Summary
Os protocolos descrevem os passos essenciais para a obtenção de cristais de difração de qualidade de uma proteína de membrana a partir de reconstituição da proteína em uma fase lipídica cúbicos (LCP), encontrando condições iniciais com os ensaios pré-cristalização LCP-FRAP, a criação de ensaios de cristalização LCP e cristais colheita .
Abstract
Proteínas da membrana realizar funções críticas em células vivas relacionadas com o transporte do sinal de transdução, e transformações de energia, e, como tal, estão implicados em uma infinidade de disfunções e doenças. No entanto, um entendimento estrutural e funcional de proteínas da membrana é fortemente ficando muito atrás de seus parceiros solúveis, principalmente, devido às dificuldades associadas à sua solubilização e geração de cristais de qualidade de difração. Cristalização em mesofases lipídico (também conhecido como cristalização em meso ou LCP) é uma técnica promissora que foi aplicado com sucesso a obtenção de estruturas de alta resolução de rodopsinas microbiana, proteínas fotossintéticas, barris beta membrana externa e acoplados à proteína G receptores. Em meso cristalização tira proveito de um ambiente de membrana nativa-like e, normalmente, produz cristais com menor teor de solvente e melhor organização, em comparação com a cristalização das soluções tradicionais de detergente. O método não é difícil, mas requer uma compreensão do comportamento de lipídios fase e prática na manipulação de materiais viscosos mesofase. Aqui nós demonstramos uma forma simples e eficiente de fazer LCP e reconstituindo uma proteína de membrana na bicamada lipídica da LCP usando um mixer seringa, seguida de distribuição de porções nanolitros de LCP em um ensaio ou placa de cristalização, a realização de ensaios de pré-cristalização e colheita de cristais a matriz LCP. Esses protocolos fornecem um guia básico para a abordagem em ensaios de cristalização meso, no entanto, como em qualquer experimento de cristalização, uma extensa triagem e otimização são necessárias, e um resultado bem-sucedido não é necessariamente garantido.
Protocol
Um esquema típico de um experimento em meso cristalização é mostrado na Fig.1 1,2. Pré-cristalização LCP FRAP-ensaios são opcionais, no entanto, eles podem acelerar significativamente o processo de busca de condições de cristalização inicial, especialmente no caso de proteínas da membrana difícil 3.
1. Reconstituição de proteínas em LCP
- Purificar uma proteína de membrana de interesse em uma solução de detergente e concentrar a complexos de proteína / detergente para ~ 10 - 20 mg / mL, tomando cuidado para não sobre-concentrar a 1,4 detergente.
- Transferência de ~ 25 mg de um lipídio anfitrião LCP (tipicamente monoolein) ou uma mistura de lipídios em um tubo de 1,5 mL de plástico e incubar a 40 ° C por alguns minutos até que os lipídios se derrete.
- Anexar um acoplador de seringa para uma seringa de 100 mL à prova de gás.
- Carregar a seringa com a lipídios fundido usando uma pipeta de volume ajustável. Registrar o volume dos lipídios na seringa.
- Carregar outro seringa de 100 L com a solução de proteína em uma proteína relação de solução em lipídeos 03/02 v / v.
- Conectar ambas as seringas em conjunto, através do acoplador seringa.
- Empurre a seringa êmbolos alternadamente para mover a lipídios e proteínas, através da agulha interior do engate, e para trás, até que a mesofase lipídios torna-se homogênea. LCP formas espontaneamente ao mistura mecânica, ea proteína torna-se reconstituído na bicamada lipídica da LCP. Formação de LCP pode ser verificada por sua consistência transparente e gel-like e pela ausência de birrefringência quando visto sob um microscópio equipado com cross-polarizadores, ou, se possível, usando pequeno ângulo de difração de raios-X 1.
2. LCP-FRAP pré-cristalização Ensaios
LCP-FRAP testes são projetados para medir as propriedades de difusão de proteínas da membrana reconstituída em LCP em uma variedade de condições de triagem 3. A difusão de longo alcance de proteínas da membrana em LCP é essencial para a cristalização de sucesso, no entanto, a microestrutura do LCP restringe a difusão de proteínas ou grandes agregados da proteína oligomérica. Uma razão comum para o fracasso de um experimento em meso cristalização é uma agregação de proteínas rápida levando a uma perda de difusão. Tem sido demonstrado que o comportamento de agregação de uma proteína depende da construção de determinada proteína, lipídios do hospedeiro e da composição da solução de triagem 3.
- Rótulo a proteína com um corante fluorescente (Cy3 ou similar) na proporção de proteína / tintura de ~ 100 / 1, remover o corante não reagido e concentrar a proteína ~ 1 mg / mL. Rótulo ou aminas livres ou tióis livres. Quando rotulagem aminas livres, use pH entre 7 e 7,5 a etiqueta predominantemente livre N-terminal. Esteja ciente de que a rotulagem amino também pode rótulo lipídios co-purificada com a proteína 2,3.
- Reconstituir a proteína rotulados de LCP, conforme descrito na seção 1).
- Configurar placas de ensaio como descrito na seção 3) usando soluções LCP-FRAP triagem em vez de telas de cristalização 2.
- Incubar as placas a 20 ° C no escuro por pelo menos 12 horas para alcançar um estado de equilíbrio.
- Coloque uma das placas na estação LCP-FRAP e foco no primeiro poço usando uma objetiva de 10x.
- Aquisição de 5 imagens fluorescentes para capturar o estado pré-branqueada inicial.
- Acionar o laser. A potência do laser e do número de pulsos deve ser ajustada para bleach ~ 30 - 70% da proteína rotulado no meio da mancha branqueada.
- Imediatamente após o disparo do laser, iniciar a gravação de uma seqüência de pós-clareamento rápido de ~ 200 imagens a uma taxa mais rápida possível.
- Siga com a gravação de uma seqüência de pós-bleach-lenta de ~ 50 imagens, selecionando a demora entre imagens como s 20/01, dependendo da taxa de difusão da proteína.
- Integrar a intensidade dentro do local de lixívia em todos os quadros e corrigi-lo para o branqueamento ea luz flutuações de intensidade durante a aquisição, dividindo a intensidade dentro do local branqueada pela intensidade média de um ponto de referência fora da área de laser branqueada.
- Normalizar a intensidade corrigida para tornar a intensidade pré-branqueada igual a 1 e a intensidade inicial branqueada igual a 0.
- O traçado da curva da intensidade normalizada em função do tempo, F (t), usando a seguinte equação 5:
F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1)
onde M é a fração de moléculas de difusão móvel, T é o tempo de difusão característico, t é o tempo real de cada quadro gravado, I 0 e I 1 são os dias 0 e 1 ª ordem modificado funções de Bessel. - Calcular o coeficiente de difusão, D, como:
D = R 2 / 4T, (Eq.2)
onde R é o raio da mancha branqueada. - Mover to bem próxima e repita os passos 2.5) - 2.13).
- Compare as frações móvel e coeficientes de difusão obtidos para as condições de seleção diferentes. Concepção nova cristalização telas com base nos componentes que facilitaram a difusão de proteínas e as condições de exclusão para o qual a difusão de proteína não foi observada. Se a proteína não difusa em qualquer uma das condições selecionadas, considerar ampliando o espaço de triagem ou tentando construir uma nova proteína.
3. Configurando Trials Cristalização LCP
- Proteína em reconstituir a LCP, conforme descrito na seção 1).
- Transferir a LCP proteína-laden em uma seringa de 10 mL à prova de gás ligado a uma seringa dispenser repetitivo.
- Anexar uma pequena agulha removível (calibre 26, 10 mm de comprimento) para a seringa de 10 mL.
- Dispense 200 nL bolo de LCP na superfície de quatro poços adjacentes formando um quadrado 2x2.
- Sobreposição de cada um dos bolos LCP com 1 mL de solução correspondente a cristalização tela.
- Cap quatro poços carregado com uma lamela de vidro 18 milímetros quadrados. Aplique uma pressão suave sobre as lamelas para selar os poços.
- Repita os passos 3,4) -3,6) com o próximo conjunto de 4 poços até a placa inteira está cheia.
- Incubar a placa a uma temperatura constante, verificando periodicamente a formação de cristais e crescimento.
4. Cristais colheita de LCP
- Coloque um prato com cristais de proteínas sob um microscópio estéreo com zoom variável, equipado com um polarizador e analisador linear de rotação.
- Concentre-se no bem de interesse usando um zoom de baixa potência para que o bem geral é colocado dentro do campo de visão.
- Pontuação do vidro lamela em quatro cursos fazendo um quadrado dentro dos limites bem usando um canto de uma pedra afiada corte de cerâmica capilar.
- Imprensa em torno do perímetro marcou com fortes sharp-ponto pinças para propagar os riscos através da espessura do vidro lamela.
- Faça dois pequenos furos em cantos opostos do quadrado marcado.
- Injetar mL de solução precipitante poucos através de um dos buracos para reduzir a desidratação durante as etapas subseqüentes.
- Usando uma sonda de agulha em ângulo agudo quebrar o vidro ao longo de um ou dois lados para liberar a praça cut-out.
- Cuidadosamente levante a assistir quadrados de vidro para o bolo fase cúbicos. Se o bolo está preso à lamela, em seguida, virar o quadrado de vidro e coloque no fundo do poço.
- Adicionar um extra alguns mL de solução precipitante, completada com uma crio-protetor, se necessário, no topo do bolo fase expostos cúbicos no poço.
- Aumentar a ampliação do microscópio e se concentrar em um cristal.
- Ajustar o ângulo entre o polarizador eo analisador para aumentar o contraste entre o cristal birrefringente eo fundo, mantendo luz suficiente para ver o circuito de colheita.
- Selecione um MicroMount MiTeGen com um diâmetro correspondente ao tamanho de cristal e depois colher o cristal diretamente da LCP escavando-o na MicroMount.
- Flash congelar o MicroMount com o cristal colhidas em nitrogênio líquido, e enviá-lo a uma linha de luz síncrotron fonte para coleta de dados de raios-X 6.
5. Resultados representativos:
Uma engenharia humana beta 2 adrenérgicos G receptor acoplado à proteína (β 2 AR-T4L) foi expressa em baculovírus infectados células de inseto Sf9 e purificado em dodecylmaltoside (DDM) / hemissuccinato colesterol (CHS) solução de detergente vinculado a um agonista parcial inversa carazololo 7. A proteína foi marcado com Cy3 éster NHS e utilizado em ensaios pré-cristalização LCP-FRAP (Figura 2). Telas grade grosseira com base em várias condições selecionados a partir dos resultados da LCP-FRAP ensaios produzidos inicial cristal-como hits (Figura 3). Otimização das condições de precipitante rendeu cristais de difração de qualidade (Figura 4).
Figura 1. Fluxograma de um experimento típico LCP cristalização. Passos nas caixas cinza não estão descritos nos protocolos atuais.
Figura 2. LCP-ensaio FRAP com AR-T4L/carazolol 2 β em monoolein LCP baseado. A) Resultados de um ensaio FRAP LCP-realizada em um modo de alto rendimento automático, em que cada amostra de uma placa de 96 poços é branqueada seqüencialmente e recuperação de fluorescência é medida após a incubação de 30 min. As recuperações obtidas por fluorescência, que representam a fração móvel em cada amostra, são traçados para todas as 96 amostras. As soluções de triagem contêm 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 combinado com 48 diferentes sais em duas concentrações diferentes. B) Fluorescência perfis de recuperação para vários repcondições representativas. Curvas linha sólida representa encaixa pela equação. 1.O frações móvel e os coeficientes de difusão são determinados utilizando equações. 1 e 2. Recuperação rápida de menos de 10% na amostra contendo cloreto de sódio é devido a lipídios fluorescente etiquetado co-purificada com a proteína.
Figura 3. Sucessos cristal inicial de AR-T4L/carazolol 2 β obtido por uma triagem grade grossa em torno de condições mais promissoras identificadas pela LCP-FRAP, contendo sulfato de sódio (painel A) e Na Formate (painel B). A proteína é rotulado com Cy3 éster NHS e as imagens fluorescentes são tiradas com excitação em 543 nm e emissão a 605 nm.
Figura 4. Cristais Optimized de AR-T4L/carazolol 2 β. As imagens dos cristais crescidos na presença de sulfato de sódio (painéis A e B) e K Formate (painéis C e D) são tomadas no modo brightfield (painéis A e C) e usando cross-polarizadores (painéis B e D).
Discussion
Os protocolos de fornecer uma orientação básica visual para as principais etapas envolvidas na realização de experimentos de cristalização meso. Mais em profundidade os detalhes relacionados a estes protocolos, enfatizando possíveis armadilhas, deficiências ou rotas alternativas estão disponíveis em outros lugares 1,2. Opcional LCP FRAP-ensaios podem ajudar nas fases anteriores para selecionar a construção de proteínas mais promissores, LCP lipídica host e aditivos de lipídios, bem como limitar a gama de possíveis precipitantes e condições de buffer 3. Uma vez um sucesso de cristalização inicial é encontrada, ela deve ser otimizado para obter cristais de melhor qualidade. Otimização das condições de cristalização de meso é essencialmente similar a otimização das condições de proteínas solúveis com a adição de parâmetros adicionais associados com a composição da LCP 1. Cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em mesofase são geralmente menores em tamanho do que os cristais obtidos em solução de detergente, mas mais ordenada, assim, beneficiando fortemente do uso de linhas de luz disponíveis em microfoco fontes de síncrotron moderna 6.
Muitos dos procedimentos relacionados no meso cristalização, incluindo a configuração de placas de cristalização ou ensaio, a realização de LCP FRAP-ensaios e detecção de cristais, foram semi ou totalmente automatizado 1,2,8,9, permitindo triagem de uma grande variedade de condições ao consumir pequenas quantidades de proteínas e lipídios. Por outro lado, proteína em reconstituições LCP e colheita de cristal permanecem operações manuais e mais tedioso e, portanto, têm uma necessidade de melhoria.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em partes pelo NIH concede GM073197 e RR025336.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
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