Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Published: March 18, 2011 doi: 10.3791/2496
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 2Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu protokolü biz ölçmek için bir yöntem mevcut.

Abstract

Ömrü birkaç genetik yollar tarafından düzenlenen bir biyolojik süreçtir. Yaşlanma biyolojisi araştırmak için bir strateji hayvanları çalışma olduğunu yaşa düzenleyici yolların bileşenleri liman mutasyonlar. Eğer bu mutasyonlar karıştırmayı yaş düzenleyici yolun fonksiyonu ve bu nedenle tüm organizmanın ömrü değiştirmez, onlar önemli mekanistik anlayışlar 1-3 sağlar.

Ömrü düzenlenmesi araştırmak için başka bir strateji karıştırmayı yaşa düzenleyici yollarda küçük moleküller kullanmaktır. Bugüne kadar bir dizi, moleküllerin çeşitli model organizmalarda ömrü uzatmak için bilinen ve yaşlanma 4-16 biyolojisi okumak için bir araç olarak kullanılır. Tespit moleküllerinin sayısı şimdiye kadar yaşlanma biyolojisi okumak için kullanılabilir genetik "araç seti" ile karşılaştırıldığında küçük.

Caenorhabditis elegans mükemmel genetik ve üç hafta gibi kısa ömrü nedeniyle yaşlanma çalışma prensibi modelleri biridir. Daha yakın zamanlarda, C.elegans, çünkü onun küçük boyutu ve microtiter plakalar büyümeye yeteneğini fenotip bazlı ilaç ekranlar 5,7,16-20 için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır .

Burada 96 microtiter plakalar C.elegans ömrünü ölçmek için bir test sunuyoruz. Testin geliştirilen ve C.elegans ömrü 7 uzatmak molekülleri için büyük kütüphaneler ekrana başarıyla kullanılmıştır. Birden fazla testleri testinin güvenilirliği değerlendirildi: Önce, farklı sıcaklıklarda yetiştirilen vahşi tip hayvanların ömrünü ölçerek, ikinci, değişen yaşam süresini mutantlar ömrü ölçerek, üçüncü, farklı konsantrasyonlarda yanıt olarak ömrü değişiklikleri ölçerek antidepresan Mirtazepine. Mirtazepine daha önce C.elegans 7 ömrünü uzatmak için gösterilmiştir . Bu testlerin sonuçları, testin diğer testleri önceki bulguları çoğaltmak mümkün ve kantitatif olduğunu göstermektedir. Mikrotiter biçimi de bu ömrü testi otomatik sıvı taşıma sistemleri ile uyumlu hale getirir ve otomatik platformları entegrasyon sağlar.

Protocol

Bakış: protokol dört bölümden ayrılmıştır. Bölüm 1 beslenme bakteri nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 2, solucan kültürü nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 3 ömrü puanı nasıl açıklamaktadır. Bölüm 4, bazı temsilcisi sonuçları gösterir ve Bölüm 5, gerekli çözümler hazırlamak anlatılmaktadır. Ömrü deneyleri tamamlamak için birkaç hafta sürebilir. Protokol haftanın her adım için, gün ve günün zamanı planlama kolaylaştırmak için yer almaktadır. (Gün 0) L4 aşamasında tüm protokol için referans noktası olarak kullanılır.

1. Besleme Bakteriler hazırlanması

Bu bölümde, beslenme bakterilerin hazırlık açıklamaktadır. Özel E. coli OP50 denir C.elegans beslemek için kullanılan suşu. Diğer bakterilerin solucan kültürüne çapraz bulaşmasını önlemek için bu protokol, önce, OP50 gerginlik Carbenicillin / ampisilin dirençli 21 yapılmıştır. OP50 4-5 gün önceden hazırlayın. OP50 ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır.

-7 Gün: Perşembe (1. hafta): 5 ml, 37 gece boyunca bir tek OP50 kolonisi ve inkübe ° C bakteriyel bir çalkalayıcı 100 mg / ml ampisilin ve 0,1 mg / ml Amfoterisin B içeren TB İnokülasyon .

Gün -6: Cuma (hafta 1).

Sabah 08:30. Kültür için yeterli süre doygunluk ulaşmak için izin vermek için erken İnokülasyon

  1. 50 mcg / ml ampisilin içeren 300 mL TB OP50 1:2000 gecelik kültür sulandırınız. Doygunluk ulaştı kadar 37 8-12 saat bir bakteri çalkalayıcı ° C kültür inkübe edin. Kültür 14 saatten daha uzun büyümek için izin vermeyin.
  2. OP50, ön ağırlıklı steril bir santrifüj tüpü içine aktarın. Pelet bir masa üstü santrifüj 3500 rpm (2200 xg) 10 dakika süreyle santrifüj OP50.
  3. Süpernatantı atın ve steril su içinde yeniden askıya OP50 pelet ve santrifüj yoluyla yeniden pelet. Bu yıkama iki kez tekrarlayın.
  4. İkinci yıkamadan sonra, kalan suyun dikkatli bir şekilde kaldırın. Tüp su bırakılmalıdır. Pelet içeren santrifüj tüpü tartılır ve pelet ağırlığı belirlemek için, boş santrifüj tüp ağırlığı çıkarma.
  5. 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyon iyice S-komple pelet yeniden askıya. Hiçbir kümeleri bırakılmalıdır.
  6. 100 mg / ml OP50 2 x10 10 bakteri / ml konsantrasyonu uygun olmalıdır. ML başına bakteri optik yoğunluk ve sayı arasındaki ilişki biliniyorsa mL başına bakteri sayısını belirlemek için bir fotoğraf spektrometre kullanın. Gerekirse, OP50 besleme çözüm 2 x10 10 bakteri / ml konsantrasyon ayarlayın.
  7. 4 OP50solution Mağaza ° C kadar solucan kültürü için kullanılır.

2. Senkron Worm Kültür hazırlanması

Bu bölümde, solucan kültürünün hazırlanması açıklamaktadır. Onun hedefi, solucanlar bir yaş eşzamanlı nüfus üretmek için. , Çamaşır suyu tedavisinden sonra 5. adımda C.elegans ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır . Plakalar 20 ° C sürece aksi belirtilmedikçe tutulur.

Gün -6: Cuma (hafta 1), 16:00: yeni bir plaka Transfer hayvanlar

  1. Solucan nüfusunun çoğunluğu açlıktan L1 larvaları oluşan bir 5-10 gün eski NGM plaka atın.
  2. Bunsen beki üzerinden kısa bir süre ısıtılması ile metal bir spatula sterilize edin. Soğumasını bekleyin. Hasret solucanları içeren plaka agar parçaları kesip soğutmalı spatula kullanın. OP50 ile taze bir 10 cm NGM plaka numaralı seribaşı üzerine bu parçaları birkaç aktarın. Yaklaşık inkübe edin. 65 saat 20 ° C kadar solucan nüfusunun çoğunluğu gravid yetişkin oluşur. Gravid yetişkin içine büyümeye hasret L1 hayvanlar için gereken zaman zorlanma zorlanma değişebilir.

Gün -3: Pazartesi (2. hafta) saat 10:00: senkron bir nüfusun oluşturulması

  1. 5-10 ml steril su ile plaka yıkayarak 10 cm plaka solucanları toplayın. Solucan / su solüsyonu 15 ml konik bir tüp içine aktarın.
  2. 1200 rpm (280 xg) bir masaüstü santrifüj 2 dakika santrifüj solucanlar yıkayın. Süpernatant atın ve 10 ml su ekleyin. Tekrarlayın.
  3. Süpernatantı ve taze hazırlanan çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (2.5 ml çamaşır suyu, 1 ml 10N NaOH, 6.5 ml H 2 O) 5 ml ekleyin. Solucanların açık ara kadar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Her dakika hafifçe vorteks için emin olun. Diseksiyon mikroskobu altında reaksiyon ilerleme izleyin.
  4. En kısa sürede çözülür tüm yetişkinler gibi tepki nötralize etmek için M9 tampon 5 ml ekleyin.
  5. (2500 rpm'de 2 dakika santrifüj yumurta 10 ml M9 tamponu ile üç kere yıkayın1100 xg).
  6. Aynı yumurta yıkayın 10 ml G-tam 2500 rpm (1100 xg) 2 dk santrifüj.
  7. Süpernatantı, 10 ml S-tam ve taze bir 50 ml konik tüp çözüm transfer. S-tam 30 ml, 40 ml nihai hacmi ekleyin. Nutator veya benzeri bir cihaz, oda sıcaklığında yavaşça gecede tüp sallamak.

-2 Gün: Salı (2. hafta), 12:00: Tohum tabak içine hayvanlar

  1. Diseksiyon kapsamında, solucanlar, gece boyunca yumurtadan olmadığını kontrol edin. Diseksiyon kapsamı kullanarak 10 mcL damla solucanlar sayısı sayarak S-komple bir çözüm solucanlar konsantrasyonu belirleyin. Her bir numune için en az 10 damla güvenin.
  2. 80-100 solucanlar / mL S-tam bir konsantrasyon solucanlar yeniden askıya aldı. Carbenicillin (stok 100 mg / ml) 0.1 mg / ml bir final konsantrasyon son konsantrasyonu 50 mcg / mL ve Amfoterisin B (stok 250 mcg / mL) ekleyin. Bir nutator çalkalayınız. Solucanlar büyük miktarlarda hazırlanması, filtre kapağı ile 600 mL nunclon şişesi kullanın.
  3. 02:30 nihai konsantrasyonu 6 mg / ml (= 1.2 x10 9 bakteri / ml) Bölüm 1 hazırlanan OP50 ekleyin. Geri dön OP50 4 ° C
  4. 96 plaka her kuyuya 120 mcL worm/OP50 çözüm aktarın. Şeffaf bir alt 96 kuyucuğu kullanın. Pipetleme süre askıya solucanlar tutmak için emin olun.
  5. Kontaminasyon ve buharlaşmasını önlemek için bir bant macunu kullanarak plaka Seal. 2 dakika süreyle mikrotiter plate çırpıcısı plaka Shake ve hayvanlar L4 sahne ulaşana kadar 2 gün 20 ° C'de inkübe edin.

Gün 0: Perşembe (2. hafta) öğleden önce: Fluorodeoxyuridine ekleyerek hayvanlar sterilize (FUDR)

  1. Hayvanların her kuyuya 0.6 mM FUDR stok solüsyonu 30 mcL sterilize etmek. Bu adım, her bir kuyunun 150 mcL son hacmi getiriyor ve 5 mg / ml (1x10 9 bakteri / ml) 6 mg / ml OP50 nihai konsantrasyonu azaltır . Mühür ve plaka bant Avcılar kullanarak bir mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. OP50 -2 gün 2:30 'da eklendi, FUDR, öğleden önce eklendi olması önemlidir. 20 ° C inkübatör plakaları dön

1. Gün: Cuma (hafta 2): kültürüne ilaç

  1. By 9:00 am hayvanların en gravid ve birkaç yumurta her içermelidir. Olan etkisi ömrü istenilen konsantrasyonda test edilmesi ilaçlar ekleyin. DMSO uyuşturucu çözme Eğer DMSO son konsantrasyonları,% 0.6 C.elegans ömrünü kısaltır DMSO konsantrasyonlarda daha yüksek olarak,% 0.6 'dan fazla olmamalıdır. Ilacın eklenmesinden sonra, bant macun plakaları ve mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. 20 ° C inkübatör plakaları dön
  2. Ilaçların eklenmesi, özellikle su dışında diğer bir çözücü kullanarak, zaman zaman, plaka başına birkaç hayvanları öldürebilir. Inverted mikroskop, ölü hayvanları kontrol etmek için kullanın. Genel olarak, 96 plaka başına en az 10 ölü hayvanlar olması gerekir. 20 ° C inkübatör plakaları geri dön.

4. Gün: Pazartesi (hafta 3): Değişim Avcılar

  1. Taze oksijen mühürleyen kaldırmak kültür girmek için izin vermek için, 1 dakika bekleyin ve plaka yeniden mühürlemek. Mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika plaka çalkalayınız. Haftada bir kez tekrarlayın.

5. Gün: Salı (3 hafta): açlık önlemek için yeni OP50 ekle

  1. 96 kuyu açlık önlemek için her bölüm 1 hazırlanan 100 mg / ml OP50 çözüm 5 mcL ekleyin.

3. Ömrü, Puanlama.

Bu bölümde, Bölüm 2 senkronize solucan nüfusun yaşam hayvanlar ölene kadar nasıl izlenir açıklamaktadır. 96 kuyucuğu hayvanları gözlemlemek için, 2x veya 2.5x objektif bir inverted mikroskop kullanın. Kayıt sağkalım verileri haftada üç kez, Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri. Hareket hayvanların canlı ya da ölü olup olmadığını belirlemek için kullanın. Güçlü ışık, özellikle de mavi ışık taşımak için hayvanların neden olur. Testte ölü hayvanlar çıkarmayın. Bazen, hayvanların hareket etmedi ve bir önceki sayısında ölü tespit edildi, daha sonra üzerinde hareket edebilir.

  1. 0 gün, deney başında solucanlar her kuyuda toplam sayısını. Bu kuyulardan hayvan olarak analiz fazla 18 hayvan içeren kuyu sansür yeterli OP50 olmaz ve diyet kısıtlaması etkilerini gösterecektir.
  2. Hayvanların hareket ettiğini, 2 dakika süreyle mikrotiter plate çalkalayıcı 96 plaka sallamak şansını artırmak için. önce sayma.
  3. Her sayma oturumda, kayıt tarih ve hayvanların sayısı.canlı hayvan olarak hareket ettirin. Sıvı hareket katı ortam üzerinde çok daha kolay ve güçlü ışıkları ile uyarılabilir. Daha yüksek bir büyütme yutak ucu gibi çok ince hareketler nokta yardımcı olabilir. Bu ince hareketler, sık sık çok yaşlı hayvanlarda görülen tek hareket.
  4. 20 ° C inkübatör plakaları dön
  5. Tüm hayvanların ölü kadar 2-3 günde bir 2-4 adım tekrarlayın.

4. Temsilcisi Sonuçlar.

Bu bölüm, bu testte ve bazı temsilcisi sonuçları tarafından oluşturulan ömrünü veri kayıtlarını tutmak nasıl bir örnek gösterir.

Şekil 1A Bu testte sırasında ömrü veri kaydetmek için nasıl bir örnek gösterir. Bir excel sayfasına her kuyuda nüfusun hayatta kalma izlemek için kullanılır. Her iyi plakasını koordine, gerilme, ilaç, ilaç konsantrasyonu ve 0 gün canlı hayvanların toplam sayısı (X0) Deneyin başında. Kayıt tarihi yanı sıra, her bir kuyu içinde çeşitli toplumlarda hayatta takip edebilmek için bir hafta, canlı ve ölü hayvan sayısının üç katı. Sonuçları grafik için, her gün için canlı hayvanların kısmını hesaplamak ve gün içinde zamanın bir fonksiyonu olarak arsa. P-değerleri STATA ya da benzer bir yazılım gibi istatistiksel paketleri kullanılarak hesaplanmalıdır.

C.elegans, orta ömrü sıcaklığa bağlıdır. Şekil 1B ömrü sıcaklık bağımlı değişiklikler doğru ömrü testi 22 mikrotiter çoğaltılamaz olduğunu gösterir. Benzer şekilde, mikrotiter plate assay vahşi tip N2 hayvanlar 23-24 25 (Şekil 1C) farklı yaşam süresini bildirildi mutantlar ömrü değişiklikler üretir.

Tahlil daha nicel ifadeler yapmak için kullanılabilir. Fig1D ortalama ömrü 7 Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Her veri noktası 7-12 nüfusun ortalama ömrü, her zamanda farklı yaşam temsil eder. De başına hayvan sayısı (5-15 hayvanlar) nispeten düşük olsa da hata çubukları görüleceği gibi, iyi-iyi varyasyon nispeten küçük.

Şekil 1
Şekil 1 tabanlı ömrü testi mikrotiter plate literatürde bildirilen ömrü değişiklikleri doğru üretir.
(A) Örnek verileri bir Excel hesap toplanmıştır. Her sayma oturum tarih boyunca, iyi koordine etmek ve canlı ve ölü hayvan sayısı kaydedildi. Deneyin başında, her bir kuyunun hayvanların toplam sayısı tespit edildi. (B) vahşi tip sağkalım eğrisi (N2) hayvanlar 20 büyüdü ° C ve 25 ° C (C) ömrü etkileyecek mutasyonları taşıyan suşlarının sağkalım eğrileri. Her dört suşları 20 ° C'de paralel olarak ölçüldü (D) Mirtazepine tedavi N2 hayvanlar doz yanıt eğrisi. Ortalama ömrü Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Hata çubukları başına 8 kuyu durum SEM göstermektedir.

5. Malzemeler.

M9 tampon, 1000 mL

  • 6 g Na 2 HPO 4
  • 3 g KH 2 PO 4
  • 5 g NaCl
  • 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O
  • 1000 mL deiyonize su ekleyin
  • Otoklav

Potassiumphosphate tampon pH 6.0, 1000 mL

  • 136 g KH 2 PO 4
  • 900 mL deiyonize su ekleyin
  • 5M KOH ile pH 6,0 'a ayarlayın.
  • 1000 mL deiyonize su ekleyin
  • Otoklav

Trace metal çözümü

  • 1,86 g Na 2 EDTA
  • 0.69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O
  • 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O
  • 0.29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O
  • 0.016 g CuSO 4
  • 1000 ml su deiyonize
  • Otoklav ve karanlıkta saklayın.

S-bazal orta, 1000 mL

  • 5.9 g NaCl
  • 50 ml 1M potasyum fosfat, pH 6.0
  • 1000 ml su deiyonize
  • Otoklav
  • Sonra, 5 mg / ml 'kolesterol (Et-OH çözünmüş) 1 ml eklemek çözüm soğumasını bekleyin.

Potasyum sitrat 1M, 1000 mL

  • 268,8 g tripotasyum sitrat
  • 26.3 sitrik asit monohidrat
  • 900 mL deiyonize su ekleyin
  • 5M KOH ile pH 6,0 'a ayarlayın.
  • 1000 mL deiyonize su ekleyin
  • Otoklav

S-tam orta, 1000 mL

  • 977 ml S-bazal
  • 10 ml 1M potasyum sitrat pH 6 (steril)
  • 10 ml Trace metaller çözüm (steril)
  • 3 ml 1M CaCl 2 (steril)
  • 3 mL 1M MgSO 4 (steril)

NGM agar

  • 3.0g NaCl
  • 2.5g pepton(Kazein gelen, pankreas sindirimi)
  • 17g Agar
  • 975 mL deiyonize su ve karıştırma çubuğu ekle
  • Otoklav
  • - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
    • 0.5 mL 1M CaCl 2 (steril)
    • 1 mL etanol içinde 5 mg / ml Kolesterol
    • 1 ml 1M MgSO 4 (steril)
    • 25 ml Potassiumphosphate tamponu, pH 6.0 (steril)

TB, 1000 mL

  • 12g Bacto Tripton
  • 24 gr Maya Özü
  • 4 mL gliserol
  • 900 mL deiyonize su ekleyin
  • Otoklav
  • - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşen eklemek:
    • 100 mL 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4

0.6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma kedi # F0503), 1000 mL

  • 100 mg FUDR
  • Çözülür S-tam steril 670 ml, 10 ml veya 45 ml alikotları olun.
  • -20 ° C'de muhafaza

100 mg / ml Carbenicillin, 10 ml

  • 1 g Carbenicillin
  • 10 ml steril deiyonize su
  • Steril süzüntü ve kısım
  • -20 ° C'de muhafaza
  • Son bir 50 mg / ml konsantrasyonda

250ug / ml Amfoterisin B, 4 mL

  • 1mg Amfoterisin B
  • 4 mL Et-OH
  • -20 ° C'de muhafaza
  • Son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda

Discussion

Sunulan protokol 96 microtiter plakalar C.elegans ömrü ölçümü sağlar. Temsilcisi sonuçlarında görüldüğü gibi bölümünde güvenilir bir önceki bulgularla çoğaltır ve kantitatif bilgi sağlar. Bu testte başarılı C.elegans ömrü üzerindeki etkileri için 89.000 moleküller üzerinde gösterildi.

Ilaç-tarama amacı için, ömrü 96 mikrotiter plate formatında ölçüm klasik katı ortam tahlil üzerinde birçok avantajı vardır. Bu medya hazırlık, kuluçka alanı miktarı ve gerekli ilaç miktarı için gerekli emek azaltır. 96-iyi bir format ve yüksek kapasiteli gösterimleri için tüm testinin mikroskopi kurulum otomasyonu izin verir.

Testin geliştirilmesi sırasında her değişken ve kombinasyonları için birden çok değer bunların C.elegans ömrü üzerindeki etkileri için test edildi. Bu testler için 3 ila 10 arasında değişen farklı OP50 konsantrasyon mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), solucanlar de ortalama 7 ila 45 (7, 10, 15, 22, 45 arasında değişen farklı sayıda solucanlar / iyi), 40 de ortalama 150 mcL (40, 60, 80, 100, 120, 150 mcL) ve tampon kompozisyonunda değişiklikler arasında değişen farklı bir kültürü hacimleri. Girersek Carbenicillin dirençli OP50 konsantrasyonlarda Carbenicillin ne Amfoterisin B ne belirtilen C.elegans ömrü etkileyecek bulundu. Plakaları sürekli nazik sallayarak C.elegans sıvı kültüründe genellikle tavsiye edilir, bu testte kullanılan küçük miktarlar için vazgeçilebilir bulundu. Büyük kuyu microtiter plakalar kullanılacak, Nazik sallayarak ancak gereklidir. Değerler Bu protokol, farklı koşullarda test edilen istatistiksel karşılaştırma dayalı olarak dikkatli bir şekilde seçilmiştir.

Bu testin en şaşırtıcı özelliği muhtemelen C.elegans bandı ile mühürlenir 96 kuyucuğu tutulabilir bir gerçektir. Yan yana karşılaştırmalar, plastik mühürleyen ile mühürlü plakalar, ya da hava değişimi izin Avcılar ile mühürlü plakalar, kaplanmadan plakalar kültür hayvanların ömrü içinde herhangi bir fark ortaya koymamıştır. Her üç koşul, L1, 65 saat içinde gravid yetişkin hayvanların çok homojen geliştirilen ve çok karşılaştırılabilir ömürlü gösterdi. NGM paralel olarak yetiştirilen hayvanlar biraz daha hızlı gelişti, ancak bu fark, bir mühürleyen varlığı veya yokluğu bağımsız oldu.

Sunulan protokol canlı bakteri dayalı, ancak ölü bakteriler için adapte edilebilir. Ancak, bir sıvı tayininde bir tek hayatta kalan bakteriler hızla çoğalmaya ve kültür yeniden doldurmak. Bizim ellerde, sıvı kültürü için kullanılabilir olması ölçüde bakterileri öldürmek için tek güvenilir yolu, gama radyasyon ile bakteri uzun süreli tedavi.

Ömrü deneyi planlama göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta tespiti güçtür. Etkisinin büyüklüğüne bağlı olarak, faiz ilacın etkisi çok kuyularda test edilmelidir. Tipik bir tahlil 4 ilaç ile tedavi edilen ve 4 kontrol kuyuları, karşılık gelen yaklaşık 40-50 hayvanların her deneylerde% 95 daha fazla bir ömrü içinde% 30 artış tespit etmek için yeterli olacaktır. Olguların sadece% 60% 14 artış tespit edilir ve bu nedenle daha fazla çoğaltmak kuyu gerektirir.

Bu testte tarafından oluşturulan ömrü veri zenginlik, deney geliştirmek veya özel parametrik Gompertz modelleri 1 zorlanma olabilir . Bu Gompertz modelleri algılama gücünü belirlemek ve büyük ölçekli ekranlar için yanlış pozitif ve negatiflerin sayısını tahmin etmek için yararlı. Biz kör deneylerde bu modellerin öngörüleri doğrulanmış ve büyük ekranlarda yanlış negatif numaraları (yayınlanmamış) tahmin etmek için onları kullandı.

Özetle, biz sunulan tahlil C.elegans, ömrünü uzatmak ve altında yatan mekanizmaları incelemek için küçük moleküller tanımlamak için büyük bir kullanım olacağını tahmin ediyoruz .

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu Protokol, başlangıçta Linda Buck Laboratuvar Xiaolan Ye ve Michael Petrascheck Seattle'daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'nde geliştirildi. Yukarıda ayrıntılı bir versiyonu, toplumun tüm işlem yapmak için hazırlanmıştır. Carol Taylor, Sarah LeBoeuf ve Andy Tomacelli protokol eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu el yazması # 2866 Scripps Araştırma Enstitüsü. Petrascheck Lab Novartis ADI programı tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Calbiochem cat# 171375 Also called Fungizone
FUDR Sigma-Aldrich cat# F0503 FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin Sigma-Aldrich M2525-250MG Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine Sigma-Aldrich cat#C6022-MG Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape Nalge Nunc international cat# 236370 Polyester, non-sterile
96 well plate Falcon BD cat# 351172 Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask Nalge Nunc international cat# 178883 used for large volumes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, T. E. Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging. Science. 249, 908-912 (1990).
  2. Kenyon, C. J. The genetics of ageing. Nature. 464, 504-512 (2010).
  3. Finch, C. E., Ruvkun, G. The genetics of aging. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).
  4. Wilson, M. A. Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5, 59-68 (2006).
  5. Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, 258-262 (2005).
  6. McColl, G. Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).
  7. Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 553-556 (2007).
  8. Srivastava, D. Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans. Biogerontology. 9, 309-316 (2008).
  9. Wood, J. G. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, 686-689 (2004).
  10. Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 7, 305-317 (2008).
  11. Onken, B., Driscoll, M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).
  12. Wu, Z. Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).
  13. Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).
  14. Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 11, 45-52 (2010).
  15. Melov, S. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, 1567-1569 (2000).
  16. Benedetti, M. G. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).
  17. Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings. Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).
  18. Kwok, T. C. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
  19. Moy, T. I. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).
  20. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  23. Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).
  24. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
  25. Lakowski, B., Hekimi, S. Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes. Science. 272, 1010-1013 (1996).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 49 yüksek verimlilik tarama yaşlanma ömrü fenotip tabanlı tarama ilaç keşfi yaşa bağlı hastalıkların

Erratum

Formal Correction: Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 05/18/2011. Citeable Link.

A correction was made to Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. A constituent of the S-complete medium was omitted.

The omitted constituent was:

  • 3 ml 1M CaCl2 (sterile)
Ölçme<em> Caenorhabditis elegans</em> 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solis, G. M., Petrascheck, M.… More

Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (49), e2496, doi:10.3791/2496 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter