Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Опорно-двигательного опробование, обучение и память Дефицит Drosophila Модели нейродегенерации

Published: March 11, 2011 doi: 10.3791/2504

Summary

Поведение тесты для измерения опорно-двигательной функции, обучения и памяти, способности в

Abstract

Достижения в области генетических методов позволило изучение генов, участвующих в человеческом нейродегенеративных заболеваний с использованием дрозофилы как модельной системы 1. Большинство из этих заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезнь Хантингтона характеризуются возрастных ухудшения в процессе обучения и памяти, функций и координацию движений 2. Здесь мы используем поведенческие тесты, в том числе отрицательный анализ geotaxis 3 и отвращение phototaxic анализа подавления (APS анализа) 4,5, чтобы показать, что некоторые из поведения характеристик, связанных с человеческим нейродегенерации могут быть обобщены в мух. В отрицательном анализе geotaxis, естественная тенденция мух двигаться против силы тяжести, когда взволнованный используется для исследования генов или условия, которые могут помешать опорно-двигательной способности. В анализе APS, обучения и памяти функции тестируются в положительно phototactic мухи обучение связать свет с неприятным горьким вкусом и, следовательно, избежать этого, в противном случае естественная тенденция двигаться к свету. Тестирование этих обученных мух 6 часов после обучения используется для оценки функции памяти. С помощью этих анализов, вклад какого-либо генетических или экологических факторов по отношению к развивающимся нейродегенерации может быть легко учился в мух.

Protocol

1. Введение

В этом видео мы продемонстрируем два поведенческих тестов использованием дрозофилы, чтобы продемонстрировать измерения движения и обучения и памяти функции, которые оказываются под угрозой в нейродегенеративных расстройств. Во-первых, мы покажем, как опорно-двигательного поведения может быть измерена с помощью отрицательного анализа geotaxis. Во-вторых, мы проведем оценку обучения и памяти, способности использованием положительно phototactic мух, которые обучаются ассоциировать света с неприятным горьким вкусом, а затем протестированы через 6 часов для оценки функций памяти. Наконец, мы будем обсуждать последствия и ограничения этих поведение анализов.

2. Оборудование и реактивы

  1. Fly работы
    • Стерео область (Zeiss)
    • Малые кисти для толкания мух
    • Дрозофилы углекислого газа (CO 2), наркозный аппарат (Geneseesci, Inc)
  2. Отрицательные Пробирной Geotaxis
    • 28,5 х 95 мм Полистирол флакон (Capitol флакон, Inc)
    • Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International)
    • Sharpie ручки
    • Скотч
  3. Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной
    • Хинин гидрохлорид (Sigma Aldrich, CAS номер: 6119-47-7)
    • Дистиллированная вода
    • Цифровая измерительная шкала для точного разбавления по весу
    • Быстрый Отсоедините разъемы, полиэтилен высокой плотности (Nalgene VWR Каталог номер 62868-021)
    • 15 мл Центрифуга Тюбе (VWR International), разрезать на 2 мл знаком с закрытым концом, чтобы соответствовать с быстрой адаптер Разъем для Отключите источник света
    • Одноканальный 200 мкл pipetter загрузить хинин раствор на фильтровальной бумаге подкладка камеры
    • Т-Maze (простой поведенческой системы; Рисунок 1)
    • Алюминиевая фольга
    • Источник света (Zeiss)
    • Лампу с красным светом.
    • Фильтровальная бумага
    • Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International)

3. Подготовка мух

  • Мухи ведутся на стандартных фуражное зерно-агар-патоки-дрожжевой среде при 25 ° С на 12 ч свет / темно-цикла.
  • Девы мухи изолированы под наркозом углекислого газа в день eclosion. Для старения, мух ведутся в группах по двадцать на флакон и переданы в свежем флакон каждые 3 дня. Важно использовать родной брат летает из той же родительской кресте за старения, чтобы свести к минимуму различия, связанные с генетическими фонов.
  • Для обоих тестов, мухи сексуальны и поддерживается группами по десять мух на флакон. Гендерных различий на поведение является значительным и желательно не смешивать мужские и женские мухи в исследовании как данные могут быть трудно интерпретировать и воспроизводить 6.
  • При отрицательном анализе geotaxis, мух разбиты на группы по десять на флакон и испытаны в течение часа после наркоза. Важно, чтобы мухи восстановить полностью из наркоза, поскольку это может оказать влияние на опорно-двигательной деятельности.
  • Для анализа APS, мух каждой группы помещаются в пустой флакон полистирола с водой смоченной фильтровальной бумаги в течение шести часов до анализа не производится. Это гарантирует, что мухи от голода до анализа и будет наиболее восприимчив к неприятным вкусом. Перед анализ проводится, каждый летать из группы десяти помещается в пустую 15 мл центрифужную пробирку, которую затем ограничен свободно, чтобы не убежать.

4. Отрицательные Пробирной Geotaxis

  • Geotaxis обычно измеряется в течение десяти до двадцати групп из десяти особей того же генотипа или лечения (100-200 мух итог для каждого генотипа / лечение) 7. Сортировать группы из десяти женщин или мужчин летает на CO 2 аппарата анестезии и место каждой группы в отдельную пробирку. Позвольте по крайней мере, один час для мух, чтобы оправиться от наркоза.
  • Подготовка восхождения аппарата для каждой группы, так, что два пустых флаконов полистирола вертикально соединены лентой лицом друг к другу. Важно, чтобы убедиться, что отверстия флаконы идеально ровные друг с другом, чтобы обеспечить даже восхождение поверхность для мух.
  • Для нижней флакон, измерять расстояние по вертикали от 8 см выше поверхности дна и пометить каждый флакон, нарисовав окружность вокруг всей окружности флаконе.
  • Передача группу из десяти летит в нижний флакона тщательно предотвращения побега любой летать. Немедленно закрыть нижнюю флакон с верхней флакон и ленты надежно возле связавшись отверстия. Разрешить мух для адаптации к новой настройки в течение 1 минуты до проведения анализа.
  • Аккуратно нажмите летит вниз на дно флакона и измерить количество мух, которые могут подняться выше 8-см знака через 10 секунд после крана.
  • Повторите этот тест для той же группы в десять раз, что позволяет в течение 1 минуты период отдыха между каждой попытке.
  • Запись количества мух в группе, которая прошла 8-см пометить какПроцент от общего числа мух.

5. Отвращение Фототаксис борьбе анализ (APS Пробирной)

Изначально взято из Ле Бур и Бюхер (2002) 4, этот анализ подвиги положительное поведение phototactic у мух, чтобы обучить их, чтобы связать свет с стимулы отвращение (в данном случае, горький вкус хинина). После обучения / кондиционирования фазы, диких мух типа смогут ассоциировать освещенной зоне со вкусом отвращение и избегать его. Мухи с ослабленной возможности обучения будет не в состоянии сделать этого объединения. Кроме того, анализ APS может также использоваться для измерения краткосрочных функцией памяти мух 5, подвергая уже подготовленных летит в тот же тест 6 часов после кондиционирования проверить свои способности в запоминании узнал задачи.

  1. Подготовка Хинин решения
    • Растворите хинина гидрохлорида в дистиллированной воде, чтобы сделать 0,1 М раствора акций (1.98g в 50 мл дистиллированной воды). Маточный раствор можно хранить при температуре -20 ° С до года в небольших аликвот
    • Подготовка рабочего раствора 1 мкМ путем разбавления исходного раствора в дистиллированной воде.
  2. Подготовка Т-Maze
    • Т-лабиринт состоит из центральной колонки с люк и два независимых камер, "темный" камеры и "засветившихся" камеры (рис. 1).
    • Палата приготовления: взять две 15 мл пластиковые пробирки центрифуги и сократить в 2 мл знаком со дна закрытым концом с ручной пилой. Установите разъем адаптера на каждом конце, и печатью связи с парафильмом. Адаптер на конце трубки служит входной разъем для источника света гусиная шея. Подключите один трубку с источником света и эта трубка будет "засветившихся" камеры. Оберните другую трубу с алюминиевой фольгой, чтобы служить в качестве «темной» камеры.
    • Добавить 180uL либо дистиллированную воду или хинин решение фильтровальную бумагу и поместите в свет камеры.
    • Соберите Т-образном лабиринте при помощи винтов освещенных и темных камерах с каждой стороны от центральной колонки, с люком в середине закрытых (рис. 1).
    • Вставьте источник света на освещенную камеру.
  3. Обучение мухи, чтобы подавить фототаксис с отвращение стимулы
    • Отвинтите темной камере от Т-образном лабиринте и передачи одного летать в эту камеру и сразу же винт темно трубку обратно в лабиринт.
    • Выключите свет в комнате и включить красный фонарь.
    • Разрешить летать, чтобы акклиматизироваться в темной камере в течение 30 секунд и медленно включите источник света освещает освещенной камере. Медленно откройте люк, который отделяет две камеры.
    • Если лететь идет к освещенной камере в течение 10 секунд, он считается положительно phototactic и готов быть обучены для анализа. Неудача в фототаксис указывает на проблемы в зрительной системе и летит с отрицательным фототаксис должны быть исключены из анализа.
    • Для отвращение Фототаксис борьбе (APS), обучение, нажмите летать, которые продемонстрировали положительный фототаксис обратно в темную комнату, закройте люк и выключить свет. Разрешить 30 секунд акклиматизации. За это время положить фильтровальную бумагу с хинином раствора в освещенную камеру. Медленно откройте люк и включите свет. Разрешить летать ходить в хинин покрытием освещенной камере. Через одну минуту, нажмите лететь обратно в темную камеру и повторите это еще 9 раз. (Как правило, дикого типа мухи избежать освещенной камере после 3-х до 5 испытаний обучения.)
    • Сразу же после тренировки, пять испытаний тест будет проводиться. В каждом тесте суда, позволит через 10 секунд после свет включается на обучение летать ходить на освещенную камеру. Отказ идти к освещенному флакон будет записан как "Pass", которое эквивалентно "Задача, извлеченные в ходе подкрепление". Проходной балл в течение пяти последовательных испытаний записывается и показано на рисунке 2, как PC0 (0 ч после кондиционирования).
  4. Оценка кратковременной памяти Функция в Мухи
    • После обучения и начальной PC0 записей, каждая муха помещены обратно в исходное флакон пищи и держали в стороне в течение шести часов.
    • Шесть часов после подготовки, с учетом каждого лететь в 5 испытаниях снова таким же образом, как и прежде, и записывать, сколько раз летать избегает (пропуск) или переходит в (провал) освещенные флаконе. Это проходной балл, отражается в качестве PC6 (6 часов после кондиционирования), который является показателем кратковременной памяти.

6. Интерпретация данных и статистический анализ

  1. Отрицательные Пробирной Geotaxis
    • Сырые данные, полученные из этого анализа представляет собой количество мух пересечении 8-см отметку в 10 секунд в каждой группе. Преобразование это процент и вычислить среднюю скорость передачи для каждой группы в течение 10 сессий.
    • Данные представлены графически в виде среднем пропуск на группу (генотип, лечение и т.д.) с стандартная ошибка среднего (SEM).
    • Различия между группамиможет быть определена как статистически значимые или не использования студенческих Т-тест или ANOVA.
  2. Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной
    • Необработанные данные из этого анализа представляется как число выступлений каждого летать избегает освещенных камеры в пяти последовательных испытаний. Пройти курс рассчитывается как процент успешных испытаниях избежание более общего исследования. Рассчитать среднюю скорость передачи таким образом, в течение минимум 15 мух на группы.
    • Данные графически представлены как средняя скорость передачи PC0 (сразу после кондиционирования; "обучения" индикатор) или средней скорости передачи PC6 (6 часов после кондиционирования; «память» индикатор) с соответствующими SEM.
    • Обучение и память индексы сравниваются между группами и с диким типом и "генетически манипулировали-доброкачественная" группу (например, GFP гиперэкспрессией мух) соответственно.

7. Представитель Результаты

В этом видео-эксперимент, мы оцениваем обучения и памяти и моторных дефицитов у мух гиперэкспрессией человека Тау в центральной нервной системе и сравнение их эффективности с тех мух гиперэкспрессией GFP. Нейронные гиперэкспрессия человека Тау у дрозофилы было показано, что причиной тяжелых вакуолизация в головном мозге 8 и привести к значительному дефициту в процессе обучения и памяти функции 9. Как показано на рисунке 2А, ​​10 день старого мужчины или женщины мухи гиперэкспрессией человека Тау имеют значительный дефицит двигательной по сравнению с подобранных по возрасту GFP гиперэкспрессией мух. Кроме того, эти мухи не удалось связать свет с горьким вкусом, как показано на PC0 проходной балл по сравнению с контрольной группой, а также не вспомнить эту ассоциацию как показали снижение PC6 проходной балл (рис. 2В). Этот эксперимент подтверждает, что дальнейшее дрозофилы модели могут быть использованы для изучения человеческих нейродегенеративных заболеваний и сводный некоторые поведенческие фенотипы наблюдается у человека и млекопитающих.

Рисунок 1
Рисунок 1. Т-Maze установки для отвращение Пробирной борьбе Фототаксис. A. Общей экспериментальной установки для эксперимента APSA с источником света связано с "засветившихся" Сокол трубки с подкладкой из фильтровальной бумаги и "темная" труба слева (покрыта фольгой), разделенных люк. Б. Во время фазы обучения и тестирования, муха в темной камере и люк открыт после свет включен в освещенную камеру.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результаты отрицательные geotaxis и APS эксперимент с использованием мухи гиперэкспрессией GFP или Тау с пан-нейронов водителя. A. В отрицательном анализе geotaxis, 10-дневный летний мужчина (синий столбец) или женский (красный столбец) мухи гиперэкспрессией GFP показали более высокие восхождение активность, чем Тау с гиперэкспрессией мух. B. 20-дневных самок гиперэкспрессией GFP показал лучшее обучение (PC0) и памяти (PC6) функций, чем Тау гиперэкспрессией мух.

Discussion

Оба отрицательных geotaxis и APS анализы надежную поведенческие тесты для измерения изменений в опорно-двигательной или обучения и оперативной памяти, связанных с генетическими или экологическими манипуляции. Однако Есть некоторые недостатки этих анализов, которые ожидают дальнейшей оптимизации.

В отрицательном анализе geotaxis, мутации в определенных генах могут оказать тяжелой дисфункции двигателя в мух. В таких случаях, мухи вряд ли лезть на стену в ответ на гравитацию на агитацию. Другие анализы поведения, которые непосредственно измерить движение может быть более подходящим. Эти анализы включают рефлекса поведения, что меры, паралич и захват 10 и 11 оптомоторных поведения, которая записывает потеря координации движений.

В анализе APS, первым препятствием может быть мухи случайно остановки у входа в освещенную камеру, не двигаясь вперед. Это становится тем более важной проблемой, если старение является одним из условий изучены, так как пожилые мухи менее активны в целом и, как правило, остановитесь и отдохните в течение длительных периодов времени. В этом случае экспериментатор должен предоставить механические стимулы, чтобы способствовать движению, которое не всегда эффективны. Во-вторых, можно утверждать, что отказ ехать в освещенной камере результаты от потери положительный фототаксис. Это редкий случай, так как предыдущие исследования показали, что мухи вернуться к свету отзывчивость раз отрицательный укрепить удаляется 4. В-третьих, продолжительность контакта с раздражителем отвращение могут варьироваться в зависимости от испытания к испытанию. Это изменение, как правило, уменьшается на окружающих внутренней стенке камеры с пропитанной фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить мух от избегая хинина. Кроме того, экспериментатор может гарантировать, что каждый летать проводят достаточно времени в контакте с фильтровальной бумаги, увеличивая количество времени, проведенное в камере от иное 1 минуту.

Таким образом, отрицательное geotaxis и APS анализы быстро и простых способов оценки поведенческих дефицитов и количественно указывают и опорно-двигательного обучения и памяти, способности у дрозофилы. Эти анализы особенно полезны при моделировании нейродегенеративных заболеваний человека у дрозофилы.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Чарльза Luetje за предоставление Т-образном лабиринте и поведения комнате. Эта работа проводится при поддержке Американской ассоциации сердца (на Ю.), Национального института неврологических расстройств и инсульта Грант R01NS64269 (для RGZ) и Благотворительный фонд Пью (до RGZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene Vial Capitol Vial, Inc. 28Fly 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb.
Dissecting Stereoscope Carl Zeiss, Inc. 000000-1432-979 2 branches goose-neck light guide (12V/30W)
Quinine Hydrochloride Sigma-Aldrich 6119-47-7 Dissolve in distilled water.
Quick Disconnect Connectors Nalge Nunc international 62868-021 High-Density Polyethylene
T-Maze Simple Behavioral Systems
Single-channel 200 μL pipette Eppendorf 022443305

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).
  2. Lloyd, T. E. &, Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
  3. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).
  4. Le Bourg, E., Buecher, C. Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster. Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).
  5. Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster. Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).
  6. Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).
  7. Leal, S. M., Neckameyer, W. S. Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).
  8. Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  9. Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons. Learn Mem. 11, 277-287 (2004).
  10. Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 100, 597-614 (1982).
  11. Hall, J. C. Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system. J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).

Tags

Neuroscience выпуск 49 Geotaxis фототаксис поведение Tau
Опорно-двигательного опробование, обучение и память Дефицит<em> Drosophila</em> Модели нейродегенерации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K.,More

Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (49), e2504, doi:10.3791/2504 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter