Summary
Поведение тесты для измерения опорно-двигательной функции, обучения и памяти, способности в
Abstract
Достижения в области генетических методов позволило изучение генов, участвующих в человеческом нейродегенеративных заболеваний с использованием дрозофилы как модельной системы 1. Большинство из этих заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезнь Хантингтона характеризуются возрастных ухудшения в процессе обучения и памяти, функций и координацию движений 2. Здесь мы используем поведенческие тесты, в том числе отрицательный анализ geotaxis 3 и отвращение phototaxic анализа подавления (APS анализа) 4,5, чтобы показать, что некоторые из поведения характеристик, связанных с человеческим нейродегенерации могут быть обобщены в мух. В отрицательном анализе geotaxis, естественная тенденция мух двигаться против силы тяжести, когда взволнованный используется для исследования генов или условия, которые могут помешать опорно-двигательной способности. В анализе APS, обучения и памяти функции тестируются в положительно phototactic мухи обучение связать свет с неприятным горьким вкусом и, следовательно, избежать этого, в противном случае естественная тенденция двигаться к свету. Тестирование этих обученных мух 6 часов после обучения используется для оценки функции памяти. С помощью этих анализов, вклад какого-либо генетических или экологических факторов по отношению к развивающимся нейродегенерации может быть легко учился в мух.
Protocol
1. Введение
В этом видео мы продемонстрируем два поведенческих тестов использованием дрозофилы, чтобы продемонстрировать измерения движения и обучения и памяти функции, которые оказываются под угрозой в нейродегенеративных расстройств. Во-первых, мы покажем, как опорно-двигательного поведения может быть измерена с помощью отрицательного анализа geotaxis. Во-вторых, мы проведем оценку обучения и памяти, способности использованием положительно phototactic мух, которые обучаются ассоциировать света с неприятным горьким вкусом, а затем протестированы через 6 часов для оценки функций памяти. Наконец, мы будем обсуждать последствия и ограничения этих поведение анализов.
2. Оборудование и реактивы
- Fly работы
- Стерео область (Zeiss)
- Малые кисти для толкания мух
- Дрозофилы углекислого газа (CO 2), наркозный аппарат (Geneseesci, Inc)
- Отрицательные Пробирной Geotaxis
- 28,5 х 95 мм Полистирол флакон (Capitol флакон, Inc)
- Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International)
- Sharpie ручки
- Скотч
- Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной
- Хинин гидрохлорид (Sigma Aldrich, CAS номер: 6119-47-7)
- Дистиллированная вода
- Цифровая измерительная шкала для точного разбавления по весу
- Быстрый Отсоедините разъемы, полиэтилен высокой плотности (Nalgene VWR Каталог номер 62868-021)
- 15 мл Центрифуга Тюбе (VWR International), разрезать на 2 мл знаком с закрытым концом, чтобы соответствовать с быстрой адаптер Разъем для Отключите источник света
- Одноканальный 200 мкл pipetter загрузить хинин раствор на фильтровальной бумаге подкладка камеры
- Т-Maze (простой поведенческой системы; Рисунок 1)
- Алюминиевая фольга
- Источник света (Zeiss)
- Лампу с красным светом.
- Фильтровальная бумага
- Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International)
3. Подготовка мух
- Мухи ведутся на стандартных фуражное зерно-агар-патоки-дрожжевой среде при 25 ° С на 12 ч свет / темно-цикла.
- Девы мухи изолированы под наркозом углекислого газа в день eclosion. Для старения, мух ведутся в группах по двадцать на флакон и переданы в свежем флакон каждые 3 дня. Важно использовать родной брат летает из той же родительской кресте за старения, чтобы свести к минимуму различия, связанные с генетическими фонов.
- Для обоих тестов, мухи сексуальны и поддерживается группами по десять мух на флакон. Гендерных различий на поведение является значительным и желательно не смешивать мужские и женские мухи в исследовании как данные могут быть трудно интерпретировать и воспроизводить 6.
- При отрицательном анализе geotaxis, мух разбиты на группы по десять на флакон и испытаны в течение часа после наркоза. Важно, чтобы мухи восстановить полностью из наркоза, поскольку это может оказать влияние на опорно-двигательной деятельности.
- Для анализа APS, мух каждой группы помещаются в пустой флакон полистирола с водой смоченной фильтровальной бумаги в течение шести часов до анализа не производится. Это гарантирует, что мухи от голода до анализа и будет наиболее восприимчив к неприятным вкусом. Перед анализ проводится, каждый летать из группы десяти помещается в пустую 15 мл центрифужную пробирку, которую затем ограничен свободно, чтобы не убежать.
4. Отрицательные Пробирной Geotaxis
- Geotaxis обычно измеряется в течение десяти до двадцати групп из десяти особей того же генотипа или лечения (100-200 мух итог для каждого генотипа / лечение) 7. Сортировать группы из десяти женщин или мужчин летает на CO 2 аппарата анестезии и место каждой группы в отдельную пробирку. Позвольте по крайней мере, один час для мух, чтобы оправиться от наркоза.
- Подготовка восхождения аппарата для каждой группы, так, что два пустых флаконов полистирола вертикально соединены лентой лицом друг к другу. Важно, чтобы убедиться, что отверстия флаконы идеально ровные друг с другом, чтобы обеспечить даже восхождение поверхность для мух.
- Для нижней флакон, измерять расстояние по вертикали от 8 см выше поверхности дна и пометить каждый флакон, нарисовав окружность вокруг всей окружности флаконе.
- Передача группу из десяти летит в нижний флакона тщательно предотвращения побега любой летать. Немедленно закрыть нижнюю флакон с верхней флакон и ленты надежно возле связавшись отверстия. Разрешить мух для адаптации к новой настройки в течение 1 минуты до проведения анализа.
- Аккуратно нажмите летит вниз на дно флакона и измерить количество мух, которые могут подняться выше 8-см знака через 10 секунд после крана.
- Повторите этот тест для той же группы в десять раз, что позволяет в течение 1 минуты период отдыха между каждой попытке.
- Запись количества мух в группе, которая прошла 8-см пометить какПроцент от общего числа мух.
5. Отвращение Фототаксис борьбе анализ (APS Пробирной)
Изначально взято из Ле Бур и Бюхер (2002) 4, этот анализ подвиги положительное поведение phototactic у мух, чтобы обучить их, чтобы связать свет с стимулы отвращение (в данном случае, горький вкус хинина). После обучения / кондиционирования фазы, диких мух типа смогут ассоциировать освещенной зоне со вкусом отвращение и избегать его. Мухи с ослабленной возможности обучения будет не в состоянии сделать этого объединения. Кроме того, анализ APS может также использоваться для измерения краткосрочных функцией памяти мух 5, подвергая уже подготовленных летит в тот же тест 6 часов после кондиционирования проверить свои способности в запоминании узнал задачи.
- Подготовка Хинин решения
- Растворите хинина гидрохлорида в дистиллированной воде, чтобы сделать 0,1 М раствора акций (1.98g в 50 мл дистиллированной воды). Маточный раствор можно хранить при температуре -20 ° С до года в небольших аликвот
- Подготовка рабочего раствора 1 мкМ путем разбавления исходного раствора в дистиллированной воде.
- Подготовка Т-Maze
- Т-лабиринт состоит из центральной колонки с люк и два независимых камер, "темный" камеры и "засветившихся" камеры (рис. 1).
- Палата приготовления: взять две 15 мл пластиковые пробирки центрифуги и сократить в 2 мл знаком со дна закрытым концом с ручной пилой. Установите разъем адаптера на каждом конце, и печатью связи с парафильмом. Адаптер на конце трубки служит входной разъем для источника света гусиная шея. Подключите один трубку с источником света и эта трубка будет "засветившихся" камеры. Оберните другую трубу с алюминиевой фольгой, чтобы служить в качестве «темной» камеры.
- Добавить 180uL либо дистиллированную воду или хинин решение фильтровальную бумагу и поместите в свет камеры.
- Соберите Т-образном лабиринте при помощи винтов освещенных и темных камерах с каждой стороны от центральной колонки, с люком в середине закрытых (рис. 1).
- Вставьте источник света на освещенную камеру.
- Обучение мухи, чтобы подавить фототаксис с отвращение стимулы
- Отвинтите темной камере от Т-образном лабиринте и передачи одного летать в эту камеру и сразу же винт темно трубку обратно в лабиринт.
- Выключите свет в комнате и включить красный фонарь.
- Разрешить летать, чтобы акклиматизироваться в темной камере в течение 30 секунд и медленно включите источник света освещает освещенной камере. Медленно откройте люк, который отделяет две камеры.
- Если лететь идет к освещенной камере в течение 10 секунд, он считается положительно phototactic и готов быть обучены для анализа. Неудача в фототаксис указывает на проблемы в зрительной системе и летит с отрицательным фототаксис должны быть исключены из анализа.
- Для отвращение Фототаксис борьбе (APS), обучение, нажмите летать, которые продемонстрировали положительный фототаксис обратно в темную комнату, закройте люк и выключить свет. Разрешить 30 секунд акклиматизации. За это время положить фильтровальную бумагу с хинином раствора в освещенную камеру. Медленно откройте люк и включите свет. Разрешить летать ходить в хинин покрытием освещенной камере. Через одну минуту, нажмите лететь обратно в темную камеру и повторите это еще 9 раз. (Как правило, дикого типа мухи избежать освещенной камере после 3-х до 5 испытаний обучения.)
- Сразу же после тренировки, пять испытаний тест будет проводиться. В каждом тесте суда, позволит через 10 секунд после свет включается на обучение летать ходить на освещенную камеру. Отказ идти к освещенному флакон будет записан как "Pass", которое эквивалентно "Задача, извлеченные в ходе подкрепление". Проходной балл в течение пяти последовательных испытаний записывается и показано на рисунке 2, как PC0 (0 ч после кондиционирования).
- Оценка кратковременной памяти Функция в Мухи
- После обучения и начальной PC0 записей, каждая муха помещены обратно в исходное флакон пищи и держали в стороне в течение шести часов.
- Шесть часов после подготовки, с учетом каждого лететь в 5 испытаниях снова таким же образом, как и прежде, и записывать, сколько раз летать избегает (пропуск) или переходит в (провал) освещенные флаконе. Это проходной балл, отражается в качестве PC6 (6 часов после кондиционирования), который является показателем кратковременной памяти.
6. Интерпретация данных и статистический анализ
- Отрицательные Пробирной Geotaxis
- Сырые данные, полученные из этого анализа представляет собой количество мух пересечении 8-см отметку в 10 секунд в каждой группе. Преобразование это процент и вычислить среднюю скорость передачи для каждой группы в течение 10 сессий.
- Данные представлены графически в виде среднем пропуск на группу (генотип, лечение и т.д.) с стандартная ошибка среднего (SEM).
- Различия между группамиможет быть определена как статистически значимые или не использования студенческих Т-тест или ANOVA.
- Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной
- Необработанные данные из этого анализа представляется как число выступлений каждого летать избегает освещенных камеры в пяти последовательных испытаний. Пройти курс рассчитывается как процент успешных испытаниях избежание более общего исследования. Рассчитать среднюю скорость передачи таким образом, в течение минимум 15 мух на группы.
- Данные графически представлены как средняя скорость передачи PC0 (сразу после кондиционирования; "обучения" индикатор) или средней скорости передачи PC6 (6 часов после кондиционирования; «память» индикатор) с соответствующими SEM.
- Обучение и память индексы сравниваются между группами и с диким типом и "генетически манипулировали-доброкачественная" группу (например, GFP гиперэкспрессией мух) соответственно.
7. Представитель Результаты
В этом видео-эксперимент, мы оцениваем обучения и памяти и моторных дефицитов у мух гиперэкспрессией человека Тау в центральной нервной системе и сравнение их эффективности с тех мух гиперэкспрессией GFP. Нейронные гиперэкспрессия человека Тау у дрозофилы было показано, что причиной тяжелых вакуолизация в головном мозге 8 и привести к значительному дефициту в процессе обучения и памяти функции 9. Как показано на рисунке 2А, 10 день старого мужчины или женщины мухи гиперэкспрессией человека Тау имеют значительный дефицит двигательной по сравнению с подобранных по возрасту GFP гиперэкспрессией мух. Кроме того, эти мухи не удалось связать свет с горьким вкусом, как показано на PC0 проходной балл по сравнению с контрольной группой, а также не вспомнить эту ассоциацию как показали снижение PC6 проходной балл (рис. 2В). Этот эксперимент подтверждает, что дальнейшее дрозофилы модели могут быть использованы для изучения человеческих нейродегенеративных заболеваний и сводный некоторые поведенческие фенотипы наблюдается у человека и млекопитающих.
Рисунок 1. Т-Maze установки для отвращение Пробирной борьбе Фототаксис. A. Общей экспериментальной установки для эксперимента APSA с источником света связано с "засветившихся" Сокол трубки с подкладкой из фильтровальной бумаги и "темная" труба слева (покрыта фольгой), разделенных люк. Б. Во время фазы обучения и тестирования, муха в темной камере и люк открыт после свет включен в освещенную камеру.
Рисунок 2. Представитель результаты отрицательные geotaxis и APS эксперимент с использованием мухи гиперэкспрессией GFP или Тау с пан-нейронов водителя. A. В отрицательном анализе geotaxis, 10-дневный летний мужчина (синий столбец) или женский (красный столбец) мухи гиперэкспрессией GFP показали более высокие восхождение активность, чем Тау с гиперэкспрессией мух. B. 20-дневных самок гиперэкспрессией GFP показал лучшее обучение (PC0) и памяти (PC6) функций, чем Тау гиперэкспрессией мух.
Discussion
Оба отрицательных geotaxis и APS анализы надежную поведенческие тесты для измерения изменений в опорно-двигательной или обучения и оперативной памяти, связанных с генетическими или экологическими манипуляции. Однако Есть некоторые недостатки этих анализов, которые ожидают дальнейшей оптимизации.
В отрицательном анализе geotaxis, мутации в определенных генах могут оказать тяжелой дисфункции двигателя в мух. В таких случаях, мухи вряд ли лезть на стену в ответ на гравитацию на агитацию. Другие анализы поведения, которые непосредственно измерить движение может быть более подходящим. Эти анализы включают рефлекса поведения, что меры, паралич и захват 10 и 11 оптомоторных поведения, которая записывает потеря координации движений.
В анализе APS, первым препятствием может быть мухи случайно остановки у входа в освещенную камеру, не двигаясь вперед. Это становится тем более важной проблемой, если старение является одним из условий изучены, так как пожилые мухи менее активны в целом и, как правило, остановитесь и отдохните в течение длительных периодов времени. В этом случае экспериментатор должен предоставить механические стимулы, чтобы способствовать движению, которое не всегда эффективны. Во-вторых, можно утверждать, что отказ ехать в освещенной камере результаты от потери положительный фототаксис. Это редкий случай, так как предыдущие исследования показали, что мухи вернуться к свету отзывчивость раз отрицательный укрепить удаляется 4. В-третьих, продолжительность контакта с раздражителем отвращение могут варьироваться в зависимости от испытания к испытанию. Это изменение, как правило, уменьшается на окружающих внутренней стенке камеры с пропитанной фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить мух от избегая хинина. Кроме того, экспериментатор может гарантировать, что каждый летать проводят достаточно времени в контакте с фильтровальной бумаги, увеличивая количество времени, проведенное в камере от иное 1 минуту.
Таким образом, отрицательное geotaxis и APS анализы быстро и простых способов оценки поведенческих дефицитов и количественно указывают и опорно-двигательного обучения и памяти, способности у дрозофилы. Эти анализы особенно полезны при моделировании нейродегенеративных заболеваний человека у дрозофилы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Чарльза Luetje за предоставление Т-образном лабиринте и поведения комнате. Эта работа проводится при поддержке Американской ассоциации сердца (на Ю.), Национального института неврологических расстройств и инсульта Грант R01NS64269 (для RGZ) и Благотворительный фонд Пью (до RGZ).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Vial | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb. |
Dissecting Stereoscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 2 branches goose-neck light guide (12V/30W) |
Quinine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | Dissolve in distilled water. |
Quick Disconnect Connectors | Nalge Nunc international | 62868-021 | High-Density Polyethylene |
T-Maze | Simple Behavioral Systems | ||
Single-channel 200 μL pipette | Eppendorf | 022443305 |
References
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Lloyd, T. E. &, Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).
- Le Bourg, E., Buecher, C. Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster. Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster. Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).
- Leal, S. M., Neckameyer, W. S. Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).
- Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons. Learn Mem. 11, 277-287 (2004).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 100, 597-614 (1982).
- Hall, J. C. Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system. J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).