Summary
نحن هنا وصف لاختبار أساليب جيم ايليجانس التعلم والذاكرة الترابطية الجمعياتي قصيرة الأجل وطويلة الأجل. هذه المقايسات السكان توظيف قدرات الديدان chemotax نحو odorants المتقلبة ، وتكوين الجمعيات إيجابية على الاقتران الغذاء مع butanone جاذب كيميائي. زيادة عدد فترات تكييف يحرض الذاكرة طويلة المدى.
Abstract
ذاكرة الخبرات والمعلومات المستخلصة أمر حاسم بالنسبة للكائنات لجعل الخيارات التي تساعد بقائهم على قيد الحياة. جيم ايليجانس يتنقل البيئة من خلال الكشف عن خلية عصبية محددة من الطعام والروائح الكيماوية 1 ، 2 ، ويمكن ربط الدول المغذية مع الروائح الكيماوية 3 ، 4 درجات الحرارة ، وتسببها مصدر الغذاء 5.
هنا ، نحن تصف المقايسات من ايليجانس جيم النقابي التعلم والذاكرة الترابطية القصيرة الأجل والطويلة الأجل. تعديل النموذج لدينا خبير الشمية مكره التعلم بدلا من 6 إلى إنتاج رد فعل إيجابي ، ويشمل الفحص ~ 400 تجويع الديدان ، ثم تغذية الديدان في وجود الخلايا العصبية المستشعرة - AWC مماثلة متقلبة butanone جاذب كيميائي بتركيز الذي يتسبب انخفاض مؤشر الكيميائي ( لToroyama آخرون 7). عدد السكان معيار الكيميائي assay1 اختبارات جاذبية الديدان إلى الرائحة على الفور أو دقائق إلى ساعات بعد تكييف.
بعد تكييف الكيميائي والبرية من نوع الحيوانات على زيادات butanone ~ مؤشر الانجذاب الكيميائي 0.6 وحدة ، في "فهرس التعلم". التعلم النقابي يعتمد على وجود كل من المواد الغذائية وbutanone أثناء التدريب. الغذاء الإقران وbutanone لفترة تكييف واحد ("تدريب حشدت") تنتج الذاكرة على المدى القصير النقابي الذي يستمر ~ 2 ساعة. تكييف فترات متعددة مع فترات الراحة بين ("تدريب متباعدة") غلات الذاكرة طويلة المدى النقابي (<40 ساعة) ، وتعتمد على عنصر البروتين cAMP في الاستجابة تجليد (CREB) ، 6 عامل النسخ المطلوبة على المدى الطويل عبر الذاكرة الأنواع 8
كما يتضمن البروتوكول لدينا طرق تحليل الصور من أجل تقرير سريع ودقيق للمؤشرات الكيميائي. يتم التقاط صور عالية التباين من الحيوانات على لوحات فحص الكيميائي وتحليلها بواسطة برنامج دودة الفرز في MATLAB. البرنامج بتصحيح لخلفية تفاوت باستخدام التحول tophat المورفولوجية. الأسلوب 9 أوتسو لثم يستخدم لتحديد عتبة للديدان منفصلة عن الخلفية. 10 جزيئات صغيرة جدا يتم إزالتها تلقائيا وأكبر المنظمات غير دودة المناطق (حواف الصفيحة أو اللكمات آغار) هي إزالة بالاختيار اليدوي. البرنامج ثم تقديرات حجم دودة واحدة من خلال تجاهل المناطق التي هي فوق حجم الأقصى المحدد وأخذ حجم متوسط من المناطق المتبقية. ويقدر ثم عدد الديدان بقسمة مجموع المساحة التي تحتلها على النحو المحدد الديدان التي يقدر حجم دودة واحدة.
لقد وجدنا أن يمكن تمييزها التعلم والذاكرة القصيرة الأجل والطويلة الأجل ، وأن هذه العمليات حصة مماثلة مع جزيئات مفتاح العالي الكائنات الحية. 6،8 لدينا المقايسات يمكن اختبار الجينات بسرعة مرشح رواية أو الجزيئات التي تؤثر على التعلم وقصيرة الأمد أو طويلة في الذاكرة على المدى C. ايليجانس ذات الصلة عبر الأنواع.
Protocol
هذه C. ايليجانس التعلم النقابي والمقايسات الذاكرة تتطلب تحضيرا مسبقا. الجدول الزمني المقترح لإعداد ، انظر الجدول الزمني الوارد في الشكل 1A. لاحظ أيضا أنه يمكن بالانزعاج ذكريات الديدان التي كتبها الهياج المادية (pipetting الخام ، والطرد المركزي ، vortexing) ، ويمكن أن يستسلم الكيميائي السذاجة المفرطة الروائح (العطور ، وغيرها) في البيئة.
1. التحضير للحيوانات عن الفحص
- زراعة الديدان على وسائل الإعلام 100 ملم نمو عالية (HGM) لوحات (انظر القسم 7.1 للصفة) المصنف مع 1 مل E. OP50 القولونية باستخدام أساليب القياسية. 11
- هيبوكلوريت معاملة اثنين على الأقل كثافة بالسكان في لوحات HGM حامل الديدان البالغة في الحصول على عدد كبير من السكان من البيض متزامنة.
ملاحظة : للحصول على أفضل غلة التبييض الجيل الأول للحصول على السكان متزامنة إلى حد كبير ، ثم التبييض الجيل الثاني مثل البالغين 2 يوم للحصول على البيض للخطوة اللاحقة. - يقسم بالتساوي على بيض الصفائح HGM المصنفة 3-4 مع 1 مل E. OP50 تعامل القولونية لكل هيبوكلوريت وحة.
ملاحظة : من المهم أن تزرع الديدان مع الكثير من المواد الغذائية الطازجة والمجاعة يمكن أن تؤثر على نتائج فحوصات الشمية. - الديدان في احتضان 20oC لحوالي 72 ساعة ، والوقت الذي يستغرقه للحيوانات تصل إلى مرحلة الشباب.
2. قبل تكييف جوع
- لوحات مزدوجة الاختيار الخاص HGM مع الشباب للتأكد من الديدان ما زالوا يملكون الكثير من الطعام ، وأن هناك ما يكفي من الديدان للمقايسة (≥ 200 لوحة في مقايسة الديدان).
- غسل الديدان الخروج من لوحات HGM مع العازلة M9 11 في أنبوب 15 مل المخروطية. لأقل الانفعالات خلال يغسل ، بلطف تطبيق عازلة M9 بصب ملليلتر قليلة على لوحة HGM ، ودوامة بلطف لوحة لديدان خالية من البكتيريا OP50 لزجة. المقبل ، والميل لوحة ، وسحب ما يصل العازلة / الدودة M9 خليط من زاوية لوحة باستخدام pipetman P1000 ، ونقل إلى أنبوب الديدان ومخروطية 15 مل. إذا كنت لا تزال تترك الديدان على لوحة ، كرر هذه الخطوة 1 - 2X.
ملاحظة : غسل الخام يزيح البكتيريا الخروج من لوحة يمكن أن تجعل من داخل الأنبوب مع الديدان. هذه البكتيريا من المستحيل للتخلص من ويمكن أن تتداخل مع المقايسات. لا ماصة الديدان ضد الجانب من الأنبوب ، وهذا يمكن ان يسبب تلفا في الديدان وتتداخل مع المقايسات. - اسمحوا الديدان تسوية عن طريق الجاذبية (DO NOT الطرد المركزي). إزالة طاف بواسطة فراغ ، ويغسل ما لا يقل عن 3-4 مليلتر من M9. 2X تكرار لما مجموعه 3 يغسل.
ملاحظة : الطرد المركزي خلال يغسل سيخفضان أي البكتيريا المتبقية في السكان دودة ، والتي يمكن أن تتداخل مع المقايسات. بدلا من ذلك ، إضافة بلطف M9 العازلة ليغسل اللاحقة التي تصب مباشرة في أنبوب 15 مل المخروطية. وينبغي أن الديدان استقرت في قاع الأنبوب تصبح مختلطة في المنطقة العازلة عند إضافة M9 به. إذا الديدان ظلت مستقرة ، عكس بلطف أنبوب إلى المزيج. - بعد غسل الثالث ، استخدام بعض السكان عن دودة المقايسات السذاجة الكيميائي (القسم 5).
ملاحظة : من المهم جدا للعمل بسرعة كبيرة في جميع مراحل الغسيل ، والديدان ستبدأ لتجويع إذا كانوا يجلسون وقتا طويلا في M9 العازلة ، التي يمكن أن تزيد من السذاجة تجاه butanone الكيميائي. - إضافة مل 3-4 العازلة M9 في أنبوب 15 مل المخروطية ، اسمحوا تجويع الديدان في M9 العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (الشكل 1B ، C).
3. الذاكرة القصيرة المدى الجمعياتي (حشدت) التدريب
انظر الشكل 1B على المدى القصير العمل النقابي الذاكرة مقايسة.
- في نهاية هذه الفترة في تجويع العازلة M9 (القسم 2) ، ومسحة من 2 ميكرولتر butanone 10 ٪ (في EtOH 95 ٪) في الداخل من الأغطية من عيار 60 ملم وسائط النمو الخيطية (NGM) 11 لوحات التي تم مع المصنف 500 ميكرولتر OP50 E. القولونية.
ملاحظة : بداية جيدة لسكان المقايسات الذاكرة قصيرة الأجل وطويلة الأجل أمر ≥ 500 ميكرولتر من الديدان. هناك حاجة لتكييف لوحات متعددة في التركيب الوراثي لدعم السكان اثناء التدريب. عند العمل مع المواد الكيميائية المتطايرة ، فقط فتح أغطية لوحات عند الضرورة ، وترك لهم مغلقة في جميع الأوقات الأخرى. - إزالة طاف العازلة M9 من أنبوب مخروطي 15 مل من تجويع الديدان التي الفراغ واستخدام pipetman P1000 لتطبيق 100-200 ميكرولتر من الديدان لوحات تكييف.
ملاحظة : في محاولة لإزالة أكبر قدر ممكن M9 السائل ، بحيث يمكن الحصول على الديدان بسرعة إلى مصدر الغذاء OP50 عند تحويلها إلى لوحات تكييف. والديدان العصا إلى داخل غيض ماصة ، ويمكن حفظها بواسطة pipetting أصغر وحدات التخزين. - احتضان لوحات تكييف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (1B الشكل).
- غسل الديدان الخروج من لوحات مع ~ 1 العازلة M9 مل في أنبوب 15 مل المخروطية. اسمحوا الديدان تسوية عن طريق الجاذبية. يغسل مرة أخرى حتى 1 - 2X M9 العازلة في أنبوب واضح.
ملاحظة : استخدام الأساليب لطيف وصفها في قسم الغسيل2. ويمكن استخدام نفس الأنبوب 15 مليلتر من المخروطية القسم 2. - بعد غسل النهائي ، إزالة طاف M9 العازلة من فراغ ، واستخدام بعض السكان عن دودة المقايسات الكيميائي (القسم 5) لاختبار 1X (حشد) التعلم النقابي للرابطة الغذائية butanone مباشرة بعد تكييف (0 نقطة زمنية دقيقة ).
مؤشر التعلم (LI) = 0 CI ساعة -- CI ساذج. - نقل بقية السكان من الديدان إلى 60 ملم لوحات NGM المصنف مع 500 ميكرولتر من OP50 (عقد لوحات). مرة أخرى ، تطبيق 100-200 ميكرولتر من الديدان في لوحة لضمان وجود البكتيريا بما يكفي لدعم السكان.
ملاحظة : عدد من لوحات الاستمرار في استخدام ما لا يقل عن التركيب الوراثي لعدد من الجمعيات على المدى القصير من النقاط الزمنية للاختبار الذاكرة. - احتضان آخر تكييف لوحات ل0.5 ، 1 أو 2 ساعة (على المدى القصير مرة الذاكرة الترابطية نقطة) في درجة حرارة الغرفة (1B الشكل).
ملاحظة : الذاكرة القصيرة المدى النقابي من الحيوانات البرية من نوع ينتهي 2 ساعات بعد التدريب. النقاط الزمنية قد تحتاج إلى تعديل لالمورثات مختلفة أو شروط. - لاختبار الذاكرة على المدى القصير النقابي للرابطة الغذائية butanone ، بعد كل نقطة زمنية ، وغسل بلطف من أطباق الديدان في أنبوب 15 مل المخروطية ، ومرة أخرى 1 - 2X مع العازلة M9. استخدام الديدان لفحوصات الكيميائي (القسم 5). مؤشر التعلم (LI) التوقيت CI = نقطة -- CI ساذج.
ملاحظة : استخدام أساليب الغسيل اللطيف وصفها في القسم 2. من أجل كل نقطة زمنية ، ونبذ أي الديدان الزائدة التي لا تستخدم في المقايسات الكيميائي.
4. على المدى الطويل الذاكرة الترابطية (مباعد) التدريب
انظر الشكل 1C على المدى الطويل العمل النقابي الذاكرة مقايسة.
- اتبع الخطوات 3،1-3،2 في القسم 3.
- احتضان لوحات تكييف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (الشكل 1C).
- اتبع الخطوة 3.4 في القسم 3.
ملاحظة : لكي تبقى داخل إطار زمني مدته 30 دقيقة ، واحدة يمكن أن تبدأ جميع يغسل أثناء التدريب في 25 دقيقة ~. - بعد غسل النهائي ، وإزالة الديدان التي طاف M9 فراغ ونقل إلى لوحات غير المصنف 60 NGM ملم.
ملاحظة : لا يلزم استخدام لوحات متعددة في التركيب الوراثي في هذه الخطوة منذ يتم تجويع الديدان. - تجويع على 60 لوحات NGM مم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (الشكل 1C).
- غسل الديدان مع العازلة M9 في أنبوب 15 مل المخروطية. اسمحوا الديدان تسوية عن طريق الجاذبية (DO NOT الطرد المركزي).
ملاحظة : في حين ينبغي أن يكون هناك أي البكتيريا في المنطقة العازلة عند هذه النقطة ، الطرد المركزي يمكن ان يكون العلاج المحتمل أن يسبب تلفا للديدان ، ويمكن أن تعطل على المدى الطويل تكوين الذاكرة. - كرر الخطوات عدة مرات حتى 4،1-4،6 مجموعه كتل تكييف 7 و 6 تجويع كتل قد اكتملت (الشكل 1C). (انظر الجدول رقم 1 لممثل ورقة الوقت.)
- يغسل بلطف من أطباق الديدان في أنبوب 15 مل المخروطية ، ومرة أخرى 1 - 2X مع العازلة M9.
- بعد غسل النهائي ، استخدام بعض السكان عن دودة المقايسات الكيميائي (القسم 5) لاختبار 7X (متباعدة) التعلم النقابي للرابطة الغذائية butanone مباشرة بعد تكييف (0 نقطة زمنية ساعة). مؤشر التعلم (LI) = 0 CI ساعة -- CI ساذج.
- نقل بقية السكان من الديدان إلى 100 ملم لوحات HGM المصنف مع 1 مل من OP50 (عقد لوحات). مرة أخرى ، تطبيق 100-200 ميكرولتر من الديدان في لوحة لضمان وجود البكتيريا بما يكفي لدعم السكان.
ملاحظة : عدد من لوحات الاستمرار في استخدام ما لا يقل عن التركيب الوراثي لعدد من الجمعيات على المدى الطويل الذاكرة النقاط الزمنية التي سيتم اختبارها. ويمكن أيضا لوحات NGM 100 مم يمكن استخدامها في مرحلة ما بعد تكييف لوحات ، ولكن يجب على المرء أن يكون حذرا للغاية أن هناك OP50 بما يكفي لدعم السكان من الديدان لا يقل عن 16 ساعة. - احتضان آخر تكييف لوحات لمدة 16 و 24 و 40 ساعة (على المدى الطويل الوقت الذاكرة الترابطية نقطة) في 20oC (الشكل 1C).
ملاحظة : الذاكرة طويلة المدى النقابي من الحيوانات البرية من نوع ينتهي بعد 40 ساعة تدريبية. النقاط الزمنية قد تحتاج إلى تعديل لالمورثات مختلفة أو شروط. - لاختبار الذاكرة طويلة المدى النقابي للرابطة الغذائية butanone ، وغسل بلطف من أطباق الديدان في أنبوب 15 مل المخروطية ، ومرة أخرى 1 - 2X مع العازلة M9 بعد كل نقطة زمنية. استخدام الديدان لفحوصات الكيميائي (القسم 5). مؤشر التعلم (LI) التوقيت CI = نقطة -- CI ساذج.
ملاحظة : استخدام أساليب الغسيل اللطيف وصفها في القسم 2. من أجل كل نقطة زمنية ، ونبذ أي الديدان اضافية لم تستخدم في المقايسات الكيميائي.
5. الفحص الكيميائي
- إعداد لوحات الفحص الكيميائي. الجزء السفلي من علامة غير المصنفة 100 ملم مع لوحات NGM البقع على القاع ، والجانب كل من لوحة (الشكل 2A).
ملاحظة : ما لا يقل عن 3 نسخ متماثلة في التركيب الوراثي يجب تشغيل للحصول على نتائج مهمة احصائيا. - البقعة 1 ميكرولتر من نان 1 م 3 في والرائحةبقعة التحكم (الشكل 2B).
ملاحظة : لا مكان لوحات الخاص بك مع هذا العامل شل أكثر من 15 دقيقة قبل بدء الفحص ، أو نان 3 ومنتشر بعيدا عن البقع ، والحيوانات ستصبح مشلولة قبل الوصول إلى الرائحة أو بقع السيطرة. يجب الحرص على عدم ثقب أغار عند تطبيق نان منذ 3 الديدان سوف تحفر في المناطق ثقبت. - بينما الديدان هي تسوية في أنبوب المخروطية بعد عدة يغسل العازلة M9 (القسم 2) ، والبقعة 1 ميكرولتر كل من EtOH 95 ٪ و 10 ٪ butanone (انظر القسم 7.2) في بقع مناسبة على لوحة فحص علامة (الشكل 2C) على أعلى نان رصدت في وقت سابق 3.
ملاحظة : يجب أن تكون المواد الكيميائية رصدت قبل إضافة الديدان (القسم 5.4). تقديم مذكرة التي وبقعة EtOH أو butanone. عند العمل مع هذه المواد الكيميائية المتطايرة ، وتوخي الحذر لفتح فقط أغطية لوحات عند الضرورة ، والاحتفاظ بها مغلقة في جميع الأوقات الأخرى. - إزالة أكبر قدر من المنطقة العازلة M9 ممكن من أنبوب من الديدان تسويتها. استخدام pipetman P20 مع طرف قبل قطع (انظر القسم 7.3) لتقديم الديدان 3X 5 ميكرولتر (200-400 الحيوانات) إلى الأصل من لوحة فحص علامة (الشكل 2D).
ملاحظة : حافظ على الديدان المتبقية في الأنبوب مخروطية 15 مل لاستخدامها في أجهزة تكييف التمهيدية والمقايسات جوع الذاكرة (الأقسام 2-4). والديدان داخل عصا نصائح ماصة ، مشيرا بذلك إلى لوحة الديدان بكميات أصغر تحافظ على السكان الخاص دودة ويقلل من كمية السوائل التي يحصل صدر مع الديدان على طبق الفحص. - تطور زاوية KimWipe إلى نقطة صغيرة واستخدامها لطخة تصل المخزن M9 الزائدة. سيكون هذا الإصدار الديدان على لوحة فحص (2E الشكل).
ملاحظة : احرص على عدم ثقب آغار مع KimWipe والديدان وإلا سوف تحفر في الأصل. قد تفقد بعض الديدان في هذه الخطوة كما هي سحبها في KimWipe مع العازلة M9 عندما النشاف. إذا باستخدام التصوير والتحليل لعدد الديدان (المادة 6) ، وتأخذ لوحات لمحطة التصوير قبل اطلاق الديدان من الأصل. وصورة من الديدان في الأصل على الفور بعد الافراج عن إعطاء العدد الكلي للحيوانات لوحة مقايسة. - احتضان لوحة الفحص الكيميائي لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- حساب عدد الديدان في الأصل ، EtOH ، والبقع butanone (الشكل 2) ، فضلا عن العدد الإجمالي من الديدان على لوحة مقايسة
ملاحظة : بشكل عام ، والديدان التي شلت نان 3 سيكون ضمن دائرة نصف قطرها 1 سم ~ من البقع ، وسوف تظهر عصا على التوالي مع العديد من الحيوانات مكدسة ضد بعضها البعض. إذا باستخدام التصوير وبرامج التحليل لعدد الديدان (القسم 6) ، والتقاط صور من الأصل ، EtOH ، والبقع butanone. كان ينبغي أن يكون صورة من المبلغ الإجمالي من الديدان التي اتخذت في القسم 5.5. يمكن أن تكون الديدان أيضا "اليد عدها". - حساب "مؤشر الانجذاب الكيميائي" (CI). CI = ([(ن Butanone) -- (ن EtOH)]/[( إجمالي ن المنشأ)].
6. دودة العد بواسطة تحليل الصور
- اتخاذ عالية التباين الأسود والأبيض صور من الديدان على لوحات الفحص الكيميائي (الشكل 3A ، انظر القسم 7.4 للحصول على وصف من الإعداد الكاميرا). لحساب مؤشر الكيميائي ، وهناك حاجة إلى الصور في butanone ، EtOH ، والبقع أصل لوحة الفحص الكيميائي في نهاية لمقايسة ، فضلا عن عدد من الديدان (صورة من الديدان في الأصل مباشرة بعد الإفراج عنهم من M9 العازلة عند بداية الفحص ، القسم 5.5).
ملاحظة : الصور من لوحات الفحص الكيميائي تغطي دائرة نصف قطرها حوالي 2 سم حول كل بقعة عموما التقاط جميع الحيوانات في كل بقعة. - تأكد من احتواء الملفات لجميع المحاكمات من نقطة زمنية واحدة (على سبيل المثال ساذج ، 0 ساعة ، الخ) في مجلد واحد ، واسمه مناسب.
- يجب تسمية الملفات من أجل كل لوحة الكيميائي مثل : # ولكن بابوا نيو غينيا (butanone بقعة ، والمحاكمة #) ، أوري # بابوا نيو غينيا (الأصل ، والمحاكمة #) ، PNG # ETH (بقعة الإيثانول ، والمحاكمة #) ، PNG # طفل.... (المجموع ، والمحاكمة #). (على سبيل المثال ، إذا تم تشغيل تجربتين لنقطة والوقت ، في نفس المجلد والملفات التالية أسماؤهم : but1.png ، but2.png ، eth1.png ، eth2.png ، ori1.png ، ori2.png ، tot1 . بابوا نيو غينيا ، tot2.png)
- مطلب فتح (انظر القسم 7.5).
- في "التيار دليل" سطر في الجزء العلوي من إطار مطلب ، لتصفح المجلدات ، واختيار "count_worms_v0.5.3" المجلد (M - الملفات المتاحة ومعلومات تكميلية).
- في "إطار الأوامر" ، اكتب "count_worms_directory ()." هاهنا.
ملاحظة : حجم الدودة الافتراضي عند لهذا الأمر هو 10 دقيقة ، كحد أقصى 80 بكسل. لضبط هذا النمط الجيني على أساس معينة أو مرحلة النمو ، اكتب "count_worms_directory (' minsize '، 10 ،' maxsize '، 80)" وتغيير أرقام بكسل تبعا لذلك. - عند المطالبة ، واختيار ليتم تحليلها في مجلد من الصور.
ملاحظة : يمكن تحليل مجلد واحد فقط من الصور في وقت واحد. - وسوف كل صورة في المجلد يجري تحليلها يطفو على السطح مع عتبة تعيين بالفعل ، والجسيمات مختارة (3A الشكل). اسحب أداة المستطيل على الجسيمات التي لم يتم اختيارها لحذف الديدان عشرم. ضرب عند الانتهاء من الصورة ، مفتاح ESC.
- بعد أن يتم فحص جميع الصور في المجلد ، وسوف 4 أعمدة تظهر في إطار الأوامر : (1) اسم الصورة (على سبيل المثال but1) ، (2) دائما "[1] ؛" (3) متوسط حجم بكسل واحد دودة وتحسب على أساس البرنامج صورة معينة ، و (4) وعدد من الديدان يراد بها أن تكون في الصورة.
- بمجرد تشغيل هذا البرنامج ، فإنه سيتم إيداع اثنين. ملفات CSV (يمكن فتحه وجداول البيانات إكسل) في مجلد من الصور التي قامت بتحليل للتو. في "worm_counts_stats" ملف يوفر أعمدة الإخراج وجدت في إطار الأوامر (القسم 6.9). في "worm_counts_summary" ملف يوفر 5 أعمدة : (1) عدد المحاكمة ، وعدد من الديدان في (2) ، ولكن ETH (3) ، و (4) نقاط أوري ، و (5) العدد الإجمالي من الديدان.
7. مواد ملاحظات
- لإعداد 100 ملم وسائط النمو العالية (HGM) لوحات (القسم 1) : ذوب 3 غرام كلوريد الصوديوم ، 20 غراما Bactopeptone ، و 30 ز Bacto أجار في 700 مل من الماء المقطر. ليصل حجم 1 لتر من الماء المقطر. بعد التعقيم ، أغار باردة ل65oC وإضافة 4 مل من الكولسترول ملغم / 5 مل في الإيثانول ، 1 مل كل من CaCl M 1 2 ، 1 M MgSO 4 ، و 25 مل من KPO M 1 4 (الرقم الهيدروجيني = 6.0).
- ويستخدم 95 ٪ EtOH ، وأعلى نسبة EtOH يميل الى تحتوي على شوائب من عملية التنقية التي يمكن أن تؤثر على النتائج. انها فكرة جيدة لجعل butanone 10 ٪ (95 ٪ في EtOH) تخزين جديدة كل بضع مرات تشغيل الفحص.
- يجب أن يكون P20 نصائح بضعة ملليمترات قطع لإنشاء حفرة واسعة بما فيه الكفاية للديدان لتناسب خلال دون التلف. P1000 نصائح بالفعل ثقوب كبيرة بما يكفي لتناسب خلال الديدان.
- لوحة الفحص الكيميائي التصوير محطة (الشكل 3B) في المختبر يحتوي على كاميرا ميرفي فايرواير مع عدسة التكبير متغير تعلق على موقف الازدهار. يتم وضع الإضاءة في الجزء السفلي من الوقوف تحت منصة مخصصة التصوير مع كبار الزجاج (الشكل 3C) ، الذي يسمح لوحات مضيئة الفحص الكيميائي من القاع. ويستخدم مصطلح "قياس والتنفيذ" البرمجيات (الصكوك الوطنية) لالتقاط الصور. ضبط مواد لهذه المحطة يصل التصوير مماثلة لتلك التي سبق نشرها ، 12 ويمكن العثور عليها في لائحة محددة من الكواشف والمعدات.
8. ممثل النتائج :
مؤشر نموذجي الكيميائي ساذجة (CI) للبرية من نوع الديدان لbutanone 10 ٪ حوالي 0.2 (الشكل 4A) 6 المتجمع (1X) أو متباعدة (7X) التدريب بشكل عام تزيد من مؤشر الكيميائي في وقت ل0،7-0،8 0 (الشكل 4A ، سي دي) لإعطاء مؤشر التعلم (LI = CI المدربين -- السذاجة CI) من 0.6 ~ 6 التعلم الذي يحدث مع التدريب حشدت أو متباعدة هي قوية جدا. ليثيوم أقل من 0.5 ينشأ عادة عندما تكون هناك مشاكل مع الفحص الكيميائي ساذجا ، والحيوانات لها CI السذاجة تبلغ 0.3 أو أعلى. عادة ، يحدث هذا بسبب الديدان يتضورون جوعا أو مزدحمة للغاية على لوحات زراعة بين التبييض وبدء الفحص ، أو الديدان الجلوس طويلا في M9 عازلة بين يغسل والبدء في تجويع ؛ الروائح البيئية يمكن أن تزيد أيضا CI السذاجة. الديدان جوعا لديها أعلى بكثير من السذاجة CI butanone عن 10 ٪ (الشكل 4B). 6 وجدنا أن يتم حل المشاكل عموما مع الكيميائي السذاجة مع تحسن الرعاية دودة وزراعة.
مدة الذاكرة في هذه المقايسات هو الوقت الذي يستغرقه لمؤشر الكيميائي على الفور بعد التدريب للعودة إلى مستويات السذاجة ، عندما انخفض مؤشر التعلم = 0. في البرية من نوع الحيوانات ، والذاكرة على المدى القصير النقابي عادة ما يبدأ في الانخفاض بنسبة 1 بعد ساعة من التدريب احتشدت ، وتدوم لحوالي 2 ساعة ، وبشكل مستقل عن النسخ CREB عامل الشكل (4C) 6 الذاكرة طويلة المدى النقابي عادة لا يبدأ في الانخفاض بشكل ملحوظ حتى بعد 16 ساعة تدريبية متباعدة ، تستغرق ما يصل الى 40 ساعة ، والتي تعتمد على CREB (الشكل 4D) 6 مايو الذاكرة طويلة المدى النقابي لا تصل طاقتها الكاملة في عدة حالات : (1) الديدان لم يكن لديك ما يكفي OP50 E. القولونية خلال فترات تكييف لمدة 30 دقيقة ، (2) البكتيريا تبقى في المخزن المؤقت خلال فترات المجاعة M9 ، أو (3) معطوبة الديدان خلال الفحص (مثل الديدان وpipetted ضد الجانب من الأنبوب).
النتائج عادة ما تكون ذات دلالة إحصائية عند تشغيل 4 أو أكثر من التجارب فحص الكيميائي في التركيب الوراثي في نقطة زمنية. تشغيل six يتطابق في التركيب الوراثي عادة غلات نتائج مهمة للغاية دون أن تصبح أكثر من اللازم لمعالجة ، ولكن للمبتدئين قد ترغب في البدء سوى ثلاث نسخ متماثلة. عموما ، والعمل مع 2-3 المورثات أو شروط في وقت مريح بالنسبة لأولئك الذين هم من ذوي الخبرة مع هذه المقايسات التعلم والذاكرة.
ومن ناحية العد الديدان على لوحات الفحص الكيميائي تستغرق وقتا طويلا جدا ، ويمكن اضافة التباين بين التجارب المخبرية أو زملائه ، ويمكن أيضا إدخال التحيز عند تحليل وطnterpreting البيانات. دودة الفرز عن طريق تحليل صورة (المادة 6) توحد وجمع البيانات وتحليلها عبر المعمل ، وعلى المتوسط ، وخفض الوقت تحليل البيانات لاعضاء من ذوي الخبرة لمختبر 01/05 من أن هناك حاجة لحساب اليد. عند مقارنة مؤشرات الكيميائي محسوبة باستخدام التهم دودة دليل على تلك التي يحددها البرنامج Count_worms ، نجد خطأ في المتوسط 3.07 (± 1.19) ٪.
| اليوم 1 | |
| مرة | خطوة |
| 09:00 | 1 ساعة جوعا في المخزن M9 تبدأ السذاجة الكيميائي مقايسة |
| 10:00 | حالة # 1 (60 ملم مع لوحات NGM الغذاء وbutanone) ، و 30 دقيقة مقايسة نهاية ساذجة الكيميائي |
| 10:30 | تجويع # 1 (60 ملم لوحات NGM) ، و 30 دقيقة |
| 11:00 | الشرط رقم 2 ، 30 دقيقة |
| 11:30 | تجويع # 2 ، 30 دقيقة |
| 12:00 | الشرط رقم 3 ، 30 دقيقة |
| 12:30 | تجويع # 3 ، 30 دقيقة |
| 01:00 | الحالة رقم 4 ، 30 دقيقة |
| 01:30 | تجويع # 4 ، 30 دقيقة |
| 02:00 | الشرط رقم 5 ، 30 دقيقة |
| 02:30 | تجويع # 5 ، 30 دقيقة |
| 03:00 | الشرط رقم 6 ، 30 دقيقة |
| 03:30 | تجويع # 6 ، 30 دقيقة |
| 04:00 | الحالة رقم 7 ، 30 دقيقة |
| 04:30 | تبدأ 0 - HR الكيميائي مقايسة نقل الديدان المتبقية لعقد لوحات ل16-40 ساعة |
| 05:30 | نهاية 0 - HR الكيميائي مقايسة |
| اليوم 2 | |
| مرة | خطوة |
| 08:30 | يبدأ من 16 ساعة الكيميائي مقايسة |
| 09:30 | مقايسة نهاية الكيميائي 16 ساعة |
الجدول 1. الجدول الزمني الممثل على المدى الطويل فحص الذاكرة الجمعوية. في هذا المثال ، يبدأ الفحص في يوم 1 في الساعة 9 صباحا مع ساعة - 1 تجويع. وتناوبت 30 دقيقة حالة تجويع وحتى فترات قد اشترط الديدان سبع مرات. يتم تشغيل المقايسات الكيميائي في بداية (ساذج) ونهاية (0 ساعة) من التدريب. مجموع وقت التشغيل من البداية الى النهاية هو 8.5 ساعة. ويتم اختبار الديدان على لوحات لعقد الكيميائي لbutanone ابتداء من يوم 2 ، 16-40 بعد ساعات من التدريب.
الشكل 1. قصيرة الأجل وطويلة الأجل فحص الذاكرة سير العمل النقابي. (أ) يتم تنفيذ الجدول الزمني الموصى به لإعداد المؤدية إلى المقايسات اليوم. (ب) على المدى القصير فحص الذاكرة الترابطية : الديدان هي مشروطة في حاجة ماسة إلى 1 ساعة واختبارها على الفور الحصول على التعلم 1X (0 دقيقة) عن طريق فحوصات الكيميائي ، أو نقلها على لوحات عقد مع الطعام ل0.5 ، 1 أو 2 بعد ساعات من هواء. (C) على المدى الطويل فحص الذاكرة الترابطية : حيوانات مجوع تلقي التدريب كتل 7 من تكييف / يتضورون جوعا قبل أن يجري اختبار للتعلم أو LTAM 16-40 بعد ساعات من التدريب.
الشكل 2. الانجذاب الكيميائي إعداد مقايسة. (أ) تخطيطي لوحة فحص الكيميائي. تضاف بقع صغيرة على لوحة بمساعدة حاكم أو جهاز توجيه لوضع علامة المنشأ (القاع) وbutanone وEtOH (اليسار واليمين) البقع على طبق من ذهب. (ب) يضاف 1 ميكرولتر نان 3 إلى بقع butanone وEtOH. (ج) تضاف 1 ميكرولتر كل من butanone 10 ٪ و 95 ٪ EtOH البقع على الجانب الأيمن أو الأيسر من اللوحة. (د) تضاف 200-400 الديدان معلقة في المخزن M9 إلى الأصل من لوحة. (E) يستخدم KimWipe الملتوية الى نقطة لاستيعاب M9 العازلة والديدان الإفراج على طبق الفحص.
الشكل 3. العد دودة مع تحليل الصور. (أ) مثال "count_worms_v0.5.3" نافذة اختيار صورة جسيمات. يفتح البرنامج الأصلي صورة عالية التباين الأسود والأبيض (يسار) انبثاق نافذة تلقائيا مع صورة thresholded (وسط). ويمكن استخدام أداة لتسليط الضوء على المستطيل والقضاء غير مرغوب فيها غير دودة "الجسيمات" ، مثل لوحة علامات مقايسة (1) ، وحواف الصفيحة (2) ، أو ثقوب آغار (3). (ب) صورة من المحطة المختبر الكيميائي ميرفي التصوير مقايسة. هي مضيئة لوحات الفحص الكيميائي من أسفل لخلق النقيض من الصور العالية المطلوبة للتحليل. (C) تخطيطي لصنع مخصصمنصة التصوير المستخدمة في محطة التصوير الكيميائي.
الشكل 4. التعلم النقابي النموذجية والنتائج الذاكرة. (أ) مؤشر الكيميائي السذاجة البرية من نوع الديدان إلى زيادة 10 ٪ على butanone حشدت (1X) والتدريب. رابطة المستفادة يتطلب الاقتران من المواد الغذائية (OP50 كولاي) وbutanone. الأرقام المذكورة أعلاه أشرطة تمثل "مؤشر التعلم" (= LI CITrained -- CI ساذج). (ب) هو زيادة كبيرة في البرية الكيميائي نوع من السذاجة لbutanone 10 ٪ عندما يتم تجويع الديدان لمدة 16 ساعة. يتم تكييفها لوحات ميلادي من كوفمان وآخرون ، 2010. 6 (C) وايلد نوع الذاكرة على المدى القصير النقابي يستمر حوالي 2 ساعة ، وبشكل مستقل عن النسخ CREB عامل. (D) وايلد نوع الذاكرة طويلة المدى النقابي يستمر نحو 40 ساعة ، والتي تعتمد على CREB.
معلومات تكميلية
Discussion
وجيم قدم ايليجانس التعلم النقابي الشمية والمقايسات الذاكرة هنا التمييز بين عمليات التعلم حشدت والتعلم متباعدة ، والذاكرة على المدى القصير ، والذاكرة على المدى الطويل. هذه المقايسات الاعتماد على قدرات الديدان الى الحس الغذائية والكيميائية الروائح 1،2 في محيطهم وتكوين الجمعيات إيجابية بين البلدين. 6 ولذلك ، فإن فحوصات حساسة جدا لتجويع السكان في البدء من الحيوانات ، ويجب الحذر الشديد يجب اتخاذها لضمان تغذية جيدة الديدان قبل وبعد التدريب. تدريب واحد حشدت غلة الذاكرة على المدى القصير النقابي. زيادة عدد فترات متباعدة وتكييف نموذج التدريب عامل حاسم لتحقيق الذاكرة طويلة المدى الجمعياتي في C. ايليجانس كما هو الحال في الكائنات الحية الأخرى. 6،8 وربما يمكن تعديل هذا الاختبار لإنتاج ذكريات طويلة الأجل بين مختلف الجمعيات ومحفزات مشروطة دون شروط.
ويمكن استخدام معارفنا النقابي والمقايسات الذاكرة لمقارنة قدرات التعلم والذاكرة من النوع البري للحيوانات متحولة أو الشيخوخة الجينية. على سبيل المثال ، يتم الاحتفاظ حين أن كلا من التعلم النقابي والجمعياتي على المدى الطويل انخفاض قدرات الذاكرة في الشيخوخة البرية من نوع الديدان ، ويتم الاحتفاظ يعد التعلم مع التقدم في العمر لدى الحيوانات مع اشارة الانسولين مخفضة ، والتعلم والذاكرة مع التقدم في السن يعد في الحيوانات مقيدة السعرات الحرارية. 6 هذه المقايسات هي أيضا قابلة للعلاج الدوائي أو التلاعب رني جيم. ايليجانس. على سبيل المثال ، والعلاج من الديدان مع DAF - 2 رني يحسن قصيرة الأجل وطويلة الأجل الذاكرة الجمعوية ، وعلى العكس ، انسداد نسخ الجين والبروتين مع المخدرات (أكتينوميسين التطوير وسيكلوهيكسيميد ، على التوالي) خلال التدريب متباعدة يعطل على المدى الطويل تكوين الذاكرة. 6
الذاكرة طويلة المدى هي عملية بالغة الأهمية للبقاء في جميع الحيوانات ، ويبدو أن الكثير من الآلات الجزيئية المشاركة في ذكرى رابطة Pavlovian يتم حفظها من الديدان إلى الثدييات. 6 والقدرة على التمييز واختبار التعلم النقابي ، قصيرة المدى والذاكرة طويلة الأمد باستخدام هذه المقايسات الشمية يجعل C. ايليجانس نظام ممتازة لمزيد من الدراسة من الذاكرة ، ويمكن أن توفر نظرة ثاقبة العمليات العصبية التي تؤدي إلى فقدان الذاكرة والتعلم في البشر.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر جورج ريو لتقديم المشورة بشأن التصوير موقفنا المبدئي انشاء ، Z. غيتاي لاقتراح استخدام ImageJ 13 إلى العد والديدان ، وجيه اشرف للحصول على مساعدة باستخدام Google SketchUp. CTM هو باحث بيو في العلوم الطبية الحيوية ، وهو باحث ماكنايت ، والباحث العلمي كيك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).
