Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

doi: 10.3791/2496 Published: March 18, 2011

ERRATUM NOTICE

Summary

في هذا البروتوكول نقدم طريقة لقياس

Abstract

عمر هو عملية بيولوجية التي تنظمها عدة مسارات الوراثية. استراتيجية واحدة للتحقيق في بيولوجيا الشيخوخة في دراسة الحيوانات أن الطفرات في مكونات الميناء من هم في سن التنظيمية المسارات. إذا كانت هذه الطفرات التشويش وظيفة مسار العمر التنظيمية وبالتالي يغير عمر الكائن الحي بأكمله ، لأنها توفر رؤى الآلية الهامة 1-3.

استراتيجية أخرى للتحقيق في تنظيم عمر هو استخدام جزيئات صغيرة لمسارات العمر التنظيمية التشويش. حتى الآن ، وتعرف على عدد من الجزيئات لتمديد عمر الكائنات الحية في نموذج مختلف ، وتستخدم كأدوات لدراسة بيولوجيا الشيخوخة 16/04. عدد من الجزيئات التي تم تحديدها حتى الآن هو صغير مقارنة مع "مجموعة أدوات" الجينية التي تتوفر لدراسة بيولوجيا الشيخوخة.

ايليجانس انواع معينة هي واحدة من حيث المبدأ النماذج المستخدمة لدراسة الشيخوخة بسبب الوراثة الممتازة والعمر قصير من ثلاثة أسابيع. في الآونة الأخيرة ، برز بوصفه الكائن C.elegans نموذجا للشاشات النمط الظاهري يستند 5،7،16-20 المخدرات بسبب صغر حجمها وقدرتها على النمو في لوحات microtiter.

نحن هنا تقديم مقايسة لقياس عمر C.elegans في 96 لوحات microtiter جيدا. كانت تجربة البلدان المتقدمة النمو واستخدمت بنجاح على شاشة كبيرة للمكتبات الجزيئات التي تمتد C.elegans عمر 7. وقد تم تقييم مدى موثوقية مقايسة في اختبارات متعددة : أولا ، عن طريق قياس عمر الحيوانات البرية نوع نمت في درجات حرارة مختلفة ، وثانيا ، من خلال قياس عمر المسوخ مع أعمار تغيير ، وثالثا ، من خلال قياس التغيرات في عمر ردا على تركيزات مختلفة من Mirtazepine المضادة للاكتئاب. Mirtazepine سبق ثبت لتمديد عمر في C.elegans 7. نتائج هذه الاختبارات تبين أن مقايسة غير قادرة على تكرار النتائج السابقة من فحوصات أخرى والكمي. تنسيق microtiter أيضا يجعل هذا الاختبار عمر الآلي متوافقة مع نظم مناولة السائل ، ويتيح الاندماج منصات الآلي.

Protocol

نظرة عامة : يتم تقسيم البروتوكول إلى أربعة أجزاء. الجزء 1 يصف كيفية اعداد البكتيريا التغذية. الجزء 2 توضح كيفية تحضير ثقافة دودة. الجزء 3 يصف كيف ليسجل العمر. الجزء (4) يوضح بعض النتائج التمثيلية ، والباب 5 يصف كيفية إعداد الحلول المطلوبة. تجارب عمر يستغرق عدة أسابيع حتى يكتمل. لكل خطوة من الأسبوع بروتوكول ، يتم تضمين اليوم ، والوقت من اليوم لتسهيل التخطيط. يستخدم المرحلة L4 (يوم 0) كنقطة مرجعية للبروتوكول بالكامل.

1. إعداد تغذية البكتيريا

هذا المقطع يصف إعداد البكتيريا التغذية. وهاء محددة سلالة بكتيريا تستخدم لتغذية C.elegans يسمى OP50. قبل هذا البروتوكول ، لمنع التلوث المتبادل للثقافة دودة مع بكتيريا أخرى ، أحرز سلالة OP50 كربنيسيلين / أمبيسيلين مقاومة 21. إعداد OP50 أربعة إلى خمسة أيام مقدما. يجب على جميع المواد القادمة في اتصال مع OP50 تكون عقيمة.

-7 اليوم : الخميس (الأسبوع 1) : تطعيم 5 مل من حالات السل التي تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل وأمبيسيلين 0.1 ميكروغرام / مل باء الامفوتريسين مع مستعمرة OP50 واحد واحتضان أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية في شاكر البكتيرية.

-6 اليوم : الجمعة (الأسبوع 1).

صباح 8:30. تلقيح في وقت مبكر لاتاحة وقت كاف للوصول إلى ثقافة التشبع

  1. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها من OP50 1:2000 في 300 مليلتر من السل يحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. احتضان الثقافة في لشاكر البكتيرية 8-12 ساعة عند 37 درجة مئوية حتى يتم التوصل الى التشبع. لا تسمح للثقافة أن تنمو أطول من 14 ساعة.
  2. نقل OP50 الى العقيمة ، أنبوب الطرد المركزي قبل المرجح. بيليه وOP50 بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 3500 دورة في الدقيقة (2200 x ج) في أجهزة الطرد المركزي جدول القمة.
  3. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه OP50 في الماء المعقم وإعادة بيليه ، عن طريق الطرد المركزي. كرر هذا يغسل مرتين.
  4. بعد غسل الثاني ، بعناية إزالة جميع المياه المتبقية. لا ينبغي أن يترك الماء في الأنبوب. وزن أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على بيليه وطرح وزن الطرد المركزي أنبوب فارغ من أجل تحديد وزن بيليه.
  5. تماما إعادة تعليق بيليه في S - الكامل لتركيز 100 ملغ / مل. وينبغي أن يترك أي كتل.
  6. وينبغي تركيز OP50 ملغ / 100 مل تقابل البكتيريا 2 10 X10 / مليلتر. استخدام مطياف الصورة لتحديد عدد بكتيريا في كل مليلتر إذا كان من المعروف أن العلاقة بين الكثافة البصرية وعدد من البكتيريا في مليلتر. إذا لزم الأمر ، وضبط تركيز المحلول OP50 تغذية البكتيريا إلى 2 10 X10 / مليلتر.
  7. تخزين OP50solution في 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها للثقافة دودة.

2. إعداد ثقافة دودة متزامن

هذا المقطع يصف إعداد ثقافة دودة. هدفها هو إنشاء عدد السكان في سن متزامن من الديدان. يجب على جميع المواد القادمة في اتصال مع C.elegans بعد العلاج التبييض في الخطوة 5 يكون عقيما. وتحفظ لوحات عند 20 درجة مئوية ما لم يرد خلاف ذلك.

-6 اليوم : الجمعة (الأسبوع 1) ، 4:00 م : نقل الحيوانات إلى لوحة جديدة

  1. تأخذ لوحة 50-10 يوم NGM القديمة التي غالبية سكانها من يرقات دودة يتكون L1 جوعا.
  2. تعقيم ملعقة معدنية عن طريق التسخين على مدى فترة وجيزة من الموقد بنسن. ندعه يبرد. استخدام ملعقة تبريد لقطع قطع أغار من لوحة تحتوي على الديدان جوعا. تحويل عدد من هذه القطع على 10 سم جديدا NGM المصنف اللوحة مع OP50. لاحتضان تقريبا. 65 ساعة عند 20 درجة مئوية حتى الغالبية العظمى من السكان البالغين تتكون من دودة حامل. فربما كان الوقت الذي يستغرقه للحيوانات L1 جوعا حتى تنمو لتصبح الكبار حامل تختلف من سلالة إلى سلالة.

-3 اليوم : الاثنين (الأسبوع 2) 10:00 : وضع السكان متزامن

  1. جمع الديدان من اللوحة 10 سم عن طريق الغسيل لهم قبالة لوحة بالماء المعقم 50-10 مل. نقل حل دودة / المياه في أنبوب 15 مل المخروطية.
  2. غسل الديدان بواسطة الطرد المركزي 2 دقيقة في جهاز للطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة منضدية (280 x ج). تجاهل طاف وإضافة 10 مل من الماء. تكرار.
  3. طاف إزالة وإضافة 5 مل من المبيض الطازجة / هيدروكسيد الصوديوم الحل (2.5 مل التبييض المنزلية ، 1 مل 10N هيدروكسيد الصوديوم ، 6.5 مل من H 2 O). احتضان لمدة 5 دقائق على الديدان RT حتى كسر مفتوح. تأكد من دوامة بلطف كل دقيقة. رصد التقدم المحرز في رد فعل تشريح تحت المجهر.
  4. بمجرد حل جميع البالغين ، إضافة 5 مل من M9 العازلة لتحييد التفاعل.
  5. غسل البيض ثلاث مرات مع 10 مل M9 العازلة التي الطرد المركزي 2 دقيقة في 2500 دورة في الدقيقة (1100 x ج).
  6. غسل البيض مرة واحدة مع 10 مل S - الكامل من جانب الطرد المركزي 2 دقيقة في 2500 دورة في الدقيقة (1100 x ج).
  7. إزالة طاف ، إضافة 10 مل S - الكامل والحل لنقل أنبوب جديد مخروطية 50 مل. إضافة 30 مل من S - كاملة إلى الحجم النهائي من 40 مل. يهز بلطف الأنبوب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على nutator أو جهاز مماثل.

-2 اليوم : الثلاثاء (الأسبوع 2) ، الساعة 12:00 ظهرا : بذور الحيوانات في لوحات

  1. ضمن نطاق تشريح ، والتحقق ما إذا كانت تحاك الديدان خلال الليل. تحديد تركيز الديدان في حل S - كاملة عن طريق حساب عدد الديدان في 10 قطرات ميكرولتر باستخدام نطاق تشريح. عدد لا يقل عن 10 نقاط عن كل عينة.
  2. اعادة تعليق الديدان في تركيز 8-10 الديدان / مل في S - كاملة. إضافة كربنيسيلين (السهم 100 ملغ / مل) إلى التركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل وباء الامفوتريسين (السهم 250 ميكروغرام / مل) إلى التركيز النهائي من 0،1 ميكروغرام / مل. هزة على nutator. إذا إعداد كميات أكبر من الديدان ، واستخدام nunclon 600 مل مع غطاء القارورة التصفية.
  3. الساعة 2:30 مساء إضافة OP50 أعد في الجزء 1 إلى تركيز النهائي من 6 ملغ / مل (= 1.2 X10 البكتيريا 9 / مل). عودة OP50 إلى 4 درجات مئوية.
  4. نقل 120 ميكرولتر من الحل worm/OP50 في كل جانب من 96 لوحة جيدا. استخدام 96 لوحات جيدة مع قاع شفافة. تأكد للحفاظ على الديدان في حين pipetting تعليق.
  5. ختم لوحة باستخدام السداده الشريط لتجنب التلوث والتبخر. هزة لوحة على لوحة microtiter شاكر لمدة 2 دقيقة واحتضان لمدة 2 أيام عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة الحيوانات L4.

0 اليوم : الخميس (الأسبوع 2) قبل الظهر : تعقيم الحيوانات بإضافة Fluorodeoxyuridine (FUDR)

  1. لتعقيم الحيوانات إضافة 30 ميكرولتر من محلول 0.6 مليمتر لكل سهم FUDR جيدا. هذه الخطوة يرتفع حجم النهائي في كل بئر إلى 150 ميكرولتر ويقلل تركيز النهائي من OP50 مل / 6mg إلى 5 ملغ / مل (1x10 البكتيريا 9 / مل). ختم باستخدام لوحة السدادات الشريط والتخلص منه لمدة 2-3 دقيقة على لوحة microtiter شاكر. إذا تم إضافة OP50 الساعة 2:30 يوم -2 ، فمن المهم أن تتم إضافة FUDR قبل الظهر. عودة إلى لوحات الحاضنة 20 درجة مئوية

يوم 1 : يوم الجمعة (الأسبوع 2) : إضافة إلى ثقافة المخدرات

  1. وينبغي أن يكون من قبل 9:00 حامل معظم الحيوانات وتحتوي على العديد من البيض لكل منهما. إضافة الأدوية التي تؤثر على عمر أن يكون اختبارها في التركيز المطلوب. إذا حل المخدرات في DMSO ينبغي أن تركيزات النهائي DMSO لا تتجاوز 0.6 ٪ ، وتركيزات أعلى من DMSO 0.6 ٪ C.elegans تقصير العمر. بعد إضافة المخدرات ، وختم لوحات السداده مع الشريط والتخلص منه لمدة 2-3 دقيقة على لوحة microtiter شاكر. عودة إلى لوحات الحاضنة 20 درجة مئوية
  2. ويمكن إضافة بعض الأحيان المخدرات تقتل عددا قليلا من الحيوانات في لوحة ، وخصوصا في حالة استخدام المذيبات الأخرى من الماء. استخدام المجهر المقلوب للتحقق من الحيوانات النافقة. عموما ، يجب أن يكون هناك أقل من 10 حيوانات نافقة في 96 لوحة جيدا. عودة إلى لوحات الحاضنة 20 درجة مئوية.

اليوم 4 : الاثنين (الأسبوع 3) : تغيير السدادات

  1. للسماح لدخول الاوكسجين النقي الثقافة إزالة السداده ، انتظر 1minute وختم لوحة. هزة لوحة لمدة 2-3 دقائق على لوحة microtiter شاكر. أكرر مرة واحدة كل أسبوع.

يوم 5 : يوم الثلاثاء (الأسبوع 3) : أضف OP50 جديدة لمنع المجاعة

  1. إضافة 5 ميكرولتر من الحل OP50 100 ملغ / مل التي أعدت في إطار كل من 1 إلى 96 آبار لمنع المجاعة.

3. التهديف من العمر.

هذا المقطع يصف كيف يتم رصد بقاء السكان دودة متزامنة من الباب 2 حتى الحيوانات ماتت. لمراقبة الحيوانات في لوحات 96 أيضا ، استخدام المجهر المقلوب مع الهدف 2X أو 2.5x. بيانات السجل بقاء ثلاث مرات في الأسبوع ، الاثنين والاربعاء والجمعة. استخدام الحركة لتحديد ما إذا كانت هذه الحيوانات على قيد الحياة أو ميتا. ضوء قوي ، وخصوصا الضوء الأزرق ، الحث على الحيوانات على التحرك. لا تقم بإزالة الحيوانات النافقة من الفحص. أحيانا ، قد الحيوانات التي لم تتحرك وحددت عدد القتلى في السابق نقل في وقت لاحق.

  1. في اليوم 0 ، في بداية التجربة احصاء عدد الديدان في كل بئر. وفرض رقابة على الآبار التي تحتوي على أكثر من 18 حيوانا من التحليل والحيوانات في هذه الآبار لا نملك ما يكفي من OP50 وسوف تظهر آثار قيود الغذائية.
  2. من أجل زيادة فرصة أن الحيوانات تحرك الصفيحة يهز جيدا على 96 لوحة microtiter شاكر لمدة 2 دقيقة. قبل الفرز.
  3. في تاريخ كل دورة العد السجل ، وعدد من الحيوانات التيكما نقل الحيوانات الحية. الحركة في السائل هو أسهل بكثير من التركيز على وسائل الاعلام الصلبة ، ويمكن أن يسببها أضواء قوية. يجوز للاستخدام أعلى التكبير تساعد على بقعة حركات خفية جدا مثل تلك التي غيض من البلعوم. تحركات خفية غالبا ما تكون هذه الحركة الإسلامية الوحيدة التي لوحظت في الحيوانات قديمة جدا.
  4. عودة إلى لوحات الحاضنة 20 درجة مئوية
  5. كرر الخطوة 2-4 كل يومين أو ثلاثة أيام حتى كل الحيوانات الميتة.

4. ممثل النتائج.

ويبين هذا القسم مثالا على كيفية الاحتفاظ بسجلات للبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة عمر هذا الاختبار وبعض النتائج التمثيلية.

ويبين الشكل 1A مثالا على كيفية تسجيل البيانات خلال عمر هذا الاختبار. يستخدم ورقة التفوق لتعقب بقاء السكان في كل بئر. لكل بئر انها تنسق في لوحة ، والسلالة ، والمخدرات ، والتركيز على المخدرات وعدد من الحيوانات على قيد الحياة في اليوم 0 (X0) يتم تسجيلها في بداية التجربة. تاريخ السجل ، فضلا عن عدد من الحيوانات النافقة والحية ثلاث مرات في الأسبوع من أجل متابعة لبقاء السكان المختلفة في كل بئر. الرسم البياني للنتائج ، وحساب نسبة ضئيلة من الحيوانات على قيد الحياة لكل يوم ، ومؤامرة على أنها وظيفة من الزمن في غضون أيام. ينبغي أن يحسب ف القيم باستخدام الحزم الإحصائية STATA أو مثل برامج مماثلة.

عمر متوسط ​​من C.elegans تعتمد درجات الحرارة. 1B الرقم يدل على ان تستنسخ بدقة التغيرات في درجات الحرارة التي تعتمد في عمر من عمر microtiter تستند مقايسة 22. وبالمثل ، فإن لوحة مقايسة microtiter يستنسخ التغييرات في عمر من المسوخ وذكرت أن أعمار التي تختلف عن الحيوانات البرية N2 نوع 23-24 25 (الشكل 1C).

في مقايسة يمكن أن تستخدم أيضا في الإدلاء ببيانات أكثر الكمي. في متوسط ​​عمر Fig1D يتم رسم كدالة للتركيز Mirtazepine 7. كل نقطة بيانات يمثل متوسط ​​عمر السكان 7-12 ، ولكل الذين يعيشون في مختلف أيضا. على الرغم من أن عدد الحيوانات لكل بئر منخفض نسبيا (5-15 الحيوانات) التباين جيدا إلى جانب صغير نسبيا ويمكن أن ينظر إليه من أشرطة الخطأ.

الشكل 1
الشكل 1. microtiter لوحة تستند عمر مقايسة تستنسخ بدقة التغيرات في طول العمر وذكرت في الأدبيات.
(أ) نموذج البيانات التي تم جمعها في جداول اكسل. خلال كل تاريخ الدورة العد ، والتنسيق من البئر ، وسجلت عدد من الحيوانات الحية والميتة. في بداية التجربة ، تم تحديد عدد من الحيوانات في كل بئر. (ب) منحنى البقاء على قيد الحياة البرية من نوع (N2) الحيوانات نمت عند 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية. منحنيات البقاء على قيد الحياة (ج) من سلالات تحمل الطفرات التي تؤثر على الحياة. ويعاير جميع سلالات الأربعة في موازية في 20 درجة مئوية. (د) منحنى الاستجابة للجرعة من Mirtazepine N2 الحيوانات المعالجة. يتم رسم يعني عمر كدالة للتركيز Mirtazepine. أشرطة الخطأ تشير إلى SEM من 8 آبار في الشرط.

5. المواد.

M9 العازلة ، 1000 مل

  • ز نا 6 4 2 هبو
  • 3 ز KH 2 PO 4
  • 5 غم كلوريد الصوديوم
  • ز 0.25 MgSO 4 ∙ 7H 2 O
  • يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1000 مل
  • الأوتوكلاف

Potassiumphosphate 6.0 درجة الحموضة عازلة ، 1000 مل

  • 136 ز KH 2 PO 4
  • يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 900 مل
  • ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 مع KOH 5M
  • يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1000 مل
  • الأوتوكلاف

تتبع المعادن الحل

  • 1.86 ز نا 2 EDTA
  • ز 0.69 FeSO 4 ∙ 7H 2 O
  • ز 0.20 MnCl 2 ∙ 4H 2 O
  • ز 0.29 ZnSO 4 ∙ 7H 2 O
  • كبريتات النحاس 0.016 ز 4
  • 1000 مل ماء منزوع الأيونات
  • الأوتوكلاف وتخزينها في الظلام.

S - القاعدية المتوسطة ، 1000 مل

  • 5.9 غرام كلوريد الصوديوم
  • 50 مل من الفوسفات البوتاسيوم 1M ، 6.0 درجة الحموضة
  • 1000 مل ماء منزوع الأيونات
  • الأوتوكلاف
  • اسمحوا الحل بارد ثم أضف 1 مل من الكوليسترول 5mg / مل (المنحلة في ET - OH).

سيترات البوتاسيوم 1M ، 1000 مل

  • ز 268.8 سيترات tripotassium
  • 26.3 مونوهيدرات حامض الستريك
  • إضافة 900 مل من الماء منزوع الأيونات
  • ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 مع KOH 5M
  • يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1000 مل
  • الأوتوكلاف

S - الكامل المتوسطة ، 1000 مل

  • 977 مل S - القاعدية
  • 10 مل سيترات البوتاسيوم 1M الحموضة 6 (العقيمة)
  • 10 مل حل تتبع المعادن (العقيمة)
  • 3 مل 1M CaCl 2 (العقيمة)
  • 3 مل 1M MgSO 4 (العقيمة)

NGM آغار

  • 3.0g كلوريد الصوديوم
  • 2.5G Pepton(من الكازين والبنكرياس هضم)
  • 17g آجار
  • يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 975 مل وبار التحريك
  • الأوتوكلاف
  • بعد التعقيم تبرد إلى 55 درجة مئوية وإضافة العناصر التالية :
    • 0.5 مل من 1M CaCl 2 (العقيمة)
    • 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم 5mg / مل في الإيثانول
    • 1 مل من 1M MgSO 4 (العقيمة)
    • 25 العازلة Potassiumphosphate مل ، 6.0 درجة الحموضة (العقيمة)

السل ، 1000 مل

  • 12G Bacto تريبتون
  • استخراج 24 ز الخميرة
  • 4 مل الجلسرين
  • إضافة 900 مل من الماء منزوع الأيونات
  • الأوتوكلاف
  • بعد التعقيم تبرد إلى 55 درجة مئوية وإضافة العنصر التالي :
    • إضافة 100 مل من بريد 0.17M KH 2 4 / 2 0.72MK هبو 4

0.6 مم Fluorodeoxyuridine (FUDR ، سيغما القط # F0503) ، 1000 مل

  • 100 ملغ FUDR
  • تذوب في 670 مل العقيمة S - الشامل ، وجعل 10 مل أو 45 مل aliquots.
  • المحل في -20 درجة مئوية.

100 ملغ / كربنيسيلين مل ، 10 مل

  • 1 غرام كربنيسيلين
  • 10 مل ماء منزوع الأيونات معقمة
  • رشاحة العقيمة وقسامة
  • المحل في -20 درجة مئوية.
  • استخدام بتركيز نهائي من 50 ميكروغرام / مل

250ug / مل الامفوتريسين B و 4 مل

  • 1mg الامفوتريسين B
  • 4 مل ET - OH
  • المحل في -20 درجة مئوية
  • استخدام بتركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / مل

Discussion

قدمت بروتوكول يسمح بقياس عمر C.elegans في 96 لوحات microtiter جيدا. كما هو مبين في نتائج ممثل القسم أن يعيد موثوق النتائج السابقة ، ويوفر معلومات كمية. باستخدام هذا الاختبار وفحص أكثر من 89000 نجحنا جزيئات من حيث تأثيرها على عمر C.elegans.

لغرض فحص المخدرات ، وقياس عمر في 96 لوحة تنسيق جيد microtiter ديها العديد من المزايا خلال فحص وسائل الاعلام الصلبة الكلاسيكية. أنه يقلل من العمالة المطلوبة لإعداد وسائل الإعلام ، مقدار المساحة الحضانة ، وكمية المخدرات المطلوبة. شكل 96 - جيدا والإعداد المجهري تسمح أتمتة فحص كامل للعروض إنتاجية عالية.

خلال تطوير فحص قيم متعددة لكل متغير وخليط منها واختبارها لآثارها على عمر C.elegans. وشملت هذه الاختبارات OP50 تركيز مختلفة تتراوح من 3 إلى 10 ملغ / مل (3 ، 4 ، 6 ، 8 ، 10 ملغ / مل) ، عدد من الديدان المختلفة لكل بئر تتراوح بين 7 إلى 45 (7 ، 10 ، 15 ، 22 ، 45 الديدان / جيد) ، وأحجام مختلفة تتراوح الثقافة 40-150 ميكرولتر لكل بئر (40 ، 60 ، 80 ، 100 ، 120 ، 150 ميكرولتر) ، والتغيرات في تركيبة العازلة. إذا تم العثور على تغذية مع OP50 كربنيسيلين المقاوم ، لا كربنيسيلين ولا باء الامفوتريسين في تركيزات اشارت الى تؤثر C.elegans العمر. تم العثور على الهز المستمر لطيف من لوحات ، على النحو الموصى به في كثير من الأحيان في الثقافة C.elegans السائل ، والاستغناء عن وحدات التخزين الصغيرة المستخدمة في هذا الاختبار. تهتز لطيف ولكن إذا كان هناك حاجة لوحات microtiter مع أكبر الآبار لاستخدامها. وأشار القيم في هذا البروتوكول قد تم اختيارها بعناية على أساس المقارنة الإحصائية لظروف مختلفة اختبارها.

الميزة الأكثر إثارة للدهشة من هذا الاختبار هو على الأرجح أنه يمكن الاحتفاظ C.elegans في 96 لوحات جيدا أن ومختومة بالشمع. لم جنبا إلى جنب مقارنات لم تكشف عن أي اختلاف في عمر الحيوانات المستزرعة في لوحات تفض ، في لوحات مختومة مع السداده البلاستيك ، أو في لوحات مختومة مع السدادات التي تتيح تبادل الهواء. في جميع الحالات الثلاث ، وضعت الحيوانات متجانس جدا من L1 حامل للبالغين في غضون 65 ساعة وأظهرت أعمار مماثلة للغاية. وضعت الحيوانات نمت بالتوازي على NGM أسرع قليلا ، ولكن هذا الاختلاف كان مستقلا من غياب أو وجود السداده.

ويستند البروتوكول عرضت على البكتيريا الحية ، ولكن يمكن تكييفها للبكتيريا ميتة. ومع ذلك ، في فحص السائل يمكن لبكتيريا واحدة على قيد الحياة تتكاثر بسرعة وإعادة ملء الثقافة. في أيدينا ، والطريقة الوحيدة التي يعول عليها لقتل البكتيريا إلى حد أنه يمكن استخدامها للثقافة السائل هو عن طريق العلاج لفترات طويلة من البكتيريا مع أشعة غاما.

نقطة واحدة من المهم النظر في التخطيط لتجربة عمر هي قوة الكشف. اعتمادا على حجم التأثير ، لا بد من اختبار تأثير المخدرات من اهتمام في آبار متعددة. في مقايسة 4 نموذجية للأدوية المعالجة ومراقبة الآبار 4 ، الموافق 40-50 تقريبا كل الحيوانات ، يجب أن يكون كافيا للكشف عن زيادة بنسبة 30 ٪ في عمر في أكثر من 95 ٪ من التجارب. يتم الكشف عنها إلا زيادة قدرها 14 ٪ في 60 ٪ من الحالات ، وبالتالي تتطلب المزيد من الآبار تكرار.

ويمكن استخدام ثروة من البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة عمر هذا الاختبار لتطوير تجربة أو سلالة معينة من النماذج إن السفارة parametrical 1. هذه النماذج إن السفارة هي مفيدة لتحديد قوة الكشف وتقدير عدد من ايجابيات وسلبيات كاذبة على نطاق واسع الشاشات. علينا التحقق من التوقعات من هذه النماذج في التجارب الأعمى واستخدموه لتقدير أعداد من السلبيات كاذبة في شاشات كبيرة (نتائج غير منشورة).

باختصار ، نحن نتوقع أن يقدم مقايسة سيكون ذات فائدة كبيرة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تمتد من عمر C.elegans ودراسة الآليات الكامنة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وضعت أصلا من هذا البروتوكول في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل ويي Xiaolan Petrascheck مايكل في مختبر ليندا باك. وقد أعد هذا الإصدار المفصلة أعلاه إلى اتخاذ جميع الإجراءات المتاحة للالمجتمع الأوسع. نشكر كارول تايلور ، LeBoeuf سارة وTomacelli اندي لقراءة نقدية للبروتوكول. هذا المخطوط # 2866 من معهد سكريبس للأبحاث. ويتم تمويل مختبر Petrascheck بواسطة برنامج ADI نوفارتيس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Calbiochem cat# 171375 Also called Fungizone
FUDR Sigma-Aldrich cat# F0503 FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin Sigma-Aldrich M2525-250MG Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine Sigma-Aldrich cat#C6022-MG Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape Nalge Nunc international cat# 236370 Polyester, non-sterile
96 well plate Falcon BD cat# 351172 Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask Nalge Nunc international cat# 178883 used for large volumes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, T. E. Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging. Science. 249, 908-912 (1990).
  2. Kenyon, C. J. The genetics of ageing. Nature. 464, 504-512 (2010).
  3. Finch, C. E., Ruvkun, G. The genetics of aging. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).
  4. Wilson, M. A. Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5, 59-68 (2006).
  5. Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, 258-262 (2005).
  6. McColl, G. Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).
  7. Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 553-556 (2007).
  8. Srivastava, D. Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans. Biogerontology. 9, 309-316 (2008).
  9. Wood, J. G. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, 686-689 (2004).
  10. Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 7, 305-317 (2008).
  11. Onken, B., Driscoll, M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).
  12. Wu, Z. Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).
  13. Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).
  14. Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 11, 45-52 (2010).
  15. Melov, S. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, 1567-1569 (2000).
  16. Benedetti, M. G. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).
  17. Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings. Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).
  18. Kwok, T. C. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
  19. Moy, T. I. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).
  20. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  23. Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).
  24. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
  25. Lakowski, B., Hekimi, S. Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes. Science. 272, 1010-1013 (1996).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 05/18/2011. Citeable Link.

A correction was made to Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. A constituent of the S-complete medium was omitted.

The omitted constituent was:

  • 3 ml 1M CaCl2 (sterile)
قياس<em> انواع معينة ايليجانس</em> الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (49), e2496, doi:10.3791/2496 (2011).More

Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (49), e2496, doi:10.3791/2496 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter