Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Published: March 28, 2011 doi: 10.3791/2501

Summary

De protokoll som beskriver de viktigaste stegen för att få kristaller diffraktion kvaliteten på ett membranprotein efter beredning av proteinet i en lipidic kubisk fas (LCP), att hitta ursprungliga villkoren med LCP-FRAP före kristallisering analyser, upprättande av LCP kristallisering prövningar och skörd kristaller .

Abstract

Membranproteiner utför viktiga funktioner i levande celler med anknytning till signaltransduktion, transport och transformationer energi, och som sådan är inblandade i en mängd störningar och sjukdomar. Det är dock en strukturell och funktionell förståelse av membranproteiner släpar kraftigt efter det att de lösliga partners, huvudsakligen beroende på svårigheterna förknippade med deras lösningsgörande och generering av kristaller diffraktion kvalitet. Kristallisering i lipidic mesophases (även känd som i meso eller LCP kristallisering) är en lovande teknik som framgångsrikt har använts för att med hög upplösning strukturer mikrobiell rhodopsins, fotosyntetiska proteiner, yttre membran fat beta och G-proteinkopplade receptorer. I meso kristallisering drar fördel av en infödd-liknande membran miljö och vanligtvis producerar kristaller med lägre halt av lösningsmedel och bättre beställning jämfört med traditionella kristallisation från tvättmedel lösningar. Metoden är inte svårt, men kräver en förståelse av lipid fas beteende och praxis i hantering av trögflytande mesophase material. Här visar vi ett enkelt och effektivt sätt att göra LCP och återuppbygga ett membran protein i membranet av LCP hjälp av en spruta mixer, följt av dosering metod i nanoliter delar av LCP i en analys eller kristallisering tallrik, genomföra före kristallisering analyser och skörd kristaller från LCP matrisen. Dessa protokoll ger en grundläggande guide för att närma sig i meso kristallisering försök, dock som med alla kristallisering experiment, omfattande screening och optimering krävs, och ett lyckat resultat är inte nödvändigtvis garanteras.

Protocol

En typisk beskrivning av en i meso kristallisering experiment visas i Fig.1 1,2. Pre-kristallisation LCP-FRAP analyser är frivilliga, men de kan snabba på processen att söka efter inledande kristallisering villkor, särskilt när det gäller svåra membranproteiner 3.

1. Protein beredning i LCP

  1. Rena ett membranprotein intresse för ett rengöringsmedel och koncentrera protein / diskmedel komplex till ~ 10 - 20 mg / ml, se till att inte över-koncentrera rengöringsmedel 1,4.
  2. Överför ~ 25 mg en LCP värd lipid (typiskt monoolein) eller en lipid blandningen i en 1,5 ml plaströr och inkubera vid 40 ° C i några minuter tills fett smälter.
  3. Bifoga en spruta koppling till en 100 mikroliter gastät spruta.
  4. Ladda sprutan med smält fett med hjälp av en justerbar volym pipett. Anteckna volymen på lipid i sprutan.
  5. Ladda ytterligare 100 mikroliter sprutan med protein lösningen på ett protein lösning till lipid förhållandet 2 / 3 v / v.
  6. Anslut båda sprutorna tillsammans genom sprutan koppel.
  7. Skjut på sprutan kolvarna växelvis för att flytta fett och protein genom det inre nål av koppel, fram och tillbaka, tills lipid mesophase blir homogen. LCP former spontant på mekanisk blandning, och protein blir beredas i membranet av LCP. Bildning av LCP kan verifieras genom sin öppna och gel-liknande konsistens och genom frånvaron av birefringency när de ses i mikroskop utrustad med cross-polarisatorer, eller, om möjligt, med hjälp av små vinklar röntgendiffraktion 1.

2. LCP-FRAP Pre-kristallisering analyser

LCP-FRAP analyser är utformade för att mäta spridningen egenskaper hos membranproteiner beredas i LCP på en mängd olika screening villkor 3. Den långväga spridningen av membranproteiner i LCP är en förutsättning för en framgångsrik kristallisering, men begränsar mikrostruktur LCP diffusion av stora proteiner eller oligomeric aggregat protein. En vanlig orsak till fel på en i meso kristallisering experiment är en snabb proteinaggregering leder till en förlust av diffusion. Det har visat sig att den sammanläggning beteende av ett protein beror på visst protein konstruera, värd lipid och sammansättningen av screening lösning 3.

  1. Märk protein med en fluorescerande färg (Cy3 eller liknande) på ett protein / färg förhållandet ~ 100 / 1, ta bort oreagerad färg och koncentrera protein ~ 1 mg / ml. Etikett antingen fria aminer eller fri tioler. När märkning fria aminer, användning pH mellan 7 och 7,5 till övervägande märka fria N-terminalen. Var medveten om att amino märkning också kan märka lipider tillsammans renat med protein 2,3.
  2. Rekonstituera märkta proteinet i LCP som beskrivs i avsnitt 1).
  3. Ställ in analys plattor som beskrivs i avsnitt 3) med LCP-FRAP screening lösningar i stället för kristallisering skärmar 2.
  4. Inkubera plattorna vid 20 ° C i mörker i minst 12 timmar för att uppnå ett jämviktstillstånd.
  5. Placera en av plattorna på LCP-FRAP station och fokusera på den första brunnen med ett 10x objektiv.
  6. Förvärva 5 fluorescerande bilder för att fånga den första pre-blekt tillstånd.
  7. Trigger lasern. Lasern makt och antal pulser bör justeras för att bleka ~ 30 - 70% av den märkta proteinet i mitten av blekt plats.
  8. Omedelbart efter utlöser laser, börja spela in en snabb post-blekning sekvens av ~ 200 bilder på snabbast möjliga takt.
  9. Följ med inspelning av en långsam efter blekmedel sekvens av ~ 50 bilder, välja fördröjningen mellan bilderna som 1-20 s, beroende på spridningen graden av proteinet.
  10. Integrera intensiteten inuti blekmedel plats i alla ramar och korrigera dem för blekning och ljusintensitet svängningar under förvärvsprocessen genom att dividera intensiteten inuti blekt plats av det genomsnittliga intensiteten från ett referenspris på utsidan av laser blekt området.
  11. Normalisera den korrigerade intensitet att göra före blekt intensitet lika med 1 och den ursprungliga blekt intensiteten lika med 0.
  12. Montera kurvan för den normaliserade intensitet kontra tid, F (t), med hjälp av följande ekvation 5:
    F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), placering (Ekv.1)
    där M är den mobila bråkdel av sprida molekyler, är T karakteristiska diffusionstid är t den verkliga tiden för varje inspelad ram, jag 0 och jag 1 är 0: e och 1 m för modifierade Bessel-funktioner.
  13. Beräkna diffusionskoefficient, D, som:
    D = R 2 / 4T, (Eq.2)
    där R är radien på blekt plats.
  14. Flytta to nästa väl och upprepa steg 2,5) - 2,13).
  15. Jämför den mobila fraktioner och koefficienter diffusion erhållits för de olika screening villkor. Utforma nya kristallisering skärmar baserade på komponenter som underlättade protein diffusion och exklusive villkor vilket protein diffusion inte iakttogs. Om proteinet inte diffus i något av de kontrollerade förhållanden, överväga att bredda screening utrymme eller prova ett nytt protein konstruktion.

3. Installera LCP Crystallization Trials

  1. Bered proteinet i LCP som beskrivs i avsnitt 1).
  2. Överför protein-lastad LCP i en 10 mikroliter gastät spruta kopplad till en repetitiv spruta dispenser.
  3. Bifoga en kort avtagbar kanyl (övertryck 26, 10 mm längd) till 10 mikroliter sprutan.
  4. Fördela 200 nL bolusdoser på LCP på ytan av fyra intilliggande brunnar bildar en 2x2 kvadrat.
  5. Overlay varje LCP bolus med 1 mikroliter av motsvarande kristallisering skärmen lösning.
  6. Cap fyra laddade brunnar med en 18 mm fyrkant glas täckglas. Applicera ett lätt tryck på täckglas för att täta brunnar.
  7. Upprepa steg 3,4) -3,6) med nästa sats med 4 brunnar tills hela plattan är fylld.
  8. Inkubera plattan vid en konstant temperatur och kontrollerar med jämna kristallbildning och tillväxt.

4. Skörd Kristaller från stora förbränningsanläggningar

  1. Placera en plåt med protein kristaller i en stereo mikroskop med variabel zoom, utrustad med en linjär roterande polarisator och analysator.
  2. Fokus på väl av intresse att använda en låg effekt zooma så att hela väl placeras inom synfältet.
  3. Betyg på täckglas glaset i fyra slag att göra en kvadrat inuti väl gränser med en vass hörn av en keramisk kapillär skära sten.
  4. Tryck runt den perforerade kanten med starka vass-punkt pincett för att sprida repor genom tjockleken på täckglaset glas.
  5. Punch två små hål på motsatta hörn fick torget.
  6. Injicera några mikroliter av fällningsmedel lösning genom ett av hålen för att minska uttorkning under de efterföljande stegen.
  7. Använda en vinklad vass nål sond bryta upp glaset längs en eller två sidor för att befria utskurna torget.
  8. Lyft försiktigt upp tittar glaset torget för den kubiska fasen bolus. Om bolus har fastnat på täckglas och sedan vända glaset torget över och placera på botten av brunnen.
  9. Lägg till en extra några mikroliter av fällningsmedel lösning kompletteras med en Cryo-Protectant, om nödvändigt, på toppen av den exponerade kubiska fasen bolus i brunnen.
  10. Öka förstoringen av mikroskopet och fokusera på en kristall.
  11. Justera vinkeln mellan polarisator och analysator för att öka kontrasten mellan birefringent kristall och bakgrunden, samtidigt som tillräckligt med ljus för att se skörd slingan.
  12. Välj ett MiTeGen MicroMount med en diameter matchande kristall storlek och sedan skörda kristallen direkt från stora förbränningsanläggningar genom att ösa in den MicroMount.
  13. Flash frysa MicroMount med den skördade kristall i flytande kväve, och skickar den till en synkrotron källa beamline för X-ray datainsamling 6.

5. Representativa resultat:

Konstruerad mänskliga beta 2-adrenerga G-proteinkopplade receptor (β 2 AR-T4L) uttrycktes i baculovirus infekterade sf9 insekt celler och renas i dodecylmaltoside (DDM) / kolesterylsulfat hemisuccinate (CHS) rengöringslösning bunden till en partiell invers agonist Karazolol 7. Proteinet var märkta med Cy3 NHS ester och används i LCP-FRAP före kristallisering analyser (figur 2). Grova rutnät skärmar baserade på flera villkor valts utifrån resultaten av LCP-FRAP analyser producerade första kristall-liknande träffar (Figur 3). Ytterligare optimering av fällningsmedel villkor gav kristaller diffraktion kvalitet (Figur 4).

Figur 1
Figur 1. Flödesschema av en typisk LCP kristallisering experiment. Stegen i grå rutor beskrivs inte i den aktuella protokollen.

Figur 2
Figur 2. LCP-FRAP assay med β 2 AR-T4L/carazolol i monoolein baserade LCP. A) resultat från en LCP-FRAP analys utförs i en automatisk hög genomströmning läge, där varje prov av en 96-brunnar är blekt sekventiellt och fluorescens återhämtning mäts efter en 30 min inkubation. De erhållna fluorescens återvinningar, som utgör den mobila fraktionen i varje prov, ritas för alla 96 prover. Screening lösningar innehåller 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 i kombination med 48 olika salter på två olika koncentrationer. B) Fluorescens återhämtning profiler för flera repsentant förhållanden. Heldragna linjen kurvor representerar passar med Eq. 1.Det mobil fraktioner och koefficienterna spridning bestäms med miljökvalitetsnormen. 1 och 2. Snabb återhämtning av mindre än 10% i de prov som innehåller Na klorid beror på fluorescerande lipider tillsammans renat med protein.

Figur 3
Figur 3. Inledande kristall träffar av β 2 AR-T4L/carazolol erhålls genom en grov rutnät screening runt mest lovande förutsättningar identifieras med LCP-FRAP, innehållande Na sulfat (panel A) och Na Formate (panel B). Proteinet är märkt med Cy3 NHS ester och fluorescerande bilder tas med excitation vid 543 nm och utsläpp på 605 nm.

Figur 4
Figur 4. Optimerad kristaller av β 2 AR-T4L/carazolol. Bilderna av kristaller odlas i närvaro av Na sulfat (paneler A och B) och K Formate (panelerna C och D) tas i brightfield läge (paneler A och C) och använder över polarisationsfilter (paneler B och D).

Discussion

De protokoll som ger en grundläggande visuell vägledning för de viktigaste stegen i att uppträda i meso kristallisering experiment. Mer ingående detaljer med anknytning till dessa protokoll, med betoning på möjliga fallgropar, brister eller alternativa vägar finns tillgängliga någon annanstans 1,2. Valfri LCP-FRAP analyser kan hjälpa i tidigare skeden för att välja de mest lovande proteinet konstruera, LCP värd lipid och tillsatser lipid, samt begränsa de möjliga precipitants och villkor buffert 3. När en första kristallisering hit hittas, bör det vara optimerad för att få bättre kvalitet kristaller. Optimering av i meso kristallisering villkor i allt väsentligt liknar optimera förutsättningarna för lösliga proteiner med tillägg av extra parametrar som sammanhänger med sammansättningen av LCP 1. Membranprotein kristaller odlas i lipidic mesophase är oftast mindre i storlek än kristaller erhålls i rengöringsmedel, men beställde därmed strålrör drar nytta starkt från att använda mikrofokus finns på moderna synkrotron källor 6.

Många av de förfaranden för i meso kristallisering, inbegripet införande av kristallisering eller haltbestämning plattor, genomföra LCP-FRAP analyser och upptäcka kristaller, har halv-eller helautomatisk 1,2,8,9, vilket gör att screening av ett stort utbud av villkor samtidigt som den förbrukar små mängder protein och fett. Å andra sidan, protein reconstitutions i LCP och kristall skörd förblir manuella och mer tråkiga verksamheten och därmed har ett behov av förbättring.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats i delar av NIH bidrag GM073197 och RR025336.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μL gas-tight syringe Hamilton Co 7656-01 2 syringes are required
10 μL gas-tight syringe Hamilton Co 7653-01
Syringe coupler Hamilton Co 7770-02 30902 The coupler can be made using available parts as described in refs. 10
Repetitive syringe dispenser Hamilton Co 83700 The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11
Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) Hamilton Co 7804-03
96-well glass sandwich plate Marienfeld 08 900 03 For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12.
Glass cover slip Electron Microscopy Sciences 63787-01
monoolein Sigma-Aldrich M7765
Crystallization screens Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13.
Capillary cutting stone Hampton Research HR4-334
Fine point tweezers Ted Pella, Inc. 510
Angled sharp probe Ted Pella, Inc. 13650
MicroMounts MiTeGen M1-Lxx-xx Select MicroMount diameter to match the crystal size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
  2. Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
  3. Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
  4. Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
  5. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
  6. Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
  7. Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  8. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
  9. Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
  10. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
  11. Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
  12. Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
  13. Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).

Tags

Strukturbiologi membranprotein lipidic kubisk fas kristallisering fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) G-proteinkopplade receptorer
Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Cherezov, V.More

Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (49), e2501, doi:10.3791/2501 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter