Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Testmetoder motoriskt, inlärning och minne Brister i Drosophila Modeller för neurodegeneration

Published: March 11, 2011 doi: 10.3791/2504

Summary

Beteende-analyser för att mäta rörelseorganens funktioner, lärande och förmågor minne i

Abstract

Framsteg inom genetiska metoder har gjort det möjligt att studera gener som är involverade i mänskliga neurodegenerativa sjukdomar med hjälp av Drosophila som modellsystem 1. De flesta av dessa sjukdomar, bland annat Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdom kännetecknas av åldersberoende försämring av inlärnings-och minnesfunktioner och rörelse samordning 2. Här använder vi beteende-analyser, även de negativa geotaxis analysen 3 och aversiva phototaxic förtrycket analys (APS-analys) 4,5, för att visa att några av de beteenden egenskaper som förknippas med mänskliga neurodegeneration kan upprepar vi flugor. I den negativa geotaxis analysen flyger den naturliga tendens att röra sig mot gravitationen när upprörd utnyttjas för att studera gener eller villkor som kan hindra rörelseapparaten kapacitet. I APS-analysen, är inlärning och minne funktioner testas i en positiv-phototactic flyger utbildade för att associera ljus med aversiva bitter smak och därmed undvika detta annars naturlig tendens att gå mot ljuset. Testa dessa utbildade flugor 6 timmar efter träningen används för att bedöma minnesfunktioner. Med hjälp av dessa analyser kan bidraget från en genetiska eller miljömässiga faktorer mot att utveckla neurodegeneration lätt studeras i flugor.

Protocol

1. Inledning

I den här videon kommer vi att visa två beteendemässiga analyser med hjälp av Drosophila att visa mätning av förflyttning och inlärning och minne funktioner som äventyras på neurodegenerativa sjukdomar. Först kommer vi att visa hur rörelseapparaten beteende kan mätas med de negativa geotaxis analysen. För det andra kommer vi att utvärdera inlärning och minne förmågor med hjälp av positiv-phototactic flugor som är utbildade för att associera ljus med en aversiva bitter smak och sedan testade 6 timmar senare för att bedöma minnesfunktioner. Slutligen kommer vi att diskutera innebörden och begränsningar av dessa beteenden analyser.

2. Utrustning och reagenser

  1. Fly arbete
    • Stereo omfattning (Zeiss)
    • Små penslar för att skjuta flugor
    • Drosophila koldioxid (CO 2) anestesi apparater (Geneseesci, Inc)
  2. Negativa Geotaxis analys
    • 28,5 x 95 mm polystyren Injektionsflaska (Capitol Flaska, Inc.)
    • Mini-Alarm Timer / Stoppur (VWR International)
    • Sharpie pennor
    • Tejp
  3. Aversiva Phototaxis Suppression analys
    • Kinin Hydrochloride (Sigma Aldrich, CAS-nummer: 6119-47-7)
    • Destillerat vatten
    • Digital mätskala för exakt utspädning i vikt
    • Snabburkoppling Anslutningar, högdensitetspolyeten (Nalgene VWR Katalognr 62.868-021)
    • 15 ml centrifugrör (VWR International), skär i 2 ml-strecket från sluten för att passa med Quick Koppla Connector adapter för ljuskälla
    • En-kanals 200 mikroliter pipetter att ladda kinin lösningen på filterpapper foder kammaren
    • T-Maze (Enkel Behavioral Systems, Figur 1)
    • Aluminiumfolie
    • Ljuskälla (Zeiss)
    • En lampa med rött ljus.
    • Filterpapper
    • Mini-Alarm Timer / Stoppur (VWR International)

3. Förbereda Flugor

  • Flugor hålls på standard majsmjöl-agar-melass-jäst medium vid 25 ° C på en 12 tim ljus / mörker-cykel.
  • Virgin flugor är isolerade under kolsyrenarkos på dagen för eclosion. För åldrande studier, flugor upprätthålls i grupper om tjugo per flaska och överförs till en ny flaska varje 3 dagar. Det är viktigt att använda syskon flugor från samma föräldrars korset för åldrande studier, för att minimera skillnaderna härrör från genetisk bakgrund.
  • För både analyser, är flugor könsbestämmas och upprätthålls i grupper om tio flugor per injektionsflaska. Könsskillnaden på beteende är betydande och det är tillrådligt att inte blanda manliga och kvinnliga flugor i en studie som data kan vara svåra att tolka och återge 6.
  • För negativa geotaxis analys, är flugor sorteras in i grupper om tio per flaska och testade en timme efter anestesi. Det är viktigt för flugor att återhämta sig helt från anestesi eftersom det kan ha en effekt på rörelseapparaten aktiviteter.
  • För APS-analysen, är flugor i varje grupp placeras i en tom polystyren flaskan med vatten fuktad filterpapper i sex timmar innan analysen utförs. Detta säkerställer att flugorna är svalt innan analysen och kommer att vara mer lyhörda för aversiva smak. Strax innan analysen utförs, varje flyga från en grupp av tio placerade i en tom 15 ml centrifugrör som sedan är maximerad löst, för att undvika att fly.

4. Negativa Geotaxis analys

  • Geotaxis mäts i allmänhet för tio till tjugo grupper om tio individer av samma genotyp eller behandling (100-200 flugor summa för varje genotyp / behandling) 7. Sortera grupper av tio kvinnliga eller manliga flugor på en CO 2-narkos apparater och placera varje grupp i en separat injektionsflaska. Låt minst en timme för flugorna att återhämta sig från anestesi.
  • Förbered klättring apparater för varje grupp, så att två tomma polystyren flaskor vertikalt sällskap av tejp vända mot varandra. Det är viktigt att se till att öppningarna i injektionsflaskorna är perfekt anpassade till varandra för att ge en ännu klättring yta för flugorna.
  • För de lägre flaskan, mät en vertikal marginal av 8 cm över bottenytan och markera varje flaska genom att rita en cirkel runt hela omkretsen av flaskan.
  • Överför en grupp på tio flugor i det nedre flaskan försiktigt som förhindrar utsläpp av någon fluga. Omedelbart täcka den undre flaskan med den övre flaskan och tejpa fast nära kontakt med öppningar. Låt flyger vänja sig vid den nya inställningen i 1 minut innan de utför analysen.
  • Knacka försiktigt på flyger ner till botten av flaskan och mäta hur många flugor som kan klättra över den 8-cm-markeringen med 10 sekunder efter att kranen.
  • Upprepa detta test för samma grupp tio gånger, så i 1 minut vila mellan varje försök.
  • Registrera antalet flugor per grupp som passerade den 8-cm varumärke som enprocent av totala flugor.

5. Aversiva Phototaxis Suppression-analys (APS-analys)

Ursprungligen anpassas från Le Bourg och Buecher (2002) 4, utnyttjar denna analys den positiva phototactic beteende flugor att träna dem att associera ljus med aversiva stimuli (i detta fall, bitter smak av kinin). Efter en utbildning / konditionering fasen kommer vildtyp flugor kan koppla den upplysta området med aversiva smak och undvika det. Flugor med nedsatt inlärningsförmåga inte kommer att göra denna förening. Dessutom kan APS-analysen även användas för att mäta korttidsminne funktion av flugor 5 genom att utsätta redan utbildade flyger till samma test 6 timmar efter konditionering för att testa deras förmåga att komma ihåg de lärda uppgiften.

  1. Förbereda Kinin Solution
    • Lös kinin hydroklorid i destillerat vatten till en 0,1 M stamlösning (1.98g i 50mL destillerat vatten). Beståndet lösning kan förvaras vid -20 ° C i upp till ett år i små portioner
    • Bered en brukslösning av 1 mikroM genom att späda stamlösning i destillerat vatten.
  2. Förbereda T-Maze
    • T-labyrinten består av den mellersta kolumnen med lucka och två oberoende kamrar, ett "mörkt" kammare och en "upplyst" kammare (Figur 1).
    • Avdelningen förberedelser: ta två 15ml plast centrifugrör och skär i 2 ml-markeringen från botten sluten med en manuell såg. Montera kontakten adapter i båda ändarna, och försegla samband med parafilm. Adaptern i slutet av röret fungerar som ingång kortplats för svanhalsen ljuskällan. Anslut en slang med ljuskälla och detta rör kommer att vara "upplyst" kammare. Linda andra röret med aluminiumfolie för att fungera som den "mörka" kammare.
    • Lägg 180uL av antingen destillerat vatten eller kinin lösning på filtrerpapper och plats i ljuset kammaren.
    • Montera T-labyrinten genom att skruva den upplysta och mörka kammare på varje sida av den mellersta kolumnen, med lucka i mitten stängd (figur 1).
    • Sätt ljuskällan i den upplysta kammaren.
  3. Utbildning flyger för att undertrycka phototaxis med aversiva stimuli
    • Skruva den mörka kammaren från T-labyrinten och överföra en enda fluga i denna kammare och omedelbart skruva mörka tuben tillbaka till labyrinten.
    • Stänga av belysningen i rummet och slå på den röda lampan.
    • Låt flugan att acklimatisera i mörker kammare i 30 sekunder och vrid långsamt på ljuskällan lyser den upplysta kammaren. Öppna långsamt lucka som skiljer de två kamrarna.
    • Om flyga promenader till upplysta kammaren inom 10 sekunder, anses det positivt phototactic och är redo att vara utbildad för analysen. Misslyckande i phototaxis indikerar problem i det visuella systemet och flyger med negativ phototaxis måste undantas från analysen.
    • För Aversiva Phototaxis bekämpande (APS) utbildning, peka på fluga som visat positiva phototaxis tillbaka till den mörka kammare, stäng luckan och stänger av ljuset. Tillåt 30 sekunder av acklimatisera sig. Under denna tid satte filterpapper med kinin lösning i den upplysta kammaren. Öppna långsamt luckan och slå på ljuset. Låt flugan gå in i kinin upplysta belagda kammare. Efter en minut, peka på flyga tillbaka till den mörka kammaren och upprepa detta 9 gånger. (Normalt flyger vildtyp undvika upplysta kammaren efter 3 till 5 Utbildning försök.)
    • Direkt efter utbildningen kommer fem prov, genomföras. I varje prov studie att 10 sekunder efter ljuset slås på för den utbildade flugan att gå till den upplysta kammaren. Underlåtenhet att gå till den upplysta flaskan kommer att registreras som "Pass", vilket motsvarar "uppgift lärt sig genom förstärkning". Den Genomströmningen över fem försök i rad spelas in och visas nedan i figur 2 som PC0 (0 tim efter konditionering).
  4. Bedömning av korttidsminne Funktion i Flugor
    • Efter utbildning och inledande PC0 inspelningar är varje flyga läggs tillbaka i sin ursprungliga föda flaskan och höll undan i sex timmar.
    • Sex timmar efter träning, låta varje flyga till 5 försök igen på samma sätt som tidigare och registrera antalet gånger flyga undviker (godkänd) eller går in i (misslyckas) den upplysta flaskan. Detta genomströmningen redovisas som PC6 (6 timmar efter konditionering), vilket är en indikator på korttidsminne.

6. Tolkning av data och statistisk analys

  1. Negativa Geotaxis analys
    • Rådata som genereras av denna analys anger antalet flugor korsa 8-cm märke i 10 sekunder i varje grupp. Omvandla denna till andel och beräkna den genomsnittliga genomströmningen för varje grupp över 10 sessioner.
    • Data grafiskt som ett genomsnitt passerar per grupp (genotyp, behandling etc.) med standardfel medelvärdet (SEM).
    • Skillnader mellan grupperkan då bestämmas till statistiskt signifikant eller inte med hjälp av en student t-test eller ANOVA.
  2. Aversiva Phototaxis Suppression analys
    • Den rådata från denna analys är representerade som antalet gånger varje flyga undviker tända kammaren i fem på varandra följande försök. Passet beräknas som andelen lyckade undvika studier över den totala prövningar. Beräkna den genomsnittliga genomströmningen på detta sätt i minst 15 flugor per grupp.
    • Data grafiskt representeras som genomsnittet genomströmningen PC0 (omedelbart efter konditionering, "lärande" indikatorn) eller den genomsnittliga genomströmningen PC6 (6 timmar efter konditionering, "minne" indikatorn) med respektive SEM.
    • Inlärning och minne index jämförs mellan grupper med både vildtyp och "genetiskt manipulerade-godartad" gruppen (som GFP överuttryck flugor) på lämpligt sätt.

7. Representativa resultat

I denna video experiment, vi bedömer inlärning och minne och motoriken i flugor överuttryckande mänskliga Tau i det centrala nervsystemet och jämföra deras prestationer till de av flugor överuttrycker GFP. Neuronala överuttryck av humant Tau i Drosophila har visat sig orsaka allvarliga vakuolisering i hjärnan 8 och leda till betydande brister i inlärning och minnesfunktioner 9. Som framgår av Figur 2A, flyger 10 dagar gammal manlig eller kvinnlig överuttryck mänskliga Tau har betydande rörelseaktivitet underskott jämfört med åldersmatchade GFP överuttrycker flugor. Dessutom är dessa flugor inte förknippar ljuset med bitter smak som framgår av PC0 genomströmningen jämfört med kontrollgruppen, liksom att glömma denna förening vilket framgår av en nedgång i PC6 genomströmningen (Figur 2B). Detta experiment bekräftar vidare att Drosophila modeller kan användas för att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar och rekapitulera några av de beteendemässiga fenotyper observerats hos människor och däggdjur.

Figur 1
Figur 1. T-Maze Setup för Aversiva Phototaxis bekämpande analys. A. Det övergripande experimentuppställning för APSA experimentera med ljuskällan är ansluten till "upplysta" Falcon rör, fodrad med filterpapper och "mörka" röret till vänster (täckt i folie), åtskilda av en fallucka. B. Under träning och testfasen, är flugan i mörkret kammaren och luckan öppnas efter ljuset slås på i den upplysta kammaren.

Figur 2
Figur 2. Representativa resultat från den negativa geotaxis och APS experiment med flugor överuttryck av GFP eller Tau med en pan-neuronal drivrutin. A. I den negativa geotaxis analys, 10-dagars gammal hane (blå stapel) eller kvinna (röd kolumn) flyger överuttryck av GFP visade högre klättrar aktivitet än Tau-överuttryck av flugor. B. 20-dagars gammal hona flyger överuttryck av GFP visade bättre lärande (PC0) och minne (PC6) funktioner än Tau överuttrycker flugor.

Discussion

Både negativa geotaxis och analyser APS är robusta beteendemässiga testmetoder för att mäta förändringar i rörelseapparaten eller lärande och kapacitet minne härrör från genetiska eller miljömässiga manipulation. Det finns dock vissa nackdelar med dessa analyser som väntar ytterligare optimering.

I negativa geotaxis analys kan mutationer i vissa gener gör grava motoriska dysfunktioner i flugor. I sådana fall kan flugorna klättra knappast väggarna som svar på gravitation på agitation. Andra beteenden analyser som direkt mäter rörelse kan vara mer lämpligt. Dessa analyser inkluderar rätande reflex beteende som mäter förlamning och beslag 10, och optomotor beteende 11 som registrerar förlust av rörelse samordning.

I APS-analysen, kan det första hindret finnas flugor slumpmässigt stanna vid ingången till upplysta kammare utan framåt. Detta blir mer av ett problem om åldrande är en av de studerade förhållanden, eftersom äldre flugor är mindre aktiva i allmänhet och tenderar att stanna och vila i långa perioder. I detta fall försöksledaren har att erbjuda mekaniska stimuli för att främja rörelse, vilket inte alltid är effektivt. För det andra kan man hävda att misslyckandet med att gå till den upplysta kammaren resultatet från en förlust av positiva phototaxis. Detta är sällan fallet, eftersom tidigare arbete har visat att flugor vända tillbaka till ljuset lyhördhet när negativa förstärka tas bort 4. Tredje, kan tidsåtgången för kontakten med aversiva stimulus varierar från rättegång till rättegång. Denna variation kan oftast minskas genom omger den inre väggen i kammaren med indränkt filterpapper för att hindra flugor från att undvika kinin. Dessutom kan försöksledaren säkerställa att varje flyga tillbringar tillräckligt med tid i kontakt med filterpapper genom att öka mängden tid som tillbringas i kammaren från annat anges 1 minut.

Sammanfattningsvis negativ geotaxis och analyser APS är snabba och enkla sätt att bedöma beteendestörningar och kvantitativt visar motionsbesvär och inlärning och förmågor minne i Drosophila. Dessa analyser är särskilt användbara i modellering mänskliga neurodegenerativa tillstånd i Drosophila.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Charles Luetje för att tillhandahålla T-labyrinten och beteendet rummet. Detta arbete stöds av American Heart Association (till YA), det nationella institutet för neurologisk sjukdom och stroke Grant R01NS64269 (till RGZ) och Pew Charitable Trust (till RGZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene Vial Capitol Vial, Inc. 28Fly 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb.
Dissecting Stereoscope Carl Zeiss, Inc. 000000-1432-979 2 branches goose-neck light guide (12V/30W)
Quinine Hydrochloride Sigma-Aldrich 6119-47-7 Dissolve in distilled water.
Quick Disconnect Connectors Nalge Nunc international 62868-021 High-Density Polyethylene
T-Maze Simple Behavioral Systems
Single-channel 200 μL pipette Eppendorf 022443305

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).
  2. Lloyd, T. E. &, Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
  3. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).
  4. Le Bourg, E., Buecher, C. Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster. Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).
  5. Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster. Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).
  6. Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).
  7. Leal, S. M., Neckameyer, W. S. Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).
  8. Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  9. Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons. Learn Mem. 11, 277-287 (2004).
  10. Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 100, 597-614 (1982).
  11. Hall, J. C. Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system. J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).

Tags

Neurovetenskap Geotaxis phototaxis beteende Tau
Testmetoder motoriskt, inlärning och minne Brister i<em> Drosophila</em> Modeller för neurodegeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K.,More

Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (49), e2504, doi:10.3791/2504 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter