Summary
Här beskriver vi metoder för att testa C. elegans associativ inlärning och kort-och långsiktiga associativt minne. Dessa befolkningen analyser använder maskarna förmåga att chemotax mot flyktiga doftämnen, och bilda positiva associationer på para ihop mat med chemoattractant butanon. Öka antalet konditioneringen perioder inducerar långtidsminne.
Abstract
Minnet av erfarenheter och lärt sig information är avgörande för organismer att göra val som hjälp att överleva. C. elegans navigerar sin miljö genom neuron för detektering av livsmedel och kemiska lukter 1, 2, och kan associera närande stater med kemiska lukter 3, temperatur 4 och patogenicitet av en näringskälla 5.
Här beskriver vi analyser av C. elegans associativ inlärning och kort-och långsiktiga associativt minne. Vi ändrade en aversiva olfactory lärande 6 för att istället ge en positiv respons, analysen innebär svältande ~ 400 maskar, sedan mata maskarna i närvaro av AWC neuron-kände flyktigt chemoattractant butanon vid en koncentration som framkallar en låg kemotaxi index (liknande att Toroyama et al. 7). En standard befolkningen chemotaxis assay1 testar maskar "dragning till luktämnen omedelbart eller minuter till timmar efter konditionering.
Efter luftkonditionering, vildtyp djurens chemotaxis att butanon ökar ~ 0,6 chemotaxis indexenheter, dess "Learning Index". Associativ inlärning är beroende av närvaro av både mat och butanon under träning. Para ihop mat och butanon för en enda konditionering period ("hopade utbildning") ger kortsiktiga associativt minne som varar i ~ 2 timmar. Flera luftkonditionering perioder med vila mellan ("radavstånd utbildning") ger långsiktig associativt minne (<40 timmar) och är beroende av cAMP Response Element bindande protein (CREB), 6 en transkriptionsfaktor som krävs för långtidsminnet över arter. 8
Vår Protokollet innehåller också metoder bildanalys för snabb och noggrann bestämning av chemotaxis index. Bilder med hög kontrast av djur på kemotaxi analys tallrikar fångas upp och analyseras av mask räkna programvara i Matlab. Programvaran korrigerar för ojämna bakgrunden med hjälp av en morfologisk Tophat förvandling. 9 Otsu-metoden används sedan för att bestämma en tröskel att separera maskar från bakgrunden. 10 Mycket små partiklar tas bort automatiskt och större icke-mask regioner (platta kanter eller stansar agar) är bort genom manuellt val. Programmet beräknar då storleken enda masken genom att ignorera regioner som ligger över en viss maximal storlek och med medianen storleken på de övriga regionerna. Antalet maskar då beräknas genom att dividera den totala ytan som identifierats som upptas av maskar med den uppskattade storleken av en enda mask.
Vi har funnit att lärande och kort-och långtidsminne kan urskiljas och att dessa processer har samma viktiga molekyler med högre organismer. 6,8 Våra analyser kan snabbt testa nya gener eller molekyler som påverkar inlärning och kort-eller lång sikt minne i C. elegans som är relevanta över arter.
Protocol
Dessa C. elegans associativa inlärning och analyser minne kräver förberedelser. För ett förslag på tidsplan för beredning, se tidslinjen visas i Figur 1A. Observera också att maskar "minnen kan störas av fysiska agitation (grovt pipettering, centrifugering, vortexa), och att naiva kemotaxi kan oroas av alltför lukt (parfym mm) i miljön.
1. Förberedelse av djuren för analys
- Odla maskar på 100 mm hög tillväxt media (HGM) plattor (se avsnitt 7.1 för recept) seedade med 1 ml OP50 E. coli med hjälp av standardmetoder. 11
- Hypoklorit-treat minst två tätbefolkade HGM plåtar gravid vuxna maskar för att få en stor synkroniserad population av ägg.
Obs: För bästa avkastningen, blekmedel den första generationen att få en mycket synkroniserad befolkning, sedan bleka den andra generationen som Dag 2 vuxna för att få ägg för det efterföljande steget. - Jämnt dela ägg på 3-4 HGM tallrikar ympats med 1 mL OP50 E. coli för varje hypoklorit behandlas platta.
Observera: Det är viktigt att maskarna odlas med mycket färsk mat som svält kan påverka resultatet av luktsinnet analyser. - Inkubera maskar vid 20 ° C i ca 72 timmar, den tid det tar för djuren att nå de unga vuxna scenen.
2. Konditioneringen Starve
- Dubbelkolla dina HGM plattor med unga vuxna att se till att maskarna ändå ha gott om mat, och att det finns tillräckligt med mask för analysen (≥ 200 maskar per analys plåt).
- Tvätta maskar bort av HGM plattor med M9 buffert 11 till ett 15 ml koniskt rör. För de minsta agitation under tvättar försiktigt tillämpa M9 bufferten genom att hälla några milliliter på HGM plattan och snurra försiktigt plattan fria maskar från den klistriga OP50 bakterier. Därefter luta plattan, dra upp M9 buffert / mask blandning från hörnet av plattan med en P1000 pipetman, och överföra maskar till 15 ml koniska rör. Om maskar är fortfarande kvar på plattan, upprepa detta steg 1-2X.
OBS: Grovt tvätt lösgör bakterier bort från plattan som kan göra det i röret med maskar. Denna bakterie är omöjligt att bli av med och kan störa analyserna. Pipettera ej maskar mot sidan av röret, eftersom detta kan skada maskar och störa analyser. - Låt maskar lösa genom självtryck (INTE centrifugering). Avlägsna supernatanten genom vakuum och tvätta med minst 3-4 mL M9. Upprepa 2X för totalt 3 tvättar.
Obs: Centrifugering under tvättar kommer att dra ned eventuella kvarvarande bakterier i masken befolkningen, vilket kan störa analyser. Istället försiktigt lägga M9 buffert för senare tvättar genom att hälla det direkt i 15 ml koniska rör. Worms avgöras i botten av röret bör bli blandas i M9 bufferten på dess tillägg. Om maskar kvar avgöras, vänd försiktigt röret för att blanda. - Efter den tredje tvätt, använder en del av masken befolkningen för naiva chemotaxis tester (avsnitt 5).
OBS: Det är viktigt att jobba ganska snabbt i alla tvätta steg, som maskar kommer att börja svälta om de sitter för länge i M9 buffert, vilket kan öka den naiva chemotaxis mot butanon. - Tillsätt 3-4 ml M9 bufferten till 15 ml koniska rör, låt maskar svälta i M9 buffert i rumstemperatur i en timme (Figur 1B, C).
3. Kortfristiga associativa minne (hopade) Utbildning
Se Figur 1B för kortsiktiga associativt minne analys arbetsflöde.
- I slutet av den svälta period i M9 buffert (avsnitt 2), strimma 2 mikroliter av 10% butanon (i 95% EtOH) på insidan av locken på 60 mm rundmasken tillväxt media (NGM) 11 plattor som har ympats med 500 mikroliter OP50 E. coli.
OBS: En bra start befolkningen för kort-och långtidsminne analyser är ≥ 500 mikroliter av maskar. Flera luftkonditionering plattor behövs per genotyp för att stödja hela befolkningen under träning. När du arbetar med flyktiga kemikalier, bara öppna lock av plattor när det behövs, lämnar dem stängda vid alla andra tillfällen. - Ta bort M9 buffert supernatanten från 15 ml koniska rör med svalt maskar av vakuum och använda en P1000 pipetman att tillämpa 100-200 mikroliter av maskar till conditioning plattorna.
Observera: Försök att ta bort så mycket M9 vätska som möjligt, så att maskarna snabbt kan komma till OP50 näringskälla när den överförs till den konditionerande plattorna. Worms fastnar på insidan av pipettspetsen och kan bevaras genom att pipettera mindre volymer. - Inkubera luftkonditionering plattorna i rumstemperatur i en timme (Figur 1B).
- Tvätta maskar bort av plattor med ~ 1 mL M9 bufferten i ett 15 ml koniskt rör. Låt maskar bosätta av tyngdkraften. Tvätta igen 1-2X tills M9 buffert i röret är klart.
Obs: Använd den milda tvätt metoder som beskrivs i avsnitt2. Samma 15 ml koniska rör kan användas från 2 §. - Efter den sista tvätten, ta bort M9 bufferten supernatanten med vakuum, och använder en del av masken befolkningen för kemotaxi tester (avsnitt 5) för att testa för 1x (hopade) associativ inlärning av livsmedel butanon föreningen omedelbart efter konditioneringen (0 minut tidpunkt ).
Lära Index (LI) = CI 0 tim - CI Naive. - Överför den återstående populationen av maskar till 60 plattor mm NGM ympats med 500 mikroliter av OP50 (håll plåtar). Återigen gäller 100-200 mikroliter av maskar per platta att se till att det finns tillräckligt med bakterier för att stödja befolkningen.
Anm: Antalet håller plattor som används per genotyp är minst det antal kortsiktiga associativt poäng minne tid som ska testas. - Inkubera efter konditionering plattor för 0,5, 1 eller 2 timmar (kortfristig associativt minne tidpunkter) vid rumstemperatur (Figur 1B).
Notera: Kortfristiga associativa minne av vildtyp djur avslutas med 2 timmar efter träningen. Tidpunkter kan behöva justeras för olika genotyper eller villkor. - För att testa för kortsiktiga associativa minne av den mat-butanon förening, efter varje tidpunkt, försiktigt tvätta maskar bort plattorna i en 15 ml koniska rör och igen 1-2X med M9 buffert. Använd maskar för kemotaxi tester (avsnitt 5). Lära Index (LI) = KI Tid punkt - CI Naive.
Obs: Använd den milda tvätt metoder som beskrivs i avsnitt 2. För varje tidpunkt, kasta några extra maskar som inte används i chemotaxis analyser.
4. Långfristiga associativa minne (Spaced) Utbildning
Se Figur 1C för långsiktig associativt minne analys arbetsflöde.
- Följ steg 3,1-3,2 i avsnitt 3.
- Inkubera luftkonditionering plattorna i rumstemperatur i 30 minuter (Figur 1C).
- Följ steg 3,4 i avsnitt 3.
OBS: För att stanna kvar i en 30-minuters tidsram, kan man börja alla tvättar under utbildning på ~ 25 minuter. - Efter den sista tvätten, ta bort M9 supernatanten med vakuum och överföra maskar att unseeded 60 plattor mm NGM.
Observera: användning av flera plattor per genotyp behövs inte i detta steg eftersom maskarna är svalt. - Svälta på 60 plattor mm NGM i rumstemperatur i 30 minuter (Figur 1C).
- Tvätta maskar med M9 buffert i 15 ml koniska rör. Låt maskar lösa genom självtryck (INTE centrifugering).
OBS: Även om det borde inga bakterier i bufferten på denna punkt kan centrifugering vara ett potentiellt skadliga behandling av maskar, och kan störa långtidsminne formation. - Upprepa steg 4,1-4,6 flera gånger tills totalt 7 konditionering block och 6 svälta block har avslutats (Figur 1C). (Se tabell 1 för en representativ tid ark.)
- Försiktigt tvätta maskar bort tallrikar i 15 ml koniska rör och igen 1-2X med M9 buffert.
- Efter den sista tvätten, använder en del av masken befolkningen för kemotaxi tester (avsnitt 5) för att testa för 7x (avstånd) associativ inlärning av livsmedel butanon föreningen omedelbart efter konditioneringen (0 timmes tid punkt). Lära Index (LI) = CI 0 tim - CI Naive.
- Överför den återstående populationen av maskar till 100 plattor mm HGM ympats med 1 mL OP50 (håll plåtar). Återigen gäller 100-200 mikroliter av maskar per platta att se till att det finns tillräckligt med bakterier för att stödja befolkningen.
Anm: Antalet håller plattor som används per genotyp är minst det antal långsiktiga associativt poäng minne tid som ska testas. 100 mm NGM plattor kan också användas som post-condition plattor, men man måste vara mycket noga med att det finns tillräckligt OP50 att stödja befolkningen i maskar i minst 16 timmar. - Inkubera efter konditionering plattor för 16, 24 och 40 timmar (långsiktiga associativt minne tidpunkter) vid 20 ° C (Figur 1C).
Notera: Långsiktiga associativa minne av vildtyp djur slutar med 40 timmar efter träningen. Tidpunkter kan behöva justeras för olika genotyper eller villkor. - För att testa för långsiktig associativa minne av den mat-butanon förening, försiktigt tvätta maskar bort plattorna i en 15 ml koniska rör och igen 1-2X med M9 buffert efter varje tidpunkt. Använd maskar för kemotaxi tester (avsnitt 5). Lära Index (LI) = KI Tid punkt - CI Naive.
Obs: Använd den milda tvätt metoder som beskrivs i avsnitt 2. För varje tidpunkt, kasta några extra maskar används inte i chemotaxis analyser.
5. Chemotaxis analys
- Förbered chemotaxis analysen plattorna. Markera botten unseeded 100 plattor mm NGM med fläckar på botten och varje sida av plattan (Figur 2A).
Observera: Minst 3 replikat per genotyp måste köras för att få statistiskt signifikanta resultat. - Spot 1 mikroliter 1 M NaN 3 på luktämnen ochkontroll på plats (Figur 2B).
Obs: Använd inte se dina tallrikar med denna förlamande agenten mer än 15 minuter innan analysen, eller NaN 3 kommer diffusa bort från fläckar, och djur kommer att bli förlamad innan den når luktämnen eller fläckar kontroll. Var noga med att inte punktera agar vid tillämpningen NaN 3 eftersom maskar kommer håla i punkterad områden. - Medan maskar är bosätter sig i den koniska röret efter flera M9 buffert tvättar (avsnitt 2), plats 1 mikroliter vardera 95% EtOH och 10% butanon (se avsnitt 7.2) på lämpliga ställen på den markerade analysen plattan (figur 2C) på toppen av de tidigare prickiga NaN 3.
OBS: Kemikalier ska upptäckas innan du lägger maskar (avsnitt 5.4). Anteckna vilken plats har EtOH eller butanon. När man arbetar med dessa flyktiga kemikalier, vara noga med att bara öppna locken på plattorna vid behov och hålla dem stängda vid alla andra tillfällen. - Ta bort så mycket av M9 buffert som möjligt från tub bosatte maskar. Använd en P20 pipetman med en pre-cut spets (se avsnitt 7.3) för att leverera 3X 5 mikroliter maskar (200-400 djur) till ursprunget för den markerade analysen plattan (Figur 2D).
Obs: Håll återstående maskar i 15 ml koniska rör för användning i konditioneringen svälta och analyser minne (§ § 2-4). Maskar kommer att hålla inne pipettspetsar, så att lägga maskar på plattan i mindre kvantiteter sparar din mask befolkningen och minskar mängden vätska som får släppas med maskarna på analysen plattan. - Twist i hörnet av en KimWipe till en liten punkt och använda den för att blot upp överskottet M9 buffert. Detta kommer att frigöra maskar på analysen plattan (Figur 2E).
Obs: Var noga med att inte punktera agar med KimWipe, annars maskar kommer håla i origo. Vissa maskar kan gå förlorat i det här steget som de dras in i KimWipe med M9 bufferten när läskpapper. Om du använder avbildning och analys att räkna maskar (§ 6), ta plattorna till bildbehandling innan du släpper maskar från ursprunget. En bild av maskar i origo omedelbart efter frigivningen kommer att ge det totala antalet djur för en analys tallrik. - Inkubera plattan chemotaxis analysen under 1 timme i rumstemperatur.
- Räkna antalet maskar på ursprung, EtOH och butanon fläckar (figur 2), liksom det totala antalet maskar på analysen plattan.
Observera: I allmänhet kommer maskar förlamad av NaN 3 vara inom en ~ 1 cm radie från fläckar, och visas stick-rak med många djur staplade mot varandra. Om du använder bilder och analysprogram för att räkna maskar (§ 6), ta bilder av ursprung, EtOH, och fläckar butanon. En bild av den totala mängden av maskar borde ha tagits i avsnitt 5.5. Maskar kan också vara "hands-räknas." - Beräkna "chemotaxis Index" (CI). KI = ([(n Butanon) - (n EtOH )]/[( Total-N Origin)].
6. Worm Räkna med bildanalys
- Ta hög kontrast svart-vita bilder av maskar på kemotaxi analys plattor (figur 3a, se avsnitt 7.4 för beskrivning av kamerans inställningar). För att beräkna ett chemotaxis index är bilder behövs vid butanon, EtOH, och ursprung fläckar av en chemotaxis test platta i slutet av en analys, liksom det totala antalet maskar (bild på maskar i ursprungslandet direkt efter att de frigörs från M9 buffert i början av analysen, avsnitt 5.5).
Notera: Bilder av kemotaxi analysen plattorna som täcker ungefär en 2 cm radie runt varje plats i allmänhet fånga alla djur för varje plats. - Se till att filer för alla prövningar av en tidpunkt (t.ex. naiva, 0 tim, etc.) finns i en mapp som heter lämpligt sätt.
- Filer för varje chemotaxis platta måste namnges som sådan: men # png (butanon plats, rättegång #), Ori # png (ursprung, rättegång #), ETH # png (etanol plats, rättegång #), tot # png.... (totalt, rättegång #). (Till exempel, om två försök kördes för en tid punkt, i samma mapp följande filer skulle vara närvarande: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
- Öppna Matlab (se avsnitt 7.5).
- I "Aktuellt Directory" längst upp i Matlab-fönstret, bläddra efter mappar och välj "count_worms_v0.5.3"-mappen (M-filer tillgängliga som kompletterande information).
- I "Command Window", skriv "count_worms_directory ()." Enter.
Obs: Standardinställningen mask storlek när detta kommando är min 10, max 80 pixlar. För att justera detta baserat på en specifik genotyp eller utvecklingsstadiet, typ "count_worms_directory (minSize ', 10' maxSize", 80) "och ändra pixel nummer därefter. - När du uppmanas välja mapp med bilder som skall analyseras.
Obs: Endast en mapp med bilder kan analyseras samtidigt. - Varje bild i mappen som analyseras kommer att dyka upp med en tröskel redan, och partiklar valts (Figur 3A). Dra rektangelverktyget över utvalda partiklar som inte maskar att ta bort eem. När du är klar med bilden, tryck på Esc.
- Efter alla bilder i mappen är markerad kommer 4 kolumner i Command Window: (1) Bildens namn (t.ex. but1), (2) alltid "[1]," (3) genomsnittlig pixelstorlek för en mask som beräknas av programmera viss bild, och (4) Antalet maskar beräknas vara i bilden.
- När programmet är slut, kommer det att sätta in två. CSV-filer (kan öppnas som Excel-kalkylblad) i mappen med bilder har precis analyseras. Den "worm_counts_stats" filen innehåller utdata kolumner som finns i Command Window (avsnitt 6,9). Den "worm_counts_summary" filen innehåller 5 kolumner: (1) rättegång nummer, antalet maskar i (2), men (3) ETH, och (4) Ori fläckar, och (5) Totalt antal maskar.
7. Material Notes
- För att bereda 100 mm hög tillväxt media (HGM) plattor (avsnitt 1): Lös 3 g NaCl, 20 g Bactopeptone, och 30 g Bacto-agar i 700 ml destillerat vatten. Ta volymen till 1 liter med destillerat vatten. Efter autoklavering, svalt agar till 65oC och tillsätt 4 ml 5 mg / ml kolesterol i etanol, 1 ml vardera av 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4, och 25 ml 1 M KPO 4 (pH = 6,0).
- 95% EtOH används, eftersom högre andel EtOH tenderar att innehålla föroreningar från reningsprocessen som kan påverka resultaten. Det är en bra idé att göra 10% butanon (i 95% EtOH) fylla färska varje par gånger analysen körs.
- P20 tips måste ha några millimeter avskurna för att skapa ett hål stort nog för maskar att passa igenom utan att skadas. P1000 tips har redan hål stort nog för maskarna att passa igenom.
- Den chemotaxis analysen plattan bildbehandling (Figur 3B) i Murphy labbet innehåller en Firewire-kamera med en variabel förstoring lins fäst vid en bom stativ. En belysningen är placerad längst ner i foten under en anpassad avbildning plattform med en glasskiva (figur 3C), som tillåter chemotaxis analys plattor att belysas från botten. "Mätning och automatisering" programvara (National Instruments) används för att ta bilder. Material för bildbehandling upprätta liknar de tidigare publicerade, 12 och finns i Tabell över specifika reagenser och utrustning.
8. Representativa resultat:
En typisk naiva chemotaxis index (CI) för vild-typ maskar för 10% butanon är cirka 0,2 (Figur 4A). 6 hopade (1x) eller placerade (7x) utbildning i allmänhet ökar chemotaxis index 0,7-0,8 vid tiden 0 (Figur 4A, CD) för att ge en lärande index (LI = tränade CI -. naiva CI) på ~ 0,6 6 lärande som sker med hopade eller placerade utbildningen är mycket robust. Li på mindre än 0,5 uppstår vanligtvis när det är problem med den naiva chemotaxis analys, och djuren har en naiv konfidensintervall på 0,3 eller högre. Vanligtvis sker detta eftersom maskar svälter eller alltför trångt på odling plattor mellan blekning och början av analysen, eller maskar sitta för länge i M9 buffert mellan tvättar och börjar svälta, miljö lukter kan också öka naiva CI. Svalt maskar har en mycket högre naiv CI för 10% butanon (Figur 4B). 6 Vi finner att problem med naiva chemotaxis allmänhet kan lösas med bättre mask omsorg och odling.
Längden på minnet i dessa analyser är den tid det tar för kemotaxi index direkt efter träning för att återgå till naiva nivåer, då lär index = 0. I vildtyp djur, börjar kortsiktiga associativt minne vanligtvis minska med 1 timme efter hopade utbildning, tar ca 2 timmar och är oberoende av transkriptionsfaktor CREB (Figur 4C). 6 Långfristiga associativt minne vanligtvis inte börjar att avsevärt minska fram till 16 timmar efter placerade träning, varar upp till 40 timmar och är CREB-beroende (Figur 4D) 6 Långfristiga associativt minne kan inte nå sin fulla potential i flera fall: (1). maskar inte har tillräckligt OP50 E. coli under 30-minuters konditionering perioder, (2) bakterier kvar i M9 buffert under svält perioder, eller (3) maskar skadas under analysen (t ex maskar är pipetteras mot sidan av röret).
Resultaten är i allmänhet statistiskt signifikanta när 4 eller fler chemotaxis analys försök körs per genotyp per tidpunkt. Köra sex replikat per genotyp normalt ger mycket goda resultat utan att bli för mycket att hantera, men kan nybörjare vill börja med endast tre replikat. Generellt arbetar med 2-3 genotyper eller villkor samtidigt är bekvämt för dem som är erfarna med dessa inlärning och minne analyser.
Hand-räkna maskar på kemotaxi analys plattor är mycket tidskrävande, kan lägga variabilitet mellan experiment eller kompisar labb, och kan även införa fördomar vid analys och jagnterpreting data. Worm räkna med bildanalys (§ 6) standardiserar datainsamling och analys över hela labbet, och i genomsnitt, skär dataanalys tid för erfarna lab medlemmar till 1 / 5 av vad som krävs för hand räkna. När man jämför chemotaxis index beräknas med hjälp av manuella mask räknas till dem bestäms av Count_worms programvara, finner vi ett medelfel på 3,07 (± 1,19)%.
| Dag 1 | |
| Tid | Steg |
| 09:00 | 1 tim svälta M9 buffert Starta naiva chemotaxis analys |
| 10:00 | Tillstånd # 1 (60 mm NGM tallrikar med mat och butanon), 30 min Avsluta naiva chemotaxis analys |
| 10:30 | Svälta # 1 (60 mm NGM plattor), 30 min |
| 11:00 | Skick # 2, 30 min |
| 11:30 | Svälta # 2, 30 min |
| 12:00 | Skick # 3, 30 min |
| 12:30 | Svälta # 3, 30 min |
| 01:00 | Skick # 4, 30 min |
| 01:30 | Svälta # 4, 30 min |
| 02:00 | Skick # 5, 30 min |
| 02:30 | Svälta # 5, 30 min |
| 03:00 | Skick # 6, 30 min |
| 03:30 | Svälta # 6, 30 min |
| 04:00 | Skick # 7, 30 min |
| 04:30 | Börja 0-hr chemotaxis analys Överföring återstående maskar att hålla plattor för 16-40 timmar |
| 05:30 | Avsluta 0-hr chemotaxis analys |
| Dag 2 | |
| Tid | Steg |
| 08:30 | Börja 16-hr chemotaxis analys |
| 09:30 | Slutet 16-hr chemotaxis analys |
Tabell 1. Representant schema för långsiktig associativt minne analys. I detta exempel, börjar analysen Dag 1 kl 9 med en 1-HR svälta. 30-min kondition och svälta perioder varvas tills maskarna har betingats sju gånger. Chemotaxis analyser körs i början (naiva) och slutet (0 tim) av utbildning. Den totala run-time från start till mål är 8,5 timmar. Worms på is plattor är testade för kemotaxi att butanon börjar på dag 2, 16-40 timmar efter träningen.
Figur 1. Kortfristiga och långfristiga associativt minne analys arbetsflöde. (A) Rekommenderad tidslinje förberedelser som leder fram till dagen analyser utförs. (B) Kortfristiga associativt minne analysen: svultit maskar är betingade i 1 timme och testade genast 1x inlärning (0 min.) Via chemotaxis analyser, eller överförs till att hålla tallrikar med mat för 0,5, 1 eller 2 timmar efter konditionering. (C) Långsiktiga associativt minne analysen: svultit djuren får 7 utbildning block konditionering / svältande innan de testas för lärande eller LTAM 16-40 timmar efter träningen.
Figur 2. Chemotaxis analysen setup. (A) Schematisk bild av kemotaxi analys plattan. Små fläckar läggs till plåten med hjälp av en linjal eller andra vägledande enhet för att markera ursprung (botten) och butanon och EtOH (vänster och höger) fläckar på plattan. (B) 1 mikroliter NaN 3 läggs till butanon och EtOH fläckar. (C) 1 mikroliter vardera 10% butanon och 95% EtOH läggs fläckarna på vänster eller höger sida av plattan. (D) 200-400 maskar suspenderade i M9 buffert läggs till ursprunget av plattan. (E) En KimWipe vridna till en punkt används för att absorbera M9 buffert och maskar släpps ut analysen plattan.
Figur 3. Worm räknar med bildanalys. (A) Exempel på "count_worms_v0.5.3" bild partikel val av fönster. Programmet öppnar ursprungliga hög kontrast svart-vit bild (vänster) automatiskt dyker upp ett fönster med en thresholded bild (mitten). Rektangeln Verktyget kan användas för att markera och eliminera oönskade icke-mask "partiklar", till exempel märken analys plåt (1), kanter platta (2), eller punkteringar agar (3). (B) Bilden av Murphy labbet chemotaxis assay för bildbehandling. Chemotaxis analys plattor belyses från botten för att skapa bilder med hög kontrast som behövs för analys. (C) Schematisk av skräddarsyddaavbildning plattform som används i chemotaxis bildbehandling.
Figur 4. Typisk associativ inlärning och resultat minne. (A) naiva chemotaxis index vildtyp maskar till 10% butanon ökar vid hopade (1x) utbildning. Den lärde Föreningen kräver hopkoppling av mat (OP50 E. coli) och butanon. Siffror ovan staplarna representerar "Lärande Index" (LI = CITrained - CI Naive). (B) vildtyp naiva chemotaxis till 10% butanon är kraftigt förhöjd när maskar är svalt i 16 timmar. Paneler AD är anpassade från Kauffman et al.. 2010 6 (C) vild typ kortsiktiga associativt minne varar ca 2 timmar och är oberoende av transkriptionsfaktor CREB. (D) vildtyp långsiktiga associativt minne varar ca 40 timmar och är CREB-beroende.
Kompletterande information
Discussion
C. elegans lukt associativa inlärning och analyser minne presenteras här skilja mellan processer massangrepp lärande, fördelade inlärning, korttidsminne och långtidsminne. Dessa analyser lita på maskar förmåga att känna av livsmedels-och kemisk lukt i sin miljö 1,2 och bilda positiva associationer mellan de två. 6 Därför analyser är mycket känsliga för svält i startelvan populationen av djur, och stor omsorg måste vidtas för att säkerställa att maskar är väl mat före och efter träning. Enstaka hopade utbildning ger på kort sikt associativt minne. Det ökade antalet konditionering perioder och placerade utbildning paradigm är avgörande för att uppnå långsiktig associativt minne i C. elegans som det är i andra organismer. 6,8 Kanske analys skulle kunna ändras för att producera långvariga minnen av associationer mellan olika betingade och obetingade stimuli.
Vår associativa inlärning och analyser minnet kan användas för att jämföra inlärning och minne kapacitet vildtyp till åldrandet eller genetiska muterade djur. Till exempel är samtidigt både associativ inlärning och långsiktiga associativa förmågor minne nedgång i åldrande vildtyp maskar, är att lära bibehålls längre med åldern hos djur med nedsatt insulin signalering, samt inlärning och minne bevaras längre med åldern i calorically begränsad djur. 6 Dessa analyser är också mottaglig för RNAi behandling eller farmakologisk manipulation av C. elegans. Till exempel, förbättrar behandlingen av maskar med DAF-2 RNAi kort och lång sikt associativt minne, och omvänt, blockering av gentranskription och proteinsyntes med läkemedel (actinomycin D och cykloheximid respektive) under fördelade träning stör långtidsminne formation. 6
Långtidsminnet är en process som är avgörande för överlevnad i alla djur, och det verkar som mycket av det molekylära maskineri som deltar i minnet av en Pavlovian förening är bevarad från maskar till däggdjur. 6 Förmågan att urskilja och testa associativ inlärning, kort sikt och på lång sikt minne med hjälp av dessa lukt-analyser gör C. elegans ett utmärkt system för fortsatta studier av minne, och kan ge insikt i neurodegenerativa processer som leder till förlust av inlärning och minne hos människor.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar W. Ryu för råd om vår första bildhantering set-up, Z. Gitai för förslaget att använda ImageJ 13 att räkna maskar, och J. Ashraf för hjälp med Google SketchUp. CTM är ett Pew Scholar i Biomedicinsk vetenskap, en McKnight Scholar, och en Keck Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).
