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Summary
在这个协议中，我们提出了一个方法来衡量
Abstract
寿命几个遗传途径的生物过程的监管。调查老化生物学的策略之一是研究动物的年龄监管途径的组成部分海港突变。如果这些基因突变的扰动的年龄调控通路的功能，因此改变了整个生物体的寿命，它们提供了重要的机械见解1-3。
另一种策略，以探讨规管的寿命是使用小分子扰乱年龄调控途径。到目前为止，分子数是已知的各种模式生物的寿命延长，并作为工具，用于研究生物老化4-16。因此，确定分子的数量远远相比是很小的遗传“工具集”，是研究衰老的生物学的。
线虫是用于研究，因为其出色的遗传学和短寿命的三个星期老化的原则模型之一。最近， 线虫作为模式生物表型为基础的药物屏幕5,7,16-20由于其体积小，其成长能力微孔板出现。
在这里，我们提出了一个实验来衡量线虫寿命在96孔板。该试剂盒的开发，并成功地用于屏幕延长线虫寿命 7的分子的大型图书馆。在多个测试，检测的可靠性进行了评估：第一，通过测量在不同温度下生长的野生型动物的寿命;第二，通过测量与改变的寿命突变体的寿命;第三，通过测量不同浓度的寿命变化的响应抗抑郁药Mirtazepine。 Mirtazepine先前已被证明寿命延长线虫 7。这些测试的结果表明，该检测是能够复制以前的研究结果从其他实验和定量。微孔板格式，也使得这个寿命检测与自动化液体处理系统兼容，并允许将集成自动化平台。
Protocol
概述：该协议是分割成四个部分。第1部分介绍了如何准备喂食细菌。第2部分介绍了如何编写的蠕虫文化。第3部分介绍了如何得分寿命。第4部分展示了一些有代表性的结果，第5部分介绍了如何准备所需的解决方案。寿命实验需要几个星期才能完成。协议一周的每一步，包括一天，一天的时间，以方便规划。作为整个协议的参考点的L4阶段（0天）。
1。饲喂细菌的制备
本节介绍了准备喂食细菌。具体的大肠杆菌菌株用于饲料线虫被称为OP50。在此协议，与其他细菌的蠕虫文化，以防止交叉污染，已取得OP50应变羧/氨苄西林耐药 21 。预先准备的OP50四到五天。在接触与OP50的所有材料必须是无菌的。
日-7日（星期四）（1周）：接种5毫升一个OP50殖民地，并培育在夜间在37℃一个细菌摇床中的C与含有100微克/ mL氨苄青霉素和0.1微克/毫升两性霉素B的结核病。
日-6日（星期五）（1周）。
上午8:30。早接种，以便有足够的时间为文化达到饱和
- 在300毫升含50μg/ mL氨苄青霉素的结核病OP50 1:2000稀释过夜培养。为8-12小时，细菌在37℃摇床孵育文化，直至达到饱和。不要让文化不再增长超过14小时。
- 转移到无菌的，预加权的离心管OP50。沉淀离心10分钟在3500转的离心机表（2200 XG）OP50。
- 弃上清，重新悬浮在无菌水OP50颗粒和颗粒重新离心。重复洗两次。
- 第二次洗涤后，小心地取出所有剩余的水。没有水，应留在管。称取离心管中的颗粒和减去空离心管的重量，以确定沉淀的重量。
- 重新彻底停止在S -完整的颗粒浓度为100毫克/毫升。应留给无团块。
- 100毫克/毫升OP50的浓度应与2 × 10 10个细菌/ mL的。使用照片的光谱仪来确定每毫升的细菌数量，如果每毫升细菌之间的光密度和数量的关系是已知的。如果有必要，调整OP50喂养的解决方案，以2 × 10 10个细菌/ mL的浓度。
- 商店OP50solution在4 ° C直到蠕虫文化。
2。同步蜗轮文化的制备
本节介绍了编写的蠕虫文化。它的目标是产生一个蠕虫的人口年龄同步。 线虫在接触后，在第5步中的漂白剂治疗的所有材料必须是无菌的。板都保持在20 ° C，除非另有说明。
-6日：周五（1周），下午4:00： 动物转移到一个新的板块
- 以5-10日龄NGM的板大多数蠕虫人口饿死L1幼虫。
- 不久超过本生灯加热消毒金属锅铲。让它冷却。使用冷却铲切出琼脂块板饿死蠕虫。转移到一个新的10厘米NGM板种子与OP50这几大块。孵育约。 65小时在20℃直至蠕虫人口的大多数妊娠的成年人组成。为饿死的L1动物成长为妊娠成人的时间可能会有所不同应变应变。
日-3：周一（2周）上午10:00： 建立同步的人口
- 从10厘米的板收集洗涤他们用5-10毫升无菌水盘蠕虫。转移到15 mL锥形管蠕虫/水溶液。
- 清洗离心2分钟，在台式离心机1200 RPM（280 XG）的蠕虫病毒。弃上清，加入10 mL水。重复。
- 去除上清液，加入5毫升的新鲜配制的漂白剂/氢氧化钠溶液（2.5毫升的家用漂白剂，1毫升10N氢氧化钠，6.5 mL的H 2 O） 。为5分钟，在室温下孵育直到蠕虫破开。务必旋涡轻轻每分钟。监视解剖显微镜下的反应的进展。
- 只要所有的成年人溶解，加5毫升M9的缓冲液中的反应。
- 鸡蛋洗净用10 mL M9的缓冲液，离心2分钟2500转三次（1100 XG）。
- 一旦与洗净的鸡蛋，10毫升的S - 2500 RPM（1100 XG）离心2分钟完成。
- 去除上清，加入10 ml的S -完整的解决方案转移到一个新的50 mL锥形管。新增的S完成30毫升到40毫升的最终体积。在室温下轻轻摇动管nutator或类似设备上过夜。
-2日：星期二（2周），中午12:00： 种子的动物进入板
- 根据解剖范围，检查是否蠕虫在夜间孵化。蠕虫计数的蠕虫数量在10μL，滴，用解剖范围的S -完整的解决方案中确定的浓度。计数每个样品至少10滴。
- 重新暂停集中在80-100蠕虫/毫升的S -完全的蠕虫。添加羧（库存100毫克/毫升）至终浓度为50μg/ mL和两性霉素B（库存250微克/毫升）的一个终浓度为0.1微克/毫升。摇上一个nutator。如果编写的蠕虫病毒数量较多，使用过滤器的第一个600毫升nunclon烧瓶。
- 下午2时30分添加到终浓度为6毫克/毫升（= 1.2 × 10 9菌/毫升）在第1部分准备OP50。返回OP50到4 ° C。
- 传送到每一个96孔板以及120μL的worm/OP50溶液。使用96孔板，用透明的底部。请务必保持悬浮液中的蠕虫，而吹打。
- 密封板，使用胶带封口机，以避免污染和蒸发。摇晃2分钟，在微孔板摇床板，2天在20℃孵育，直到动物到达的L4阶段。
0天：星期四中午十二时前（2周）： 加入Fluorodeoxyuridine消毒动物（FUDR）
- 消毒的动物添加30μL0.6毫米FUDR原液，以每口井。这一步，使每孔终体积为150μL和减少6mg /毫升的OP50终浓度为5 mg / mL的菌（1 × 10 9 /毫升） 。用胶带封口机，封板，握在酶标板振动筛为2-3分钟。如果OP50被添加在下午2时30分-2天，重要的是，FUDR是中午前添加。 20℃培养箱返回板块
第1天：周五（2周）： 添加药物文化
- 上午9:00动物最应该含有妊娠和几个鸡蛋。新增的对寿命的影响是在测试所需浓度的药物。如果药物溶解在DMSO，DMSO的终浓度应不超过0.6％，为二甲基亚砜浓度超过0.6％，缩短线虫寿命。另外的药物后，用胶带封口机密封板和动摇，在酶标板振动筛为2-3分钟。 20℃培养箱返回板块
- 添加的药物，偶尔可以杀死每盘几个动物，特别是如果使用其他溶剂比水。使用倒置显微镜检查动物尸体。一般来说，应低于10％，96孔板中死亡的动物。返回板块到20℃培养箱。
4日：周一（3周）： 更改封口机
- 为了让新鲜的氧气进入文化删除封口机，等待1分钟放回板。摇板为2-3分钟，在微孔板摇床。重复每星期一次。
第5天：周二（3周）： 添加新的OP50，以防止饥饿
- 添加5μL的100毫克/毫升OP50的解决方案，准备在第1部分的96口井，以防止饥饿。
3。评分的寿命。
本节介绍如何生存的第2部分同步蠕虫人口监测，直到动物死亡。要观察的动物在96孔板，用倒置显微镜的2倍或2.5倍的目标。生存记录数据，每周三次，周一，周三和周五。使用运动，以确定是否是活着还是死了的动物。强光照射，尤其是蓝色的光芒，诱使动物移动。不要从实验中删除的死动物。偶尔，不动，并决心在前面的计数死的动物可能会稍后动议。
- 0天，在实验开始计数，每孔总数的蠕虫。审查井包含超过18动物从分析这些水井中的动物不会有足够的OP50，将显示限制饮食的影响。
- 为了增加机会，动物移动撼动96孔板上微孔板摇床2分钟。计数前。
- 在每一个计数，记录会议的日期和动物数量移动作为活的动物。在液体中的运动是比固体培养基上容易得多，并可以由强光引起的。一个更高的放大倍率的使用可能有助于发现咽的一角非常细微的动作。这些细微的动作往往只有在非常古老的动物运动观察。
- 20℃培养箱返回板块
- 重复步骤2-4，每两至三天，直到所有的动物都死了。
4。代表性的成果。
本节说明如何保持这个实验和一些有代表性的结果所产生的寿命数据记录的一个例子。
图1A显示了如何在这个实验中的寿命数据记录的一个例子。一个Excel工作表是用来保持在每口井的人口的生存轨道。每口井的坐标中板，应变，药物，药物浓度和0天，活着的动物总数（x0）是在实验开始记录。记录日期，以及每周三次以按照每口井的不同人群的生存生活和死亡的动物的数量。图中的结果，计算出每一天活着的动物的一小部分和情节，在几天的时间功能。应使用Stata或类似的软件统计软件包计算P值。
线虫中等寿命是取决于温度。图1b显示，寿命取决于温度的变化，准确再现基于微孔板的寿命检测22。同样，微孔板检测再现据报道，寿命从野生型N2动物23-24 25（图1C）不同的突变体寿命的变化。
该试剂盒还可以被用来制造更定量的陈述。 Fig1D平均寿命是绘制Mirtazepine浓度7功能。每个数据点代表7-12人口的平均寿命，每个生活在不同的井。即使每口井的动物的数量是比较低的（5-15动物）的的井 - 井的变化相对较小，因为可以从错误酒吧。
图1：基于微孔板的寿命检测，可精确地再现寿命的变化文献报道。
（一）样本收集的数据在Excel电子表格。在每个计数会议的日期，协调以及录得活的和死的动物的数量。在实验开始时，每口井的动物总数确定。 （二）生存的野生型曲线（N2）动物，生长在20 ° C和25 ° C。 （三）携带株基因突变，影响寿命的生存曲线。所有4株在20 ° C平行测定（四）Mirtazepine治疗氮气动物的剂量响应曲线。平均寿命是绘制Mirtazepine浓度的功能。误差棒表示教统局局长的8％条件井。
5。材料。
M9的缓冲区，1000毫升
- 6克NA 2 HPO 4
- 3克KH 2 PO 4
- 5 g氯化钠
- 0.25克硫酸镁4∙7H 2 O
- 加入去离子水1000毫升。
- 高压灭菌器
Potassiumphosphate缓冲液pH 6.0，1000毫升
- 136克KH 2 PO 4
- 加入去离子水900毫升。
- 5M KOH调整pH值至6.0
- 加入去离子水1000毫升。
- 高压灭菌器
微量金属解决方案
- 1.86克钠2 EDTA
- 0.69克FESO 4∙7H 2 O
- 0.20克MnCl 2∙4H 2 O
- 0.29克硫酸锌4∙7H 2 O
- 0.016克硫酸铜4
- 1000毫升去离子水
- 在黑暗中的高压灭菌器和存储。
S - 1000毫升培养基，
- 5.9 g氯化钠
- 50毫升的1M磷酸钾，pH值6.0
- 1000毫升去离子水
- 高压灭菌器
- 让冷却解决方案，然后添加1毫克/毫升的胆固醇（溶解在ET - OH）毫升。
柠檬酸钾1M，1000毫升
- 268.8克三钾柠檬酸
- 26.3柠檬酸一水柠檬酸
- 加入900毫升去离子水
- 5M KOH调整pH值至6.0
- 加入去离子水1000毫升。
- 高压灭菌器
S -完全培养基，1000毫升
- 977毫升的S -基底
- 10毫升1M柠檬酸钾pH值6（无菌）
- 10毫升的微量金属溶液（无菌）
- 3毫升1M 氯化钙 （无菌）
- 3毫升1M 硫酸镁 （无菌）
NGM琼脂
- 3.0克氯化钠
- 2.5克Pepton（从酪蛋白，胰腺消化）
- 17克琼脂
- 加入去离子水975毫升，搅拌棒
- 高压灭菌器
- 经过高压灭菌降温至55 ° C和添加下列组件：
- 0.5毫升的1M 氯化钙 （无菌）
- 1毫升5毫克/毫升的乙醇中的胆固醇
- 1毫升的1M 硫酸镁 （无菌）
- 25毫升Potassiumphosphate的缓冲液，pH值6.0（无菌）
结核病，1000毫升
- 12克细菌用胰蛋白胨
- 24克酵母提取物
- 4毫升甘油
- 加入900毫升去离子水
- 高压灭菌器
- 经过高压灭菌降温至55 ° C和添加以下组件：
- 加入100毫升0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4
0.6毫米Fluorodeoxyuridine（FUDR，SIGMA猫＃F0503），1000毫升
- 100毫克FUDR
- 溶解在670毫升无菌的S -完备的，10毫升或45毫升分装。
- 储存在-20 ° C。
100毫克/毫升羧，10毫升
- 1克羧
- 10毫升无菌去离子水
- 无菌滤液和等分
- 储存在-20 ° C。
- 在终浓度为50微克/毫升的使用
250ug / mL的两性霉素B，4毫升
- 1mg的两性霉素B
- 4毫升ET - OH
- 储存在-20 ° C
- 使用终浓度在0.1微克/毫升
Discussion
该协议提出让线虫寿命在96孔板的测量。代表性的结果显示部分，可靠地复制以前的研究结果，并提供了定量信息。使用这个实验中，我们已经成功地放映了89000分子， 他们对线虫寿命的影响。
药物筛选的目的，衡量一个96孔微孔板格式的寿命古典固体培养基检测的几个优点。它降低了媒体的准备，孵化空间的数量，以及所需的药量所需的劳动。 96格式和显微镜设置，使整个检测自动化的高通量放映。
多个值，每个变量和组合，在检测的发展及其对线虫寿命的影响进行了测试。这些测试包括不同OP50浓度范围从3至10毫克/毫升（3，4，6，8，10毫克/毫升），每口井的7至45（7，10，15，22，45中的蠕虫病毒的不同数量的蠕虫/孔），不同的文化卷从40到150μL，每孔（40，60，80，100，120，150μL），并在缓冲液成分的变化。如果美联储与羧耐OP50，既不羧也不两性霉素B的浓度表示，发现影响线虫寿命。连续轻轻摇动的板块，往往是线虫液体培养的建议，被发现在本实验中使用的小卷，缺一不可。然而，轻轻摇动，如果要使用较大的井微孔板。该值表示在这个协议中都经过精心挑选的基础统计对比测试条件的不同。
这个实验最令人惊奇的功能可能是线虫可保持在96孔板，用胶带密封。端侧比较没有透露任何启封板养殖动物的寿命的差异，在用塑料袋封口机密封板，或用封口机密封板，使空气的交换。在所有这三个条件，发达的动物非常均匀，从L1到65小时内妊娠成人，并表现出非常相媲美的寿命。上NGM的平行生长的动物发展速度稍快，但这种差异是独立的缺失或封口机的存在。
所提出的协议是基于活的细菌，但死菌可以适应。然而，在液体中检测单一幸存的细菌迅速繁殖并重新填充的文化。在我们的手中，唯一可靠的方式来杀灭细菌，它们可用于液体培养使用范围是由伽玛射线的细菌长期治疗。
寿命实验的规划考虑的一个重要的一点是检测电源。上的影响的大小而定，利息药物的效果，必须在多口井进行测试。 4药物治疗在一个典型的检测和4个控制井，大致对应40-50动物，应该足以检测在寿命增加30％，超过95％的实验。 14％的升幅只有60％的情况下，检测，因此需要更多的复制井。
丰富的寿命这个实验产生的数据可用于开发的实验或应变具体的参数化姜氏模型1。这些姜氏模型是有用的，以确定检测的权力和估计的大型屏幕的误报和底片。我们在盲目的实验验证这些模型的预测，并用他们的估计数字在大屏幕上的假阴性的（未发表结果）。
综上所述，我们预计，法将被大量使用，以确定小分子，延长线虫寿命和研究的基本机制。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个协议最初是由小榄镇叶和迈克尔Petrascheck琳达巴克实验室在西雅图的弗雷德哈钦森癌症研究中心。上面详细的版本已经准备提供更广泛的社会，使整个过程。我们感谢卡罗尔泰勒，萨拉LeBoeuf和安迪Tomacelli批判地阅读协议。这是来自斯克里普斯研究所的手稿＃2866。 Petrascheck实验室是由诺华ADI方案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Calbiochem | cat# 171375 | Also called Fungizone |
| FUDR | Sigma-Aldrich | cat# F0503 | FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water |
| Mianserin | Sigma-Aldrich | M2525-250MG | Use as positive control at 50μM final concentration |
| Cyproheptadine | Sigma-Aldrich | cat#C6022-MG | Alternative positive control at 10 μM final concentration |
| Sealing Tape | Nalge Nunc international | cat# 236370 | Polyester, non-sterile |
| 96 well plate | Falcon BD | cat# 351172 | Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene |
| Nunclon flask | Nalge Nunc international | cat# 178883 | used for large volumes |
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细胞生物学，第49期，高通量筛选，老化，寿命，表型为基础的筛选，药物发现，与年龄有关的疾病Erratum
Formal Correction: Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 05/18/2011.
Citeable Link.
A correction was made to Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. A constituent of the S-complete medium was omitted.
The omitted constituent was:
- 3 ml 1M CaCl2 (sterile)
