Summary
果蝇，果蝇，早期发展的特点是由许多细胞形状的变化，以及成像方法适合。本文将描述活果蝇胚胎的共焦成像所需的基本工具和方法，将集中在细胞形态变化称为cellularization。
Abstract
发展的果蝇胚胎发生细胞形态的变化，非常适合现场共焦成像。在果蝇的细胞形状的变化类似于在高等生物的，他们驾驶的组织形态发生。因此，在许多情况下他们的研究有直接影响，为了解人类疾病（见表1）1-5 。规模在亚细胞，这些细胞形态的变化，产品范围从基因表达的信号转导，细胞极性，细胞骨架重塑和膜贩运活动。因此， 果蝇胚胎不仅提供了背景下，以评估细胞形状的变化，因为这涉及到组织的形态发生，但也提供了一个完全的生理环境研究的亚细胞形状的细胞的活动，。
这里描述的是该协议设计的图像称为cellularization一个特定的细胞形态变化。 Cellularization是一个戏剧性的质膜增长过程，并最终转换成合胞胚胎细胞胚。也就是说，在有丝分裂周期14相间，质膜同时invaginates〜6000 cortically挂靠核周围产生原发性上皮细胞表。 cellularization违反上述建议，是不是驱动由肌球蛋白收缩6，但燃料，而不是主要从7个内部存储的膜胞吐。因此，cellularization是一个优秀的系统研究在细胞形态的变化，需要质膜内陷或扩建，如细胞分裂或横管（T型肾小管）在肌肉形态发生，膜贩运。
请注意，这个协议是很容易应用到其他细胞形状的变化，在果蝇胚胎成像，并且只需要轻微的适应化修改，如改变胚胎收集的阶段，或使用“胚胎胶”，安装在一个特定的方向（表胚胎1）8-19。在所有情况下，工作流程基本上是相同的的（图1）。克隆和转基因果蝇的标准方法用于制备稳定的飞股票，表达利益的一种蛋白，融合，绿色荧光蛋白（GFP）或它的变种，和这些苍蝇提供了一种可再生的胚胎来源。另外，荧光蛋白/探针直接引入飞胚胎，通过简单的显微注射技术 9-10 。然后，根据发展的事件和细胞形状的变化进行成像，胚胎收集和形态解剖显微镜上演，并最终定位和安装时间推移共聚焦显微镜成像。
Protocol
1。装配胚胎收集杯
- 切底关闭100 mL的烧杯用剃刀三玉米，尽可能顺利的边缘。杯子很容易处理，如果你还修剪关闭顶部的三个角，虽然这不是绝对必要的。
- 切丝网（6厘米x 6厘米）的平方。在一个预热的热点板块，里面的通风橱，层丝网一块重型铝箔上的平方。推杯的削减，坚决到热网的底部边缘。等待几秒钟，并解除与现在连接的网状杯。如果箔也坚持，只是剥离其关闭。
- 酷杯过夜。关闭任何尖锐的细粒度砂纸边缘，删除多余的网，用剪刀和沙子。
2。让苹果汁琼脂平板
- 在6L烧瓶中，结合100克BD细菌用琼脂和3L蒸馏水。高压灭菌30分钟缓慢排气设置的琼脂。
- 在一个搅拌棒2L容量瓶中，结合100克蔗糖，苹果汁1L和6克对羟基苯甲酸。热到沸腾，而上一个热点板块搅拌的解决方案。不要煮沸2分钟以上。允许苹果汁混合，冷却，然后添加琼脂用搅拌棒。混合完全。
- 允许合并的解决方案，在60℃水浴冷却，然后再浇筑到60x15 mm培养皿中。另外，蠕动泵可用于免除琼脂。允许板冷却到室温，至少4个小时。 Rubbermaid的容器，在4 ° C的湿纸巾和存储层的堆栈
注：
- 在秋季和冬季，可能有必要增加一个额外的100毫升的水琼脂。
- 皮氏培养皿中的品牌是很重要的！只有屋宇署猎鹰菜适合三玉米烧杯。具体的订购信息中可以找到下面的材料表。
3。将GFP的苍蝇胚胎收集杯
- GFP的股票，根据到您的收藏需求展开设立瓶苍蝇大约两个星期前成像。苍蝇一瓶通常是绰绰有余的，以填补与最低的50位女性和30男性胚胎收集杯。最好的铺设，苍蝇应新eclosed（即少于5天的孵化后）。
- 请填写大致相等的部分红星积极干燥酵母和蒸馏水一小杯粘贴酵母，搅拌直至溶解酵母。粘贴应近似湿花生酱的一致性。可以添加更多的酵母或水改变的一致性。酵母膏，可使用数天，应贮存，覆盖，在4 ° C。
- 酵母膏一旦准备就绪，删除苹果汁板从4 ° C储存。数的苹果汁，酵母膏板，并允许他们温暖，以22-25 ° C，这将鼓励产蛋。
- 圆形滤纸折一半，再一半。修剪直径8-9厘米，并在四分之一圆的手风琴褶皱。开展了一圈，倒置，插入一个收集杯，直到它触及网格。确保纸张在世界杯的安全，以便它不属于粉碎苍蝇。滤纸是可选的，但确实提供了一个温馨的环境进行交配，并保持湿度杯。
- 标签一杯股票的名称和日期。苍蝇从瓶子转移到收集杯轻轻晃动在杯子倒瓶，并立即用准备好的苹果汁板盖杯。一杯用橡皮筋固定板。设置杯网状侧面积直射光。确保没有阴影落在杯中，苍蝇不会在黑暗中奠定。
- 需要更改苹果汁板。两小时的集合，在室温下，成像cellularization。
4。准备安装室
- 要准备一个胚胎的安装室，切2-3厘米长的一块双面胶带和它放在幻灯片上，对准磁带和幻灯片的长轴。切2-3厘米长的一块双面胶带层的其他磁带上，确保他们的边缘对齐。
- 使用刀片，使两个中心的磁带，并垂直于长轴的幻灯片削减约3毫米。删除磁带之间的削减，使一个通道。吸取一个下降通道的卤烃27油。此通道的胚胎将被安装。
注：
- 只有0.5英寸苏格兰双面胶带，是正确的厚度，以适应胚胎。
- 27卤烃油透氧，使氧气的交换，同时防止胚胎脱水。由于它的折射率，卤烃27石油也是理想的分期成像胚胎。
5。 Dechorionate胚胎
- 要收集和dechorionate胚胎，倒入足够的苹果汁琼脂平板上，以完全淹没整个表面的50％漂白粉。如蔡司发现V8透射光，使用解剖显微镜，观察胚胎释放他们的绒毛膜。只要绒毛膜放松，从一个胚胎数（30-60秒）发布，倒入一个细胞过滤器的漂白剂和胚胎。
- 从喷瓶蒸馏水洗净滤网胚胎立即大力。民建联过滤纸巾。如果任何粉红色毛巾涂抹后，继续用清水冲洗胚胎。
- 使用湿画笔10-50胚胎转移到一个干净的苹果汁板（无酵母膏）。威克远离纸巾撕边的水，并立即支付少量的卤烃27油胚胎。
注：
- 不要使用高乐氏漂白。相反，使用一个品牌，作为奥斯汀的A - 1商业漂白剂，这是<6％次氯酸钠等。
- 过度漂白或不足冲洗会导致不规则cellularization糊状胚胎。
6。舞台及摩胚胎
- 使用透射光的夹层的显微镜，按照Bownes 20的形态指引到上盘阶段的胚胎。使用镊子，转让5有丝分裂周期11或12个胚胎，对应到Bownes第4阶段，安装室的通道。排列在一条线上的胚胎，背，腹两侧可见的和横向的一面朝下。胚胎很容易在这仅在石油的方向排列。不要人群胚胎，因为他们的氧气会剥夺他们的邻居一次盖玻片应用于如下。 （保持它们之间的胚胎长度约一半）。
- 打好一个25X25毫米盖的一个边缘滑双面胶带在通道的一侧。除去盖玻片盖通道。如果是抓下面的空气，适用于盖玻片边缘的卤烃27油少量。的毛细作用，将拉进油的渠道，推动了空气。
注：
- 举办胚胎的另一个优秀资源如下：坎波斯，奥尔特加，JA和Hartenstein，五（1985年）。 果蝇的胚胎发育。斯普林格出版社，柏林。虽然这本书不再出版，使用副本定期对Amazon.com。
- 务必谨慎使用的卤烃27油。这将使得安装更加容易。它也将防止意外显微镜物镜的油渗出到以下的成像步骤。
7。图片胚胎
- 如何你继续在这里当然会取决于细胞形状的变化，你是成像，和解决的问题，你。任何形状的变化，您的安装室放在一个直立或倒置显微镜，透射光找到你的胚胎，然后切换到共焦成像，把重点放在地区的利益。坚持的最佳做法，如共聚焦显微镜， http://www.microscopyu.com/articles/confocal了尼康的MicroscopyU（讨论）。特别是在揭露你的活胚胎，以尽可能少的激光功率，尽可能严谨，以防止光漂白和光毒性。
- cellularization，我们蔡司710激光扫描共聚焦显微镜图像，使用了C -复消色差透镜40x/1.2 W更正 目标。这种显微镜被安置在房间温度控制，温度范围从18-20 ° C。虽然温度控制也不是绝对必要的，这是为更好的显微镜，使成像更一致的。我们经常在一个单一的平面图像，附近的胚胎中，按照截面的质膜内陷（图2）。以下内陷动态，有30-60秒的时间间隔足够的时间推移成像，胚胎应能承受90分钟成像缺氧没有明显的迹象。
- 获取图像后，他们可以分析使用任何图像分析软件包，包括从美国国立卫生研究院，免费ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij ）。的数据，然后可以作为电影（电影），序列（图2），或kymographs 21 。
注意：
- 浸水的C复消色差透镜40x/1.2 W更正 目标是附近的胚胎中间部分是由于其高的光圈，这限制了水样中的深部组织成像畸变的成像非常适合，并给出了高分辨率和高荧光信号。此外，这个目标有一个很长的工作距离（220微米）。然而，其他的水或甘油中浸泡目标将表现良好，特别是如果感兴趣的细胞形状的变化可以成像胚胎表面附近。
8。另一种方法：“胚胎胶”山胚胎
- 图像细胞形状改变比cellularization，它可能是需要安装在一个特定的方向，是不容易维持在石油的胚胎。要做到这一点，使用一个备用的安装方法前面介绍的。相结合，与250μL的正庚烷在闪烁瓶中的20厘米的双面胶带“胚胎胶”开始。广场上nutator的闪烁瓶或旋转平台，混合过夜。
- 胚胎胶浸入黄色的枪头，然后跟踪沿幻灯片的一角，留下的胶水的痕迹。虽然庚烷是蒸发，对准你的上演在所需方向上的琼脂块的胚胎。 （请记住，胚胎表面进行成像，应面临的琼脂。形象在腹沟形成的细胞形状的变化，例如，安装与他们的腹侧方面临的琼脂胚胎。）
- 反转用胶水的幻灯片，并轻轻按压对胚胎的琼脂块上的胶水的痕迹。现在再次反转幻灯片。胚胎将停留在正确的方向。添加胚胎两侧的两层双面胶，盖卤烃27油，适用于盖玻片。继续与上文所述的成像。
9。代表性的成果：
如果胚胎是健康的，成像是最优的，那么应该采取cellularization 50-60分钟，质膜内陷入口近40微米。然而，如果胚胎是过度漂白，氧，光毒性剥夺或损坏，然后内陷将缓慢或停止，尤其是在成像领域。这种胚胎健康恶化，结果往往是改变发展，幼虫孵化失败。因此，严格的测试后成像技术来检测胚胎健康，在湿盒中保持你的幻灯片，并观看孵化第二天。
图1。从胚胎收集成像的工作流程，该协议的工作流程可以分成四个主要阶段。在第一阶段，所有的个人用品和组件准备，胚胎收集杯，苹果汁琼脂平板和GFP果蝇放在一起创建的胚胎铺设的环境。在第二阶段中收集，鸡蛋和苹果汁琼脂平板上奠定了胚胎。在第三阶段，胚胎是从板块中删除，上演，并转移到装配室。在第四阶段，安装胚胎共聚焦显微镜成像。
图2。安装有代表性的数据，从时间推移cellularization成像胚胎背侧（D）和腹（五）双方清晰可见，和附近的中间影像，按照截面质膜内陷。这里显示的胚胎表达了绿色荧光蛋白-肌球蛋白- 2探头6，集中在质膜内陷提示。因此，跟踪这个随着时间的推移前面的侵入，使invaginates质膜的速率。 0:00分钟的时间点对应cellularization发病。 56:00分钟的时间点后不久，原肠开始对胚胎的腹侧方。酒吧是40微米。
电影1。从时间推移cellularization成像代表电影这部电影。对应于图2。为了记录整个cellularization过程，成像在事先有丝分裂周期13的开始，捕捉pseudocleavage畦回归，并继续对胚胎的腹侧方，直到原肠运动。图片收集在一分钟的时间间隔。强度增加收购后，使其更容易看到的原肠运动。
点击这里为电影
| 发展事件和时序* | 相关的细胞形态变化 | 疾病或人体健康的链接 | 最近提及实时成像 |
| 伪分裂沟的形成 （4; 90分钟PF） | 胞质 | 多倍体和癌症的发展1 | Mavrakis等，2009年8 曹等人，2010年9 |
| Cellularization （5; 130分钟PF） | 胞质 | 多倍体和癌症的发展1 | 曹等人，2008年10月 Sokac Wieschaus，2008年11月 |
| 腹畦形成，中胚层内陷 （6; 180分钟PF） | 心尖收缩;上皮 - 间质转型 | 癌转移2 | 福克斯Peifer，2007年12月 马丁等人，2009年13 |
| Germband扩展 （第7条; 195分钟PF） | 收敛延伸 | 神经管缺陷3 | Bertet等，2004年第14 布兰肯希普等人，2006年15 |
| Tracheogenesis （11; 320分钟PF） | 上皮管形成和分支 | 血管生成4 | Caussinus等，2008 16 热尔韦与卡萨诺瓦，2010 17 |
| 背封 （14; 620分钟PF） | 心尖收缩 | 伤口愈合5 | Gorfinkiel等，2009年第18 梭伦等人，2009 19 |
例子成像在生活飞胚胎细胞形态的变化见表1 。
Bownes阶段的数量和时间受精后（PF），每个事件开始时，根据坎波斯，奥尔特加，1985年上市。
| 飞股票 | 标签 | 原始参考 |
| 蜘蛛GFP（95-1） | 质膜 | 莫兰等人，2001年22 |
| Resille - GFP（117-2） | 质膜 | 莫兰等人，2001年22 |
| GAP43金星 | 质膜 | Mavrakis等，2009年8 |
| 意大利面条壁球- GFP（Sqh - GFP） | 肌球蛋白2 | Royou等，2002年6 |
| E - cadherin的GFP（ECAD - GFP） | 细胞与细胞结 | 小田等，2001年23 |
| GFP - Moesin | F -肌动蛋白 | Kiehart等，2000年第24 |
| Utrophin金星（Utro金星） | F -肌动蛋白 | Sokac等，未公布结果 |
有用的股票为成像飞胚胎细胞形状的变化见表2。
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Discussion
本文所述的协议将允许生活，在发展中国家果蝇胚胎的细胞形态变化的共焦成像。成像GFP的股票，可以由个人实验室（见表2）准备，但许多这类股票也公开如布卢明顿果蝇联合中心的中心在美国印第安纳大学（ http://flystocks.bio.indiana.edu）和捕蝇草在美国耶鲁大学（ http://flytrap.med.yale.edu ）联合中心。一旦获得这些实时成像数据，然后可以搭配定量分析，以彻底确定蛋白质的功能，亚细胞的活动和生物物理参数，驱动细胞形状的变化和组织形态发生。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们非常感谢埃里克Wieschaus，提供了该协议开发的基础上。我们的工作是一个贝尔纳Marrs麦克莱恩部生物化学与分子生物学启动奖，贝勒医学院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Cover slips 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Scintillation vials with caps | VWR international | 66021-533 | |
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Yellow pipet tips | Rainin | L200 | |
| Stainless steel mesh, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| P4 Filter paper | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Rubber bands | Office Max | A620645 | |
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | |
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| Razor blades | VWR international | 55411-050 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto Agar | VWR international | 90000-760 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | |
| Paper towels, C-fold | Kleenex | ||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | ||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
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