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Biology

जहाँ रहते इमेजिंग सेल आकार बदलें ड्रोसोफिला भ्रूण

doi: 10.3791/2503 Published: March 30, 2011

Summary

फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, के प्रारंभिक विकास सेल आकार में परिवर्तन है कि अच्छी तरह से इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए अनुकूल हैं की एक संख्या के द्वारा विशेषता है. यह आलेख ड्रोसोफिला भ्रूण का जीना confocal इमेजिंग के लिए आवश्यक बुनियादी उपकरणों और तरीकों का वर्णन होगा, और एक सेल आकार cellularization बुलाया परिवर्तन पर ध्यान दिया जाएगा.

Protocol

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1. भ्रूण संग्रह कप इकट्ठा

  1. एक रेजर के साथ एक 100 एमएल त्रिकोणीय मकई बीकर के नीचे कट बंद, संभव के रूप में चिकनी के रूप में में किनारे कर रही है. कप आसान संभाल करने के लिए यदि आप भी ऊपर के बंद तीन कोनों में कटौती कर रहे हैं, हालांकि यह बिल्कुल आवश्यक नहीं है.
  2. तार मेष (6 से.मी. x 6 सेमी) के एक वर्ग कट. एक पूर्व गर्म गर्म थाली पर, एक धूआं हुड, परत भारी कर्तव्य एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के शीर्ष पर तार की जाली वर्ग के अंदर. गर्म जाल पर मजबूती से कटौती कप के नीचे बढ़त पुश. कुछ सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें, और अब संलग्न जाल के साथ कप उठा. यदि पन्नी भी चिपक जाता है, बस इसे दूर छील.
  3. रातोंरात कप कूल. ठीक अनाज sandpaper के साथ किसी भी तेज किनारों से कैंची से अधिक जाल, और रेत निकालें.

2. सेब का रस अग्रवाल प्लेट्स बनाओ

  1. एक 6L फ्लास्क में, 100 ग्राम बी.डी. Bacto अग्रवाल और 3L आसुत जल गठबंधन. धीमी निकास स्थापना पर 30 मिनट के लिए अगर आटोक्लेव.
  2. हलचल पट्टी के साथ एक 2L फ्लास्क में 100 ग्राम sucrose, 1L सेब रस और छह छ पी Hydroxybenzoic एसिड संयोजन है. हीट करने के लिए उबलते जबकि एक गर्म थाली पर सरगर्मी समाधान. अधिक से अधिक 2 मिनट के लिए फोड़ा मत करो. सेब का रस मिश्रण ठंडा है, और फिर हलचल अगर करने के लिए पट्टी के साथ जोड़ दें. पूरी तरह से मिलाएं.
  3. 60x15 मिमी पेट्री डिश में गिरने से पहले एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शांत संयुक्त समाधान की अनुमति दें. वैकल्पिक रूप से, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए अगर बग़ैर इस्तेमाल किया जा सकता है. प्लेटें कम से कम 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें. 4 में गीला पेपर तौलिए और स्टोर की एक परत डिग्री सेल्सियस के साथ Rubbermaid कंटेनरों में ढेर

नोट:

  • गिरने या सर्दी में, यह आवश्यक हो सकता है अगर करने के लिए पानी की एक अतिरिक्त 100 एमएल जोड़ सकते हैं.
  • पेट्री डिश के ब्रांड महत्वपूर्ण है! केवल बी.डी. फाल्कन व्यंजन त्रिकोणीय मकई beakers फिट बैठते हैं. सामग्री तालिका में विशिष्ट आदेश जानकारी के नीचे पाया जा सकता है.

3. भ्रूण संग्रह कप के लिए GFP मक्खियों जोड़ें

  1. अपने संग्रह की जरूरत के अनुसार की बोतलों की स्थापना करके GFP शेयरों का विस्तार इमेजिंग के लिए लगभग दो सप्ताह पहले मक्खियों. मक्खियों की एक बोतल आमतौर पर पर्याप्त से अधिक के लिए 50 महिलाओं और 30 पुरुषों की एक न्यूनतम के साथ एक भ्रूण संग्रह कप को भरने. सबसे अच्छा बिछाने के लिए, मक्खियों नव eclosed (यानी कम से कम 5 दिन - अंडे सेने के बाद).
  2. एक लगभग बराबर भागों लाल सितारा सक्रिय सूखी खमीर और आसुत जल के साथ एक छोटे कप भरने के द्वारा पेस्ट खमीर करें, और हलचल जब तक खमीर भंग कर रहा है. पेस्ट गीला मूंगफली का मक्खन की अनुमानित निरंतरता चाहिए. और खमीर या पानी स्थिरता बदल करने के लिए जोड़ा जा सकता है. खमीर पेस्ट कई दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संग्रहीत किया जाना चाहिए, कवर, 4 डिग्री सेल्सियस
  3. एक बार खमीर पेस्ट तैयार है, 4 से सेब का रस प्लेटें निकालने ° सी भंडारण. स्ट्रीक सेब का रस खमीर पेस्ट के साथ प्लेटें, और उन्हें 22-25 के लिए गर्म करने की अनुमति ° सी, जो अंडे बिछाने प्रोत्साहित करेंगे.
  4. आधा में एक परिपत्र फिल्टर पेपर मोड़ो, तो आधे में फिर से. 8-9 सेमी व्यास के लिए छाँटो, और तिमाही सर्कल में accordion सिलवटों. सर्कल उधेड़ना, पलटना, और यह एक संग्रह कप में सम्मिलित जब तक यह जाल छूता है. सुनिश्चित करें कि कागज कप में सुरक्षित है इतना है कि यह नहीं आते हैं और मक्खियों को कुचलने करता. फिल्टर पेपर वैकल्पिक है, लेकिन संभोग के लिए एक स्वागत करते वातावरण प्रदान करता है, और कप में नमी बनाए रखता है.
  5. लेबल शेयर नाम और तारीख के साथ एक कप. बोतल से संग्रह कप के लिए धीरे कप पर औंधा बोतल मिलाते हुए, और तुरंत तैयार सेब का रस की थाली के साथ कप कवर मक्खियों स्थानांतरण. एक रबर बैंड के साथ कप प्लेट सुरक्षित. कप प्रत्यक्ष प्रकाश के साथ एक क्षेत्र में जाल पक्ष सेट अप. सुनिश्चित करें कि कोई छाया कप पर गिर जाते हैं, के रूप में मक्खियों अच्छी तरह से अंधेरे में नहीं रखना होगा.
  6. बदलें सेब का रस प्लेट के रूप में की जरूरत है. दो घंटे संग्रह, कमरे के तापमान पर, इमेजिंग cellularization के लिए अच्छी तरह से काम.

4. बढ़ते चैंबर तैयार

  1. भ्रूण के लिए एक बढ़ते कक्ष तैयार करने के लिए, डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा 2-3 सेमी लंबे समय में कटौती और यह किसी स्लाइड पर जगह, टेप और स्लाइड की लंबी अक्ष aligning. एक दूसरे 2-3 सेमी डबल पक्षीय टेप और यह टेप के अन्य टुकड़े के शीर्ष पर परत की लंबी टुकड़ा काट, सुनिश्चित करें कि उनके किनारों गठबंधन कर रहे हैं.
  2. एक धार का प्रयोग, दो लगभग 3 मिमी अलावा टेप और सीधा करने के लिए स्लाइड की लंबी अक्ष के केंद्र में कटौती करना. के लिए एक चैनल बनाने में कटौती के बीच टेप निकालें. Pipet चैनल में हेलोकार्बन 27 तेल की एक बूंद. इस चैनल है जहां भ्रूण बढ़ जाएगा.

नोट:

  • केवल आधा इंच स्कॉच डबल पक्षीय टेप भ्रूण को समायोजित करने के लिए सही मोटाई है.
  • हेलोकार्बन 27 तेल ऑक्सीजन पारगम्य है, और ऑक्सीजन विनिमय की अनुमति देता है, जबकि भ्रूण निर्जलीकरण को रोकने. इसके अपवर्तक सूचकांक के कारण, हेलोकार्बन 27 तेल भी मंचन के लिए आदर्श हैऔर इमेजिंग भ्रूण.

5. Dechorionate भ्रूण

  1. इकट्ठा करने और dechorionate भ्रूण करने के लिए, पर्याप्त पूरी तरह से पूरी सतह डूब सेब का रस अगर प्लेट पर 50% ब्लीच डालना. Zeiss डिस्कवरी V8 प्रेषित प्रकाश के साथ के रूप में एक विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग, घड़ी के लिए भ्रूण को अपने chorion से रिलीज करने के लिए. जैसे ही के रूप में chorion loosens और कुछ भ्रूण (30-60 सेकंड) से रिलीज, ब्लीच और भ्रूण के एक सेल झरनी में डालना.
  2. झरनी में भ्रूण एक धारा निकलना बोतल से आसुत जल के साथ तुरंत और सख्ती से धो. कागजी तौलिए पर थपका झरनी. यदि किसी भी गुलाबी तौलिया पर dabbing बाद देखा जाता है, पानी के साथ भ्रूण धोने जारी है.
  3. 10-50 भ्रूण हस्तांतरण के लिए एक साफ सेब का रस प्लेट (कोई खमीर पेस्ट के साथ) एक नम तूलिका का प्रयोग करें. दूर एक कागज तौलिया के फटे बढ़त के साथ पानी बाती, और तुरंत हेलोकार्बन 27 तेल की एक छोटी राशि के साथ भ्रूण को कवर.

नोट:

  • Clorox ब्लीच का उपयोग न करें. इसके बजाय, एक ऑस्टिन A-1 वाणिज्यिक ब्लीच, जो <6% सोडियम hypochlorite है जैसे ब्रांड का उपयोग करें.
  • अधिक विरंजन या rinsing अपर्याप्त अनियमित cellularization के साथ भावुक भ्रूण में परिणाम देगा.

6. स्टेज और माउंट भ्रूण

  1. प्रेषित प्रकाश के साथ विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, रूपात्मक 20 Bownes के दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए थाली पर भ्रूण चरण. संदंश का प्रयोग, 5 mitotic चक्र 11 या 12 भ्रूण स्थानांतरण, Bownes 4 चरण के लिए इसी बढ़ते चैम्बर के चैनल में. एक लाइन में भ्रूण पृष्ठीय और उदर पक्षों दिखाई और पार्श्व नीचे की ओर के साथ व्यवस्थित करें. भ्रूण आसानी से तेल में इस अकेले अभिविन्यास में व्यवस्थित होते हैं. भीड़ भ्रूण को एक साथ मत के रूप में वे ऑक्सीजन की उनके पड़ोसियों वंचित एक बार कवर पर्ची नीचे लागू किया जाता है. (उन दोनों के बीच एक भ्रूण की लंबाई के लगभग आधा छोड़ो).
  2. एक 25x25 मिमी कवर का एक किनारे लेटाओ चैनल के एक पक्ष में डबल पक्षीय टेप पर पर्ची. कवर पर्ची ड्रॉप करने के लिए चैनल को कवर करने के लिए. यदि हवा नीचे पकड़ा है, कवर पर्ची के किनारे पर हेलोकार्बन 27 तेल की एक छोटी राशि लागू होते हैं. केशिका कार्रवाई चैनल में तेल खींचने के लिए और हवा से बाहर धक्का होगा.

नोट:

  • भ्रूण मचान के लिए एक और उत्कृष्ट संसाधन निम्नलिखित है: Campos - ओर्टेगा, जावेद और Hartenstein, वी. (1985). ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के भ्रूण के विकास. Springer - वेर्लग, बर्लिन. जबकि इस पुस्तक अब प्रकाशित किया जाता है, इस्तेमाल किया प्रतियां नियमित रूप से Amazon.com पर उपलब्ध हैं.
  • हमेशा हेलोकार्बन 27 तेल किफ़ायत का उपयोग करें. इस बढ़ते आसान कर देगा. यह भी आकस्मिक को रोकने पर तेल की खुर्दबीन उद्देश्य निम्नलिखित इमेजिंग चरणों में बह जाएगा.

7. छवि भ्रूण

  1. आप यहाँ कैसे आगे बढ़ने के पाठ्यक्रम के कक्ष आकार बदलने कि आप इमेजिंग कर रहे हैं, और सवाल यह है कि आप को संबोधित कर रहे हैं द्वारा निर्धारित किया जाएगा. किसी भी आकार बदलने के लिए, या तो एक ईमानदार या उलटा माइक्रोस्कोप पर अपने बढ़ते चैम्बर जगह प्रेषित प्रकाश द्वारा अपने भ्रूण मिल, और तब confocal इमेजिंग के लिए स्विच करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित. Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए सबसे अच्छा है Nikon MicroscopyU (पर चर्चा के रूप में इस तरह के व्यवहार का पालन http://www.microscopyu.com/articles/confocal). के रूप में छोटे लेसर शक्ति संभव के रूप में अपने रहने वाले भ्रूण को उजागर करने में विशेष रूप से कठोर, photobleaching और phototoxicity रोकने के.
  2. Cellularization के लिए, हम एक Zeiss 710 लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन पर छवि, एक सी Apochromat 40x/1.2 डब्ल्यू Corr उद्देश्य का उपयोग कर. इस खुर्दबीन, 18-20 से ° सी. लेकर तापमान के साथ एक कमरे के तापमान नियंत्रित में रखे जाते है जबकि तापमान नियंत्रण बिल्कुल आवश्यक नहीं है, यह माइक्रोस्कोप के लिए बेहतर है और इमेजिंग और अधिक सुसंगत बनाता है. हम नियमित रूप से एक ही विमान में छवि, भ्रूण के बीच के निकट, पार अनुभाग में प्लाज्मा झिल्ली invaginations (चित्रा 2) का पालन करें. बस invagination गतिशीलता का पालन करने के लिए, 30-60 सेकंड के अंतराल समय चूक इमेजिंग के लिए पर्याप्त हैं, और भ्रूण ऑक्सीजन के अभाव का कोई स्पष्ट संकेत के साथ> 90 मिनट के लिए इमेजिंग झेलने चाहिए.
  3. छवियों को प्राप्त करने के बाद, वे छवि विश्लेषण सहित स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से फ्रीवेयर, ImageJ (कहा जाता है संकुल, के किसी भी संख्या का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है http://rsbweb.nih.gov/ij). डेटा तो (1 मूवी) फिल्में, दृश्यों (चित्रा 2), या 21 kymographs के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है.

नोट:

  • पानी विसर्जन सी Apochromat 40x/1.2 डब्ल्यू Corr उद्देश्य भ्रूण के पास इमेजिंग अपने उच्च एपर्चर है, जो जलीय नमूनों में गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए aberrations सीमा की वजह से मध्य वर्ग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और उच्च संकल्प और उच्च फ्लोरोसेंट संकेत देता है. इसके अलावा, इस उद्देश्यएक बहुत लंबे समय तक काम दूरी (220 सुक्ष्ममापी) है. हालांकि, दूसरे पानी या ग्लिसरीन विसर्जन उद्देश्यों को अच्छी तरह से प्रदर्शन करते हैं, खासकर अगर ब्याज की सेल आकार बदलने के भ्रूण सतह के पास imaged किया जा सकता है.

8. वैकल्पिक तरीका: "भ्रूण गोंद" के साथ माउंट भ्रूण

  1. छवि कक्ष आकार cellularization की तुलना में अन्य परिवर्तन करने के लिए, यह एक विशिष्ट अभिविन्यास है कि तेल में आसानी से बनाए रखा नहीं है, अकेले में भ्रूण माउंट करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ऐसा करने के लिए, एक पहले से वर्णित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि बढ़ते उपयोग करें. डबल पक्षीय टेप के एक जगमगाहट शीशी में 250 μL हेपटैन के साथ 20 सेमी के संयोजन के द्वारा "भ्रूण - गोंद" बनाने के द्वारा शुरू करो. Nutator पर जगमगाहट शीशी या घूर्णन मंच प्लेस, और रातोंरात मिश्रण.
  2. भ्रूण गोंद में एक पीला विंदुक टिप डुबकी, और तब किसी स्लाइड के साथ टिप ट्रेस, गोंद का एक निशान छोड़. जबकि हेपटैन evaporating है संरेखित करें, अपने आवश्यक अभिविन्यास में अगर एक ब्लॉक पर भ्रूण का मंचन किया. (याद रखें कि भ्रूण imaged किया जा सतह अगर सामना होना चाहिए, उदाहरण के लिए, उदर कुंड गठन के दौरान छवि कक्ष आकार बदलने के लिए, अपने उदर अगर सामना करना पड़ पक्ष के साथ भ्रूण माउंट.)
  3. गोंद के साथ स्लाइड उलटें, और धीरे से अगर ब्लॉक पर भ्रूण के खिलाफ गोंद के निशान प्रेस. अब फिर से स्लाइड पलटना. भ्रूण उचित ओरिएंटेशन में फंस जाएगा. डबल पक्षीय टेप के भ्रूण के दोनों तरफ दो परतों जोड़ें, हेलोकार्बन 27 तेल के साथ उन्हें कवर, और एक coverslip लागू. ऊपर वर्णित के रूप में इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें.

9. प्रतिनिधि परिणाम:

यदि भ्रूण स्वस्थ हैं और इमेजिंग इष्टतम है, तो cellularization 50-60 मिनट ले, करना चाहिए और प्लाज्मा झिल्ली invaginations लगभग 40 microns प्रवेश करना चाहिए. हालांकि, अगर भ्रूण प्रक्षालित, ऑक्सीजन वंचित या phototoxicity से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं, तो invagination या तो धीमी गति से या बंद हो जाएगा imaged क्षेत्र में विशेष रूप से. भ्रूण के स्वास्थ्य की इस तरह की गिरावट अक्सर बदल विकास, और एक विफलता के लार्वा के रूप में हैच में परिणाम है. इस प्रकार, इमेजिंग के बाद परख भ्रूण स्वास्थ्य के लिए कठोर परीक्षण के लिए, एक humidified कक्ष में अपनी स्लाइड्स रखने और अंडे सेने के लिए अगले दिन घड़ी.

चित्रा 1
चित्रा 1. भ्रूण संग्रह से इमेजिंग कार्यप्रवाह प्रोटोकॉल के वर्कफ़्लो चार मुख्य चरणों में नीचे टूट सकता है. पहले चरण में, सभी व्यक्तिगत आपूर्ति और घटकों तैयार कर रहे हैं और तो भ्रूण कप संग्रह, सेब का रस अगर प्लेट और GFP मक्खियों भ्रूण - बिछाने वातावरण बनाने के लिए एक साथ डाल रहे हैं. दूसरे चरण में, अंडे और भ्रूण कि सेब का रस अगर प्लेटों पर रखी हैं एकत्र कर रहे हैं. तीसरे चरण में भ्रूण की थाली से हटा रहे हैं का मंचन किया, और बढ़ते कक्ष को हस्तांतरित. चौथे चरण में, घुड़सवार भ्रूण एक confocal खुर्दबीन पर imaged हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. Cellularization इमेजिंग के समय चूक से प्रतिनिधि डेटा भ्रूण. पृष्ठीय (डी) और उदर (वी) स्पष्ट रूप से दिखाई दे पक्षों के साथ बढ़ रहे हैं, और उनके बीच के पास imaged पार अनुभाग में प्लाज्मा झिल्ली invaginations का पालन करें. यहाँ दिखाया भ्रूण व्यक्त GFP-मायोसिन-2 6 जांच, जो प्लाज्मा झिल्ली invaginations के सुझावों पर ध्यान केंद्रित . इस प्रकार, समय के साथ इस मोर्चे के ingression ट्रैकिंग दर है जिस पर प्लाज्मा झिल्ली invaginates देता है. 0:00 मिनट समय बिंदु cellularization शुरुआत से मेल खाती है है. 56:00 मिनट समय बिंदु के फौरन बाद, gastrulation भ्रूण के ventral पक्ष पर शुरू होता है. बार 40 microns है.

1 मूवी. Cellularization इमेजिंग के समय चूक से प्रतिनिधि फिल्म इस फिल्म के लिए चित्रा 2 मेल खाती है . Cellularization की संपूर्ण प्रक्रिया का रिकॉर्ड करने के लिए, इमेजिंग पूर्व mitotic 13 चक्र में शुरू कर दिया है, pseudocleavage कुंड प्रतिगमन पर कब्जा, और जारी रखा जब तक gastrulation आंदोलनों भ्रूण के ventral पक्ष पर देखा गया था. छवियाँ एक मिनट के अंतराल पर एकत्र किए गए थे. तीव्रता को अधिग्रहण के बाद बढ़ गया gastrulation आंदोलनों को देखने के लिए यह आसान बनाने.
फिल्म के लिए यहाँ क्लिक करें

विकासात्मक घटना और समय * कक्ष आकार परिवर्तन से संबंधित रोग या मानव स्वास्थ्य के लिए एक कड़ी रहते इमेजिंग के साथ हाल के संदर्भ
छद्म विपाटन कुंड गठन
(4, पीएफ 90 मिनट)
Cytokinesis Polyploidy और कैंसर प्रगति 1 Mavrakis एट अल, 2009 8
काओ अल एट, 2010 9
Cellularization
(5, 130 मिनट पीएफ)
Cytokinesis Polyploidy और कैंसर प्रगति 1 काओ अल एट, 2008 10
Sokac और Wieschaus 11, 2008
Ventral कुंड गठन, mesoderm invagination
(6, पीएफ 180 मिनट)
शिखर कसना; उपकला-mesenchymal संक्रमण कैंसर 2 मेटास्टेसिस फॉक्स और Peifer, 12 २,००७
मार्टिन एट अल, 2009 13
Germband विस्तार
(7, 195 मिनट पीएफ)
संसृत विस्तार न्यूरल ट्यूब दोष 3 Bertet एट अल, 2004 14
Blankenship अल एट, 2006 15
Tracheogenesis
(11, 320 मिनट पीएफ)
उपकला ट्यूब गठन और शाखाओं में बंटी 4 Angiogenesis Caussinus एट अल. 16, 2008
Gervais और Casanova 17, 2010
पृष्ठीय बंद
(14, पीएफ 620 मिनट)
शिखर कसना घाव 5 उपचार Gorfinkiel एट अल, 2009 18
Solon एट अल, 2009 19

सेल आकार में परिवर्तन की तालिका 1. उदाहरण रह मक्खी भ्रूण में imaged
* Bownes चरण संख्या और निषेचन के बाद का समय (पीएफ), जब प्रत्येक घटना शुरू होता है, Campos - ओर्टेगा, 1985 के अनुसार सूचीबद्ध हैं.

शेयर फ्लाई लेबल मूल संदर्भ
स्पाइडर GFP-(95-1) प्लाज्मा झिल्ली Morin अल एट, 2001 22
Resille GFP-(117-2) प्लाज्मा झिल्ली Morin अल एट, 2001 22
GAP43 - वीनस प्लाज्मा झिल्ली Mavrakis एट अल, 2009 8
स्पैगेट्टी स्क्वैश GFP (Sqh - GFP) मायोसिन-2 Royou एट अल, 2002 6
ई cadherin GFP (Ecad - GFP) सेल - सेल जंक्शनों ओडीए अल एट, 2001 23
GFP-Moesin F-actin Kiehart एट अल, 2000 24
Utrophin वीनस (Utro - वीनस) F-actin Sokac एट अल. अप्रकाशित परिणाम

मक्खी भ्रूण में इमेजिंग सेल आकार बदलने के लिए तालिका 2 उपयोगी शेयरों

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Discussion

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प्रोटोकॉल वर्णित इस के साथ साथ रहते हैं, मक्खी भ्रूण के विकास में सेल आकार में परिवर्तन का एक नंबर के confocal इमेजिंग की अनुमति होगी. इमेजिंग के लिए GFP शेयरों एक व्यक्ति प्रयोगशाला (तालिका 2) द्वारा तैयार किया जा सकता है है, लेकिन कई ऐसे शेयरों को भी सार्वजनिक ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र के रूप में केन्द्रों से इंडियाना ( विश्वविद्यालय में उपलब्ध http://flystocks.bio.indiana.edu) और मक्खियों को फंदा येल विश्वविद्यालय (स्टॉक केंद्र http://flytrap.med.yale.edu ). एक बार अधिग्रहीत इन रहते इमेजिंग डेटा तो मात्रात्मक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है अच्छी तरह से प्रोटीन कार्यों, उप सेलुलर गतिविधियों, और biophysical पैरामीटर है कि ड्राइव कक्ष आकार परिवर्तन और ऊतक morphogenesis को परिभाषित.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम कृतज्ञता एरिक Wieschaus, जो नींव है जिस पर यह प्रोटोकॉल विकसित किया गया था प्रदान स्वीकार करते हैं. हमारा काम जैव रसायन वेरना और Marrs मैकलीन विभाग और आण्विक जीवविज्ञान शुरू हुआ पुरस्कार, चिकित्सा के Baylor कॉलेज के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slides Fisher Scientific 12-550-343
Cover slips 25x25 Fisher Scientific 1 2-524C
Squirt bottles (H2O) Fisher Scientific 02-897-11
50 ml Falcon tubes Fisher Scientific 14-432-22
Bulbs for small pipets, 1 mL Fisher Scientific 03-448-21
Scintillation vials with caps VWR international 66021-533
Tri-Corn Beakers, 100 mL Electron Microscopy Sciences 60970
BD Falcon Petri dish 60x15mm Fisher Scientific 08757 100B
BD Falcon Cell strainer Fisher Scientific 08-771-2
Yellow pipet tips Rainin L200
Stainless steel mesh, 304, 12x24 Small Parts, Inc. CX-0150-F-01
Glass 5¾ inch Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20B
P4 Filter paper Fisher Scientific 09-803-6F
Rubber bands Office Max A620645
Scotch double-sided tape, ½ inch Office Max A8137DM-2
Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 Jerry’s Artarama 56460
Dumont #5 Forceps High Precision Inox Electron Microscopy Sciences 72701-DZ
Razor blades VWR international 55411-050
Halocarbon Oil 27 Sigma-Aldrich H 8773
Heptane Fisher Scientific H360-1
BD Bacto Agar VWR international 90000-760
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
p-Hydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich H5501
Red Star Active Dry Yeast LeSaffre 15700
Paper towels, C-fold Kleenex
Heavy duty aluminum foil Reynolds Wrap
Bleach Austin’s A-1 Commercial
100% Apple juice Ocean Spray or Tree Top

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
  2. Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
  3. Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
  4. Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
  5. Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
  6. Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
  7. Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
  8. Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
  9. Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. (2010).
  10. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
  11. Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
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  13. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
  14. Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
  15. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
  16. Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
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Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503, doi:10.3791/2503 (2011).More

Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503, doi:10.3791/2503 (2011).

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