוים או שלב התפתחותי, הקלד "count_worms_directory (" minsize ', 10', maxsize ', 80) "ולשנות את המספרים פיקסל בהתאם. - כאשר תתבקש, בחר את התיקיה של התמונות כדי להיות מנותח.
הערה: רק תיקייה אחת של תמונות ניתן לנתח בכל פעם. - כל תמונה בתיקייה להיות מנותח יצוץ עם סף כבר מוגדר, וחלקיקים הנבחר (איור 3A). גרור את כלי מלבן על חלקיקים נבחרים שאינם תולעים למחוק את האותם. כאשר סיים עם התמונה, ללחוץ על מקש Esc.
- אחרי כל התמונות בתיקייה נבדקים, 4 עמודות יופיעו בחלון הפקודה: (1) שם התמונה (למשל but1); (2) תמיד "[1]:" (3) גודל פיקסל הממוצע תולעת one מחושב על ידי תוכנית התמונה בפרט; ו (4) מספר תולעים מחושב להיות בתמונה.
- לאחר תוכנית זו יש להפעיל, זה יהיה להפקיד השניים. קבצי csv (ניתן לפתוח כמו גליונות אלקטרוניים של Excel) לתוך התיקיה של התמונות זה ניתח פשוט. "Worm_counts_stats" קובץ מספק את העמודות פלט נמצא בחלון הפקודה (סעיף 6.9). הקובץ "worm_counts_summary" מספק 5 עמודות: (1) מספר משפט: מספר תולעים (2) אבל, (3) ETH, ו (4) אורי נקודות; ו (5) המספר הכולל של תולעים.
7. חומרים הערות
- כדי להכין 100 מ"מ התקשורת צמיחה גבוה (HGM) צלחות (סעיף 1): ממיסים 3 גרם NaCl, 20 גרם Bactopeptone, ו 30 גרם Bacto-agar 700 מ"ל מים מזוקקים. תביאו נפח L 1 עם מים מזוקקים. לאחר מעוקר, אגר מגניב 65oC ולהוסיף 4 מ"ל של כולסטרול מ"ג / מ"ל 5 באתנול, 1 מ"ל כל אחד 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4, 25 מ"ל של 1 M KPO 4 (pH = 6.0).
- 95% EtOH משמש, כמו EtOH אחוז גבוה יותר נוטה להכיל זיהומים מתהליך טיהור שיכולים להשפיע על התוצאות. זה רעיון טוב לעשות את butanone 10% (95% EtOH) להצטייד טריים בכל כמה פעמים assay פועלת.
- P20 טיפים חייב להיות כמה מילימטרים לחתוך כדי ליצור חור גדול מספיק עבור התולעים כדי להתאים דרך מבלי להיות פגום. P1000 טיפים כבר יש חורים גדולים מספיק עבור התולעים כדי להתאים דרך.
- צלחת assay chemotaxis הדמיה התחנה (איור 3B) במעבדה מרפי מכיל Firewire מצלמה עם עדשה ההגדלה משתנה המחובר לעמוד בום. תאורה אחורית ממוקמת בתחתית לעמוד מתחת פלטפורמת הדמיה אישית עם גג זכוכית (איור 3 ג), אשר מאפשר צלחות chemotaxis assay להיות מואר מלמטה. "מדידה ואוטומציה" תוכנה (National Instruments) משמש כדי ללכוד תמונות. חומרים עבור תחנת זה הדמיה להגדיר דומים לאלה שפורסמו בעבר, 12 ו - ניתן למצוא טבלה של ריאגנטים ספציפיים וציוד.
8. נציג תוצאות:
מדד טיפוסי chemotaxis נאיבי (CI) עבור wild-type תולעים עבור butanone 10% הוא בסביבות 0.2 (איור 4 א). התקבצו 6 (1x) או רווח (7x) אימון בדרך כלל מגדילה את מדד chemotaxis ל 0.7-0.8 בזמן 0 (איור 4A, CD) לתת מדד למידה (LI = CI מאומן -. נאיבי CI) של 0.6 ~ 6 הלמידה המתרחשת עם הכשרה מרוכזת או במרווחים היא איתנה מאוד. LI של פחות מ -0.5 לרוב עולה כאשר יש בעיות עם assay chemotaxis תמימים, ובעלי חיים יש CI נאיבי של 0.3 ומעלה. בדרך כלל, זה קורה בגלל תולעים גוועים ברעב או צפוף מדי על צלחות הטיפוח בין הלבנת ותחילת assay, או תולעים לשבת יותר מדי זמן M9 חיץ בין שוטף ומתחילים להרעיב, ריחות סביבתיים יכולים גם להגדיל את CI נאיבי. תולעים מורעבים יש CI תמימה הרבה יותר גבוה עבור butanone 10% (איור 4 ב). 6 אנו מוצאים בעיות עם chemotaxis נאיבי נפתרות בדרך כלל עם טיפול תולעת culturing משופרת.
משך הזיכרון מבחני אלה הוא משך הזמן שלוקח מדד chemotaxis מיד לאחר האימון כדי לחזור לרמות נאיבי, כאשר מדד למידה = 0. ב wild-type בעלי חיים, הזיכרון לטווח קצר אסוציאטיביים בדרך כלל מתחילה לרדת לפי שעה 1 לאחר האימון התאספו, נמשך כ 2 שעות, היא עצמאית של גורם שעתוק CREB (איור 4C). 6 זיכרון לטווח ארוך אסוציאטיביים בדרך כלל לא מתחיל ירידה משמעותית עד 16 שעות לאחר האימון במרווחים, נמשך עד 40 שעות, והוא CREB תלויי (איור 4D) 6 זיכרון לטווח ארוך אסוציאטיבי לא יכול לממש את מלוא הפוטנציאל שלה בכמה מקרים: (1). תולעים אין להם מספיק OP50 E. coli במהלך 30 דקות תקופות מיזוג; (2) חיידקים להישאר למאגר M9 בתקופות רעב, או (3) תולעים ניזוקו במהלך assay (כגון תולעים הם pipetted על הצד של הצינור).
הם בדרך כלל תוצאות מובהקות סטטיסטית, כאשר 4 או יותר ניסויים assay chemotaxis מנוהלים לכל גנוטיפ לכל נקודת זמן. בשימוש שש משכפל לכל גנוטיפ בדרך כלל מניבה תוצאות משמעותיות מאוד בלי להיות יותר מדי כדי להתמודד, עם זאת, למתחילים מומלץ להתחיל עם רק שלושה משכפל. באופן כללי, עובדים עם 2-3 גנוטיפים או תנאים במועד נוח למי מנוסה עם אלה מבחני למידה וזיכרון.
יד ספירת תולעים על צלחות chemotaxis assay הוא מאוד זמן רב, יכול להוסיף השונות בין בני זוג או ניסויים במעבדה, ואולי גם להכניס הטיות בניתוח ואניnterpreting נתונים. תולעת לספור על ידי ניתוח התמונה (סעיף 6) סטנדרטיזציה של איסוף נתונים וניתוח ברחבי במעבדה, ואת בממוצע, חתכים נתונים בזמן ניתוח לחברי מעבדה מנוסה עד 1 / 5 כי הדרושים לספור ביד. כאשר משווים מדדים chemotaxis מחושב באמצעות ספירת תולעת ידנית לאלה נקבע על ידי התוכנה Count_worms, אנו מוצאים שגיאה ממוצע של 3.07 (± 1.19)%.
| יום 1 | |
| זמן | צעד |
| 09:00 | 1 שעות להרעיב ב M9 חיץ התחל assay נאיבי chemotaxis |
| 10:00 | מצב # 1 (60 מ"מ NGM צלחות עם מזון butanone), 30 דקות סוף נאיבי chemotaxis assay |
| 10:30 | להרעיב # 1 (60 מ"מ צלחות NGM), 30 דקות |
| 11:00 | תנאי מס '2, 30 דקות |
| 11:30 | להרעיב מס '2, 30 דקות |
| 12:00 | תנאי מס '3, 30 דקות |
| 12:30 | להרעיב # 3, 30 דקות |
| 01:00 | תנאי מס '4, 30 דקות |
| 01:30 | להרעיב מס '4, 30 דקות |
| 02:00 | מצב # 5, 30 דקות |
| 02:30 | להרעיב # 5, 30 דקות |
| 03:00 | מצב # 6, 30 דקות |
| 03:30 | להרעיב # 6, 30 דקות |
| 04:00 | מצב # 7, 30 דקות |
| 04:30 | בגין 0-hr chemotaxis assay העברת תולעים הנותרים להחזיק צלחות עבור 16-40 שעות |
| 05:30 | 0-hr סוף chemotaxis assay |
| יום 2 | |
| זמן | צעד |
| 08:30 | בגין 16 שעות chemotaxis assay |
| 09:30 | 16 שעות סיום chemotaxis assay |
טבלה 1. לתזמן נציג עבור assay לטווח ארוך זיכרון אסוציאטיבי. בדוגמה זו, assay מתחילה ביום 1 בשעה 9 בבוקר עם 1-hr ברעב. 30 דקות מצב ולהרעיב תקופות הם לסירוגין עד התולעים כבר המותנות שבע פעמים. מבחני Chemotaxis מנוהלות בראשית (הנאיבית) ובסופו (0 שעות) של אימון. סה"כ זמן ריצה מתחילתו ועד סופו הוא 8.5 שעות. תולעים על צלחות להחזיק נבדקים chemotaxis כדי butanone החל ביום 2, 16-40 שעות לאחר האימון.
באיור 1. לטווח קצר וארוך עבודה אסוציאטיבי assay זיכרון. (א) ציר הזמן המומלץ של הכנה לקראת מבחני יום מבוצעות. (ב) זיכרון לטווח קצר assay אסוציאטיבי: תולעים מורעבים מותנים למשך שעה 1 נבדק מיד ללמידה 1x (0 דקות.) דרך מבחני chemotaxis, או יועברו על צלחות עם מזון מחזיק 0.5, 1 או 2 שעות לאחר מיזוג. (ג) לטווח ארוך assay זיכרון אסוציאטיבי: בעלי חיים מורעבים לקבל 7 בלוקים הכשרה של מיזוג / רעב לפני שנבדק למידה או LTAM 16-40 שעות לאחר האימון.
איור 2. ההתקנה Chemotaxis assay. (א) סכמטי של צלחת assay chemotaxis. כתמים קטנים מתווספים הצלחת בעזרת סרגל או מכשיר המנחה השני כדי לסמן את המקור (למטה) butanone ו EtOH (שמאל וימין) כתמים על הצלחת. (ב) 1 NaN μL 3 מתווסף הנקודות butanone ו EtOH. (ג) 1 μL כל butanone 10% ו 95% EtOH מתווספים את הנקודות בצד ימין או שמאל של הצלחת. (ד) 200-400 תולעים תלויה M9 חיץ מתווספים המקור של הצלחת. (ה) KimWipe התעקם נקודת משמש לספוג חיץ M9 ותולעים לשחרר לצלחת assay.
איור 3. תולעת לספור עם ניתוח התמונה. (א) דוגמה של "count_worms_v0.5.3" חלון חלקיק תמונה הבחירה. התוכנית נפתחת התמונה ניגודיות גבוהה בשחור לבן המקורי (שמאל) באופן אוטומטי יצוץ חלון עם תמונה thresholded (באמצע). כלי המלבן ניתן להשתמש על מנת להדגיש לחסל רצויים שאינם תולעת "חלקיקים", כגון צלחת סימני assay (1), שולי הצלחת (2), או נקבים אגר (3). (ב) תמונה של תחנת מעבדה מרפי chemotaxis הדמיה assay. צלחות Chemotaxis assay מוארים מלמטה כדי ליצור תמונות חדות גבוהה הנדרשת לניתוח. (ג) סכמטי של מחוייטפלטפורמת הדמיה המשמש תחנת הדמיה chemotaxis.
איור 4. למידה אסוציאטיבית אופיינית והתוצאות זיכרון. (א) chemotaxis נאיבי מדד wild-type תולעים לעליות butanone 10% על התקבצו (1x) אימון. העמותה נודע הוא דורש את השיוך של מזון (OP50 E. coli) ו butanone. מספרים מעל הסורגים לייצג את "מדד ללמידה" (LI = CITrained - CI תמים). (ב) Wild נאיבי סוג chemotaxis כדי butanone 10% הוא גדל מאוד כאשר תולעים הם מורעבים במשך 16 שעות. לספירה לוחות מעובדים קאופמן et al. 2010. 6 (ג) סוג Wild הזיכרון לטווח קצר אסוציאטיבי נמשך כ 2 שעות, היא עצמאית של גורם שעתוק CREB. (ד) סוג Wild לטווח ארוך זיכרון אסוציאטיבי נמשך כ -40 שעות, והוא CREB תלויי.
מידע משלים
Discussion
ג למידה אסוציאטיבית elegans הריח מבחני זיכרון המוצגים כאן להבחין בין תהליכים של למידה מרוכזת, למידה במרווחים, הזיכרון לטווח קצר, לטווח ארוך וזיכרון. מבחני אלה מסתמכים על היכולות של תולעים לחוש ריחות מזון כימיים 1,2 סביבתם וליצור אסוציאציות חיוביות בין השניים. 6 לפיכך, מבחני רגישים מאוד רעב באוכלוסייה המוצא של בעלי חיים, טיפול גדול חייב לנקוט על מנת להבטיח כי תולעים ניזונים היטב לפני ואחרי אימון. הכשרה מרוכזת יחיד התשואות לטווח קצר זיכרון אסוציאטיבי. מספר גדל של תקופות מיזוג פרדיגמה אימון במרווחים הוא קריטי להשגת לטווח ארוך זיכרון אסוציאטיבי ב C. elegans כפי שהוא אורגניזמים אחרים. assay 6,8 אולי זו יכולה להיות שונה כדי לייצר זיכרונות ארוכי טווח של אסוציאציות בין גירויים מותנים מותנה שונים.
למידה אסוציאטיבית שלנו מבחני זיכרון ניתן להשתמש כדי להשוות את יכולות הלמידה והזיכרון של סוג בעלי חיים בטבע מוטציה גנטית או הזדקנות. לדוגמה, בעוד הן למידה אסוציאטיביים זיכרון לטווח ארוך ויכולות אסוציאטיבי ירידה הזדקנות wild-type תולעים, למידה נשמרת זמן רב יותר עם הגיל אצל בעלי חיים עם איתות אינסולין מופחת, וגם למידה וזיכרון נשמרת זמן רב יותר עם הגיל אצל בעלי חיים מוגבל calorically 6. מבחני אלה גם מקובל RNAi טיפול תרופתי או מניפולציה של C. elegans. לדוגמה, טיפול של תולעים עם daf-2 RNAi משפר קצרי וארוכי טווח זיכרון אסוציאטיבי, לעומת זאת, חסימה של שעתוק הגנים ואת סינתזת החלבון עם תרופות (actinomycin D ו cycloheximide, בהתאמה) במהלך אימון במרווחים משבש לטווח ארוך היווצרות הזיכרון. 6
זיכרון לטווח ארוך הוא תהליך חיוני להישרדות כל בעלי החיים, ונראה כי הרבה של המנגנון המולקולרי המעורב לזכר אגודה הפאבלובית נשמרת מפני תולעים ליונקים. 6 היכולת להבחין ולבדוק למידה אסוציאטיבי, קצר טווח זיכרון לטווח ארוך באמצעות אלה מבחני הריח גורם C. elegans מערכת מעולה למחקר נוסף של זיכרון, עשויה לספק תובנות לגבי תהליכים ניווניות כי להוביל לאובדן של למידה וזיכרון אצל בני אדם.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים וו ריו עצה הדמיה הראשונית שלנו הגדרת, צ'גיתאי על ההצעה להשתמש ImageJ 13 לספור תולעים ג'אשרף לעזרה עם Google SketchUp. CTM הוא חוקר Pew במדעי ביו, חוקר מק 'נייט, וכן חוקר קק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).
