Summary
Aqui nós descrevemos métodos para testar C. elegans aprendizagem associativa e de curto e longo prazo memória associativa. Estes ensaios população empregar as habilidades worms para chemotax direção odores voláteis, e formar associações positivas sobre o emparelhamento de alimentos com a butanona chemoattractant. Aumentar o número de períodos de condicionamento induz memória de longo prazo.
Abstract
A memória de experiências e informações aprendidas é fundamental para os organismos de fazer escolhas que ajudam a sua sobrevivência. C. elegans navega seu ambiente através de neurônio-específica detecção de odores de alimentos e química 1, 2, e pode associar estados nutritivo com odores químicos 3, temperatura de 4, e à patogenicidade de uma fonte de alimento 5.
Aqui, descrevemos ensaios de C. elegans aprendizagem associativa e de curto e longo prazo memória associativa. Nós modificamos um paradigma de aprendizado aversivo olfativa 6 a vez produzir uma resposta positiva, o ensaio envolve starving ~ 400 worms, então alimentar os vermes na presença do AWC neurônio-butanona sentiu chemoattractant volátil em uma concentração que provoca um índice quimiotático baixa (similar para Toroyama et al. 7). A população padrão quimiotaxia assay1 testes atração dos vermes para o odorant imediatamente ou minutos a horas após o condicionamento.
Depois de quimiotaxia condicionado, do tipo selvagem dos animais aos aumentos butanona ~ 0,6 Quimiotaxia unidades Index, seu "Índice de Aprendizagem". Aprendizagem associativa é dependente da presença de ambos os alimentos e butanona durante o treinamento. Alimentos emparelhamento e butanona por um período de condicionamento único ("formação massed") produz curto prazo memória associativa que dura aproximadamente 2 horas. Períodos de condicionamento múltiplos com períodos de descanso entre ("formação espaçadas") rendimentos de longo prazo memória associativa (<40 horas), e é dependente da proteína Elemento cAMP encadernação Resposta (CREB), 6 um fator de transcrição necessários para memória de longo prazo através espécies. 8
Nosso protocolo também inclui métodos de análise de imagem para determinação rápida e precisa dos índices de quimiotaxia. Imagens de alto contraste de animais em placas de ensaio de quimiotaxia são capturados e analisados por software verme contagem em MatLab. O software corrige para o fundo irregular usando uma transformação tophat morfológica. Método 9 Otsu é então usado para determinar um limite para worms separado do fundo. 10 partículas muito pequenas são removidos automaticamente e maior verme não-regiões (as bordas da placa ou socos agar) são removidas por seleção manual. O software então calcula o tamanho do verme única, ignorando as regiões que estão acima de um tamanho máximo especificado e tendo a dimensão média das demais regiões. O número de vermes é, então, calcula-se dividindo a área total ocupada pela identificado como worms pelo tamanho estimado de um worm único.
Nós descobrimos que a aprendizagem e de curto e longo prazo de memória podem ser distinguidos, e que estes processos partes semelhantes moléculas chave com organismos superiores. 6,8 Nossos ensaios pode testar rapidamente genes candidatos romance ou moléculas que afetam a aprendizagem e de curto ou longo prazo de memória em C. elegans, que são relevantes em toda espécie.
Protocol
Estes C. elegans aprendizagem associativa e ensaios de memória requerem preparação prévia. Para um calendário sugerido de preparação, ver o cronograma apresentado na Figura 1A. Observe também que as memórias de vermes pode ser perturbado por agitação física (pipetagem áspero, centrifugação, vórtice), e que quimiotaxia ingênuo pode ser perturbado por odores excessivos (perfume, etc) no meio ambiente.
1. Preparação de animais para ensaio
- Cultive worms em media 100 milímetros de alto crescimento (HGM) placas (veja Seção 7.1 para receita) semeados com 1 mL OP50 E. coli usando métodos padrão 11.
- Hipoclorito de tratar pelo menos dois densamente povoadas HGM placas de vermes adultos gravid para obter uma grande população sincronizada de ovos.
Nota: Para obter melhores rendimentos, lixívia a primeira geração a obter uma população altamente sincronizado e, em seguida água sanitária a segunda geração como o Dia 2 adultos para obter ovos para a etapa subseqüente. - Dividir igualmente os ovos em placas HGM 04/03 semeados com 1 mL OP50 E. coli para cada hipoclorito tratados prato.
Nota: É importante que os vermes são cultivadas com abundância de alimentos frescos como a fome pode afetar o resultado de testes olfativos. - Incubar worms a 20oC por cerca de 72 horas, o tempo que leva para os animais atingem a fase adulta jovem.
2. Pré-condicionamento Starve
- Confira o seu placas HGM com adultos jovens para certificar-se os vermes ainda tem a abundância do alimento, e que existem worms suficiente para o ensaio (≥ 200 worms por placa de ensaio).
- Lavar worms off de placas HGM com tampão M9 11 em um tubo cônico de 15 mL. Com o mínimo de agitação durante a lavagem, aplicar suavemente o tampão M9, derramando algumas gotas sobre a placa HGM, e rode suavemente a placa para worms livre da pegajosa OP50 bactérias. Em seguida, incline a placa, puxe a mistura de tampão M9 / worm a partir do canto da placa usando um Pipetman P1000, e transferir os worms ao tubo de 15 mL cônico. Se vermes ainda estão na placa, repita este passo 1-2X.
Nota: Rough lavar as bactérias desaloja off da placa que pode fazê-lo para dentro do tubo com os vermes. Esta bactéria é impossível se livrar de e pode interferir com os ensaios. NÃO pipeta worms contra a lateral do tubo, pois isso pode danificar os worms e interferir com os ensaios. - Vamos resolver worms por gravidade (NÃO centrífuga). Retire o sobrenadante por vácuo e lavar com, pelo menos, 3-4 mL de M9. Repete 2x para um total de 3 lavagens.
Nota: centrifugação durante a lavagem vai puxar para baixo todas as bactérias restantes para a população sem-fim, que pode interferir com os ensaios. Em vez disso, adicione delicadamente M9 buffer para lavagens subseqüentes, derramando-o diretamente no tubo de 15 ml cônico. Worms liquidada no fundo do tubo deve tornar-se misturado no tampão M9 após a sua adição. Se worms permaneceu constante, inverter cuidadosamente o tubo para misturar. - Após a terceira lavagem, use uma parte da população sem-fim para ensaios de quimiotaxia ingênuo (Seção 5).
Nota: É fundamental trabalhar com bastante rapidez em todas as etapas de lavagem, como worms começará a morrer de fome se ficar muito tempo em M9 buffer, o que pode aumentar a quimiotaxia ingênua em direção butanona. - Adicionar mL 3-4 M9 buffer para o tubo cônico 15 mL, vamos morrer de fome worms em tampão M9 em temperatura ambiente por uma hora (Figura 1B, C).
3. Curto prazo Memória Associativa Treinamento (massed)
Ver Figura 1B de curto prazo do fluxo de trabalho associativo de memória do ensaio.
- No final do período de fome em M9 buffer (Seção 2), mL raia 2 de butanona 10% (em EtOH 95%) no interior das tampas de 60 mm de nematóides crescimento media (NGM) 11 placas que foram semeados com 500 mL OP50 E. coli.
Nota: A população de partida para ensaios de memória de curto e longo prazo é ≥ 500 mL de vermes. Placas de condicionamento múltiplos são necessários por genótipo para suportar toda a população durante o treinamento. Ao trabalhar com produtos químicos voláteis, aberto apenas tampas de placas, quando necessário, deixando-os fechados em todas as outras. - Retire o sobrenadante tampão M9 do tubo cônico de 15 mL de vermes famintos por vácuo e usar um Pipetman P1000 para aplicar 100-200 mL de vermes para as placas de condicionamento.
Nota: Tente remover o máximo de líquido M9 possível, de modo que os vermes podem rapidamente chegar à fonte de alimento OP50 quando transferido para as placas de condicionamento. Worms vai ficar com o interior da ponta da pipeta e pode ser conservado por pipetagem de volumes menores. - Incubar as placas condicionado em temperatura ambiente por 1 hora (Figura 1B).
- Lavar worms fora de placas com ~ 1 mL tampão M9 em um tubo de 15 mL cônico. Vamos resolver worms pela gravidade. Lave novamente 1-2X até M9 tampão no tubo é clara.
Nota: Use os métodos suaves de lavar descrito na Seção2. O mesmo tubo 15 mL cônica pode ser usado de Seção 2. - Após a última lavagem, remover o sobrenadante tampão M9 por vácuo, e usar uma parte da população sem-fim para ensaios de quimiotaxia (Seção 5) para testar a 1x (massed) aprendizagem associativa da associação de alimentos-butanona imediatamente após o condicionamento (0 ponto tempo minutos ).
Aprendizagem Índice (LI) = CI 0 hr - CI Naive. - Transferência da população remanescente de worms para 60 milímetros placas NGM semeado com 500 mL de OP50 (segure placas). Novamente, aplique 100-200 mL de vermes por placa para assegurar existem bactérias suficientes para apoiar a população.
Nota: O número de placas de segurar utilizado por genótipo é, pelo menos, o número de pontos de curto prazo memória associativa tempo para ser testada. - Incubar pós-condicionado placas para 0,5, 1 ou 2 horas (de curto prazo momentos associativa de memória) em temperatura ambiente (Figura 1B).
Nota: a curto prazo memória associativa de tipo selvagem animais acaba por 2 horas após o treino. Pontos no tempo podem precisar de ser ajustado para diferentes genótipos ou condições. - Para testar a memória de curto prazo associativo da associação de alimentos-butanona, depois de cada ponto do tempo, lavar cuidadosamente worms em pratos em um tubo cônico de 15 mL e novamente 1-2X com tampão M9. Use worms para ensaios de quimiotaxia (Seção 5). Aprendizagem Índice (LI) = Momento de CI - CI Naive.
Nota: Use os métodos de lavagem suave descrito na Seção 2. Para cada ponto do tempo, descartar qualquer worms extras que não são usados em ensaios de quimiotaxia.
4. Longo prazo da memória associativa Treinamento (Spaced)
Ver Figura 1C a longo prazo do fluxo de trabalho associativo de memória do ensaio.
- Siga os passos de 3,1-3,2 na Seção 3.
- Incubar as placas condicionado em temperatura ambiente por 30 minutos (Figura 1C).
- Siga o passo 3.4 na Seção 3.
Nota: Para se manter dentro de um prazo de 30 minutos, pode-se começar tudo lava durante o treinamento em ~ 25 minutos. - Após a última lavagem, remover M9 sobrenadante por worms de vácuo e transferir para unseeded 60 placas NGM mm.
Nota: O uso de múltiplas placas por genótipo não é necessária nesta etapa já que os vermes morrem de fome. - Fome em 60 placas NGM milímetros em temperatura ambiente por 30 minutos (Figura 1C).
- Lavar com worms M9 tampão dentro do tubo de 15 mL cônico. Vamos resolver worms por gravidade (NÃO centrífuga).
Nota: Enquanto não deve haver bactérias no buffer, neste ponto, centrifugação pode ser um tratamento potencialmente prejudiciais dos vermes, e pode perturbar a longo prazo a formação da memória. - Repita os passos 4,1-4,6 várias vezes até um total de 7 blocos condicionado e 6 blocos de fome foram concluídos (Figura 1C). (Ver Tabela 1 para uma folha de tempo representativo.)
- Lavar cuidadosamente worms em pratos para dentro do tubo cônico de 15 mL e novamente 1-2X com tampão M9.
- Após a lavagem final, use uma parte da população sem-fim para ensaios de quimiotaxia (Seção 5) para testar 7x (espaçadas) aprendizagem associativa da associação de alimentos butanona imediatamente após o condicionamento (0 ponto horas). Aprendizagem Índice (LI) = CI 0 hr - CI Naive.
- Transferência da população remanescente de worms para 100 milímetros HGM placas semeadas com 1 mL de OP50 (segure placas). Novamente, aplique 100-200 mL de vermes por placa para assegurar existem bactérias suficientes para apoiar a população.
Nota: O número de placas de segurar utilizado por genótipo é, pelo menos, o número de longo prazo pontos memória associativa tempo para ser testada. 100 placas NGM milímetros também pode ser usado como pós-condicionado placas, mas é preciso ter muito cuidado que há bastante OP50 para apoiar a população de vermes por pelo menos 16 horas. - Incubar pós-condicionado placas por 16, 24 e 40 horas (de longo prazo momentos associativa de memória) a 20oC (Figura 1C).
Nota: a longo prazo memória associativa de tipo selvagem animais termina em 40 horas após o treino. Pontos no tempo podem precisar de ser ajustado para diferentes genótipos ou condições. - Para testar a memória de longo prazo associativo da associação de alimentos-butanona, lavar cuidadosamente worms em pratos em um tubo cônico de 15 mL e novamente 1-2X com tampão M9 após cada ponto do tempo. Use worms para ensaios de quimiotaxia (Seção 5). Aprendizagem Índice (LI) = Momento de CI - CI Naive.
Nota: Use os métodos de lavagem suave descrito na Seção 2. Para cada ponto do tempo, descartar qualquer worms extra não utilizada nos ensaios de quimiotaxia.
5. Quimiotaxia de Ensaio
- Prepare as placas de ensaio de quimiotaxia. Marca o fundo do unseeded 100 placas NGM mm com manchas na parte inferior e cada lado da placa (Figura 2A).
Nota: Pelo menos três repetições por genótipo deve ser executado para obter resultados estatisticamente significativos. - ML ponto 1 de 1 M NaN 3 no odorant eponto de controle (Figura 2B).
Nota: Não mancha seus pratos com este agente paralisante mais de 15 minutos antes de iniciar o ensaio, ou o NaN 3 irá difusa longe das manchas, e os animais tornam-se paralisado antes de chegar ao odor ou pontos de controle. Tenha cuidado para não perfurar o agar ao aplicar NaN 3, já que worms se toca em áreas perfurado. - Enquanto os vermes estão se instalando no tubo cônico depois de várias lavagens tampão M9 (Seção 2), 1 mL ponto cada um dos EtOH 95% e 10% butanona (ver secção 7.2) nos pontos apropriados na placa de ensaio marcados (Figura 2C), em topo da NaN anteriormente manchado 3.
Nota: Os produtos químicos devem ser vistos antes de adicionar os vermes (Seção 5.4). Tome nota de que no local tem EtOH ou butanona. Ao trabalhar com esses produtos químicos voláteis, ter o cuidado de só abrir as tampas das placas, quando necessário, e mantê-los fechados em todas as outras. - Remover o máximo do buffer M9 possível do tubo de worms resolvido. Use um Pipetman P20 com uma ponta de pré-corte (ver Seção 7.3) para entregar 3X 5 worms mL (200-400 animais) para a origem da placa de ensaio marcados (Figura 2D).
Nota: Mantenha worms restante no tubo de 15 mL cônico para uso em pré-condicionamento Starve e ensaios de memória (Seções 2-4). Worms vai ficar dentro de pontas de pipeta, assim que adicionar worms para a placa em quantidades menores conserva sua população sem-fim e reduz a quantidade de líquido que é liberado com o worms na placa de ensaio. - Torcer o canto de um KimWipe a um pequeno ponto e usá-lo para apagar o buffer M9 excesso. Isso vai liberar os vermes na placa de ensaio (Figura 2E).
Nota: Tenha cuidado para não perfurar o agar com o KimWipe, caso contrário, worms vai burrow na origem. Alguns worms podem ser perdidos nesta etapa como eles são puxados para o KimWipe com o tampão M9 quando blotting. Se utilizando de imagens e análise para contagem de worms (Seção 6), pegue as placas para a estação de imagem antes de liberar worms da origem. Uma imagem do worms na origem imediatamente após o lançamento dará o número total de animais para uma placa de ensaio. - Incubar a placa de ensaio de quimiotaxia por 1 hora à temperatura ambiente.
- Contar o número de worms na origem, EtOH e spots butanona (Figura 2), bem como o número total de vermes na placa de ensaio.
Nota: Geralmente, worms paralisado por NaN 3 será dentro de um raio cm ~ 1 dos pontos, e irá aparecer-pau direto com muitos animais empilhados uns contra os outros. Se utilizando de imagens e software de análise para contagem de worms (Seção 6), tirar fotos da origem, EtOH e spots butanona. Uma imagem da quantidade total de worms deveria ter sido tomada na Seção 5.5. Worms também pode ser "mão-contado." - Calcular o "índice de quimiotaxia" (CI). CI = ([(n Butanona) - (n EtOH )]/[( Origem Total-n)].
6. Worm Contando por Análise de Imagem
- Tome de alto contraste em preto-e-branco de vermes em placas de ensaio de quimiotaxia (Figura 3A, veja a Seção 7.4 para descrição da configuração da câmera). Para calcular um índice de quimiotaxia, as imagens são necessários no butanona, EtOH, e manchas de origem de uma placa de ensaio de quimiotaxia no final de um ensaio, bem como o número total de vermes (worms na imagem de origem imediatamente após serem liberados M9 tampão no início do ensaio, a Seção 5.5).
Nota: As imagens das placas de ensaio de quimiotaxia cobrindo cerca de um raio de 2 cm à volta de cada local, geralmente capturar todos os animais, para cada local. - Certifique-se que os arquivos para todos os ensaios de um ponto de tempo (exemplo Naive, 0 hr, etc) estão contidos em uma pasta, chamado apropriadamente.
- Arquivos para cada placa de quimiotaxia deve ser nomeado como tal: mas # png (butanona spot, julgamento #), ori # png (trial origem, #), eth # png (spot etanol, teste #), # png tot.... (trial total, #). (Por exemplo, se dois ensaios foram executados para um ponto no tempo, na mesma pasta os seguintes arquivos estariam presentes: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
- Abra Matlab (ver secção 7.5).
- Na "Current Directory" linha no topo da janela do Matlab, procurar pastas e escolha a opção "count_worms_v0.5.3" pasta (M-arquivos disponíveis como informação suplementar).
- Na "Janela de Comando", digite "count_worms_directory ()." Pressione Enter.
Nota: O tamanho padrão quando verme para este comando é 10 min, max 80 pixels. Para ajustar isso com base em um genótipo específico ou estágio de desenvolvimento ", count_worms_directory ('MinSize', 10 ', maxsize', 80)" tipo e mudar os números de pixels em conformidade. - Quando solicitado, escolha a pasta de imagens a serem analisadas.
Nota: Apenas uma pasta de imagens podem ser analisadas de uma vez. - Cada imagem na pasta que está sendo analisada irá aparecer com um limite já está definido, e partículas selecionadas (Figura 3A). Arraste a ferramenta retângulo sobre partículas selecionado que não são worms para apagar ªem. Quando terminar com a imagem, pressione a tecla Esc.
- Depois de todas as imagens na pasta são verificados, 4 colunas serão exibidas na janela de comando: (1) nome da imagem (exemplo but1), (2) sempre "[1];" (3) tamanho do pixel média para um sem-fim calculada pelo o programa de imagem em particular, e (4) o número de worms calculado para ser na imagem.
- Uma vez que este programa foi executado, ele irá depositar dois. Csv (pode ser aberto como planilhas do Excel) para a pasta de imagens que acaba analisados. O "worm_counts_stats" arquivo fornece as colunas de saída encontrada na janela de comando (Seção 6.9). O arquivo "worm_counts_summary" fornece 5 colunas: (1) Número de julgamento; número de worms em (2), mas, (3) eth, e os pontos (4) ori, e (5) número total de vermes.
7. Notes materiais
- Para preparar 100 milímetros de mídia de alto crescimento (HGM) placas (Seção 1): Dissolver 3 g de NaCl, 20 g Bactopeptone, e 30 g Bacto-ágar em 700 mL de água destilada. Trazer volume de 1 L com água destilada. Após autoclavagem, agar legal para 65oC e adicionar 4 mL de 5 mg de colesterol / mL em etanol, 1 mL cada, de 1 M CaCl 2, MgSO 4 1 M e 25 mL de 1 M KPO 4 (pH = 6.0).
- 95% EtOH é usado, como EtOH maior percentual tende a conter impurezas do processo de purificação que pode afetar os resultados. É uma boa idéia para fazer a butanona 10% (em 95% EtOH) estocar fresco todos os algumas vezes o teste é executado.
- P20 dicas devem ter alguns milímetros cortada para criar um buraco suficientemente grande para vermes para passar sem ser danificado. P1000 dicas já tem buracos grandes o suficiente para os vermes para passar.
- O ensaio de quimiotaxia placa de imagem da estação (Figura 3B) no laboratório Murphy contém uma câmera com uma lente Firewire ampliação variável ligado a um suporte de boom. Uma luz de fundo é colocado na parte inferior do suporte embaixo de uma plataforma de imagem personalizado com um tampo de vidro (Figura 3C), que permite que placas de ensaio de quimiotaxia a ser iluminada por baixo. "Medição e Automação" software (National Instruments) é usado para capturar imagens. Materiais para esta estação imagem criada são semelhantes aos anteriormente publicados, 12 e pode ser encontrado na Tabela de reagentes e equipamentos específicos.
8. Resultados representativos:
Um índice de quimiotaxia típico naïve (CI) para a do tipo selvagem worms para butanona 10% está em torno de 0,2 (Figura 4A). 6 amontoados (1x) ou espaçados (7x) treinamento geralmente aumenta o índice de quimiotaxia para 0,7-0,8 no tempo 0 (Figura 4A, CD) para dar um índice de aprendizagem (LI = CI treinados -. ingênuo IC) de 6 ~ 0,6 A aprendizagem que ocorre com a formação massed ou espaçados é muito robusto. A LI de menos de 0,5 geralmente surge quando há problemas com o ensaio de quimiotaxia ingênuo, e os animais têm uma CI ingênuo de 0,3 ou superior. Normalmente, isso ocorre porque os vermes estão passando fome ou muito lotados em placas de cultura entre o branqueamento eo início do ensaio, ou worms sentar-se muito tempo em M9-tampão entre lava e começam a passar fome; odores do ambiente também pode aumentar a CI ingênuo. Worms fome tem um CI muito maior ingênuo para butanona 10% (Figura 4B). 6 Achamos que os problemas com a quimiotaxia ingênuo geralmente são resolvidos com cuidado verme melhorou e cultura.
A duração da memória nestes ensaios é o tempo que leva para o índice de quimiotaxia imediatamente após o treino para retornar aos níveis de ingênua, quando o índice de aprendizado = 0. No tipo selvagem animais, memória de curto prazo normalmente associativa começa a declinar por uma hora após o treinamento massed, dura cerca de duas horas, e é independente do fator de transcrição CREB (Figura 4C). 6 de memória de longo prazo associativa normalmente não começam significativamente para diminuir até 16 horas após o treinamento espaçados, dura até 40 horas, e é CREB-dependente (Figura 4D) 6 de memória de longo prazo associativa não pode alcançar seu pleno potencial em vários casos: (1). worms não têm o suficiente OP50 E. coli durante os períodos de 30 minutos condicionado, (2) bactérias permanecem no buffer M9 durante os períodos de fome, ou (3) worms são danificados durante o ensaio (por exemplo, worms são pipetados contra a lateral do tubo).
Resultados são geralmente estatisticamente significativa quando quatro ou mais ensaios ensaio de quimiotaxia são executados por genótipo por ponto de tempo. Executando seis repetições por genótipo normalmente produz resultados muito significativos, sem se tornar demasiado a segurar, no entanto, os iniciantes podem querer começar com apenas três repetições. Geralmente, trabalhando com genótipos 2-3 ou condições ao mesmo tempo é confortável para aqueles que têm experiência com esses ensaios de aprendizagem e memória.
Mão-de contagem em placas de ensaio worms quimiotaxia é muito demorado, pode adicionar variabilidade entre experimentos ou companheiros de laboratório, e pode também introduzir enviesamentos na análise e interpreting dados. Worm contagem por análise de imagem (Seção 6) padroniza a coleta de dados e análise em laboratório, e, em média, os cortes de dados o tempo de análise para os membros do laboratório experiente para 1 / 5 do que o necessário para a contagem mão. Ao comparar os índices calculados usando a contagem quimiotaxia verme manual para os determinados pelo software Count_worms, encontramos um erro médio de 3,07 (± 1,19)%.
| 1 dia | |
| Tempo | Passo |
| 09:00 | 1 hr fome em tampão M9 Iniciar ingênuo ensaio de quimiotaxia |
| 10:00 | Condição # 1 (60 milímetros placas NGM com alimentos e butanona), 30 min Fim ingênuo ensaio de quimiotaxia |
| 10:30 | Fome # 1 (60 milímetros placas NGM), 30 min |
| 11:00 | Condição # 2, 30 min |
| 11:30 | Fome # 2, 30 min |
| 12:00 | Condição # 3, 30 min |
| 12:30 | Fome # 3, 30 min |
| 01:00 | Condição # 4, 30 min |
| 01:30 | Fome # 4, 30 min |
| 02:00 | Condição # 5, 30 min |
| 02:30 | Fome # 5, 30 min |
| 03:00 | Condição # 6, 30 min |
| 03:30 | Fome # 6, 30 min |
| 04:00 | Condição n º 7, 30 min |
| 04:30 | Comece 0-hr quimiotaxia ensaio Transferência de worms restantes para segurar placas para 16-40 horas |
| 05:30 | Final 0-hr quimiotaxia ensaio |
| Dia 2 | |
| Tempo | Passo |
| 08:30 | Comece 16 hr quimiotaxia ensaio |
| 09:30 | Final de 16 horas de ensaio de quimiotaxia |
Tabela 1. Cronograma Representante para longo prazo ensaio memória associativa. Neste exemplo, o ensaio começa no dia 1, às 9 horas com um 1-hr morrer de fome. 30 min-condição e morrer de fome se alternam períodos até o worms foram condicionados sete vezes. Ensaios de quimiotaxia são executados no início (ingênua) e final (0 h) de treinamento. O total de tempo de execução do início ao fim é de 8,5 horas. Worms em placas são testadas para segurar quimiotaxia para butanona começando no dia 2, 16-40 horas após o treino.
Figura 1. Curto prazo e longo prazo workflow ensaio associativa da memória. (A) timeline recomendadas de preparação que antecederam os ensaios são realizados dias. (B) de curto prazo ensaio memória associativa: esfomeado worms são condicionados por 1 hora e testado imediatamente para 1x de aprendizagem (0 min.) Via ensaios de quimiotaxia, ou transferidos para placas segurando com alimentos para 0,5, 1 ou 2 horas após o condicionamento. (C) de longo prazo ensaio memória associativa: animais Starved receber sete blocos de treinamento de condicionamento / fome antes de ser testado para aprender ou LTAM 16-40 horas após o treino.
Figura 2. Quimiotaxia de instalação do ensaio. (A) Esquema de quimiotaxia placa de ensaio. Pequenas manchas são adicionados à placa com a ajuda de uma régua ou dispositivo guiando outros para marcar a origem (inferior) e butanona e EtOH (esquerda e direita) pontos na placa. (B) 1 mL NaN 3 é adicionado aos pontos butanona e EtOH. (C) 1 mL de cada butanona 10% e EtOH 95% são adicionados os pontos no lado esquerdo ou direito do prato. (D) 200-400 worms suspensas em tampão M9 são adicionados à origem da placa. (E) A KimWipe torcida em um ponto é usado para absorver M9 buffer e worms release sobre a placa de ensaio.
Figura 3. Worm contando com análise de imagem. (A) Exemplo de janela de imagem seleção "count_worms_v0.5.3" partícula. O programa abre imagem de alto contraste em preto-e-branco original (à esquerda) aparece automaticamente uma janela com uma imagem limiarizada (meio). A ferramenta retângulo pode ser usado para destacar e eliminar a indesejada não-worm "partículas", tais como marcas de ensaio de placa (1), bordas da placa (2), ou furos agar (3). (B) Imagem da quimiotaxia laboratório Murphy estação de imagens do ensaio. Placas de ensaio de quimiotaxia são iluminados a partir do fundo para criar imagens de alto contraste necessários para a análise. (C) Esquema do custom-madeplataforma de imagem usado na estação de imagens quimiotaxia.
Figura 4. Típicas de aprendizagem associativa e os resultados de memória. (A) O ingênuo índice de quimiotaxia de tipo selvagem worms a aumentos de 10% sobre butanona massed (1x) de treinamento. A associação exige que aprendi é o emparelhamento de alimentos (OP50 E. coli) e butanona. Números acima barras representam o "Índice de Aprendizagem" (LI = CITrained - CI Naive). (B) quimiotaxia tipo selvagem ingênuo butanona 10% é muito maior quando os vermes estão sedentos por 16 horas. AD painéis são adaptados de Kauffman et al., 2010. 6 (C) Selvagem tipo de memória de curto prazo associativa dura cerca de duas horas, e é independente do fator de transcrição CREB. (D) Selvagem tipo de memória de longo prazo associativa dura cerca de 40 horas, e é CREB-dependente.
Informações Complementares
Discussion
O C. elegans aprendizado olfativo associativo e ensaios de memória apresentado aqui distinguir entre os processos de aprendizagem massed, aprendendo espaçados, memória de curto prazo e memória de longo prazo. Estes ensaios contam com as habilidades dos worms "para sentir os odores dos alimentos e produtos químicos em seus 1,2 ambiente e de formar associações positivas entre os dois. 6 Portanto, os ensaios são muito sensíveis à fome na população a partir de animais, e um grande cuidado deve ser tomadas para garantir que os worms são bem alimentados antes e após o treinamento. Treinamento massed única rendimentos de curto prazo memória associativa. O aumento do número de períodos de condicionamento e treinamento espaçados paradigma é fundamental para alcançar a longo prazo memória associativa em C. elegans como é em outros organismos. 6,8 Talvez este ensaio pode ser modificada para produzir memórias de longo prazo de associações entre diferentes estímulos condicionados e incondicionados.
Nossa aprendizagem associativa e ensaios de memória pode ser usado para comparar as capacidades de aprendizagem e memória de tipo selvagem ao envelhecimento ou genética animais mutantes. Por exemplo, enquanto a aprendizagem associativa e de longo prazo de memória associativa declínio habilidades no envelhecimento do tipo selvagem worms, a aprendizagem é mantida durante mais tempo com a idade em animais com a sinalização de insulina reduzida, e aprendizagem e da memória é mantido mais tempo com a idade em animais sob restrição calórica. 6 Estes ensaios também são passíveis de tratamento RNAi ou manipulação farmacológica do C. elegans. Por exemplo, o tratamento de vermes com daf-2 RNAi melhora a curto ea longo prazo memória associativa e, inversamente, o bloqueio da transcrição de genes e síntese de proteínas com drogas (actinomicina D e cicloheximida, respectivamente) durante o treinamento espaçadas interrompe a longo prazo a formação da memória. 6
Memória de longo prazo é um processo que é crucial para a sobrevivência em todos os animais, e parece que grande parte da maquinaria molecular envolvida na memória de uma associação pavloviana é conservada a partir de vermes aos mamíferos. 6 A capacidade de distinguir e teste de aprendizagem associativa, de curto prazo e memória de longo prazo com estes testes olfativos faz C. elegans um excelente sistema para o estudo adicional de memória, e pode fornecer a introspecção em processos neurodegenerativos que levam à perda de aprendizagem e memória em humanos.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos W. Ryu para aconselhamento sobre a nossa imagem inicial set-up, Z. Gitai para a sugestão de usar ImageJ 13 a contar worms, e J. Ashraf para ajudar com o Google SketchUp. CTM é um Scholar Pew em Ciências Biomédicas, um Scholar McKnight, e um Scholar Keck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
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