Summary
יישום ישיר מדידות של כוחות על הנוירונים בטווח 2000-1000 microdyne מושגות עם דיוק גבוהה באמצעות מחטים זכוכית מכויל. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לשלוט ולמדוד כמה היבטים של התפתחות axonal, לרבות ייזום axonal, מתח axonal, מהירות של התארכות axonal ו וקטורים כוח.
Abstract
מניפולציות תאים הרחבה של אקסונים עצבי יכול להתבצע עם זכוכית מכויל מיקרו סיבי מסוגל למדוד וליישם כוחות 1,2 μdyne 1-10 טווח. מדידות חיל מתקבלים באמצעות תצפית של Hookean כיפוף של מחטים זכוכית, אשר מכויל על ידי שיטה ישירה אמפירי 3. דרישות ציוד ונהלים בודה, כיול, טיפול, ושימוש במחטים על תאים מתוארים באופן מלא. כוח המשטרים סוגי תאים המשמשים בעבר השונים אשר טכניקות אלה יושמו להדגים את הגמישות של המתודולוגיה ומקבלים כדוגמאות לחקירה בעתיד 4-6. היתרונות הטכניים של ראיה 'מתמדת של כוחות המיוצר על ידי המניפולציות ואת היכולת להתערב באופן ישיר במגוון רחב של אירועים הסלולר. אלה כוללים גירוי ישיר ורגולציה של צמיחה axonal לבין הפתיחה 7, כמו גם ניתוק מדידות מכניות על כל סוג של תאים בתרבית 8.
Protocol
1. ביצוע מחטים זכוכית.
- חולץ מתכווננת מיקרו מחט משמש לפברק מחטים עם קצה קוני על 4 מ"מ באורך סגורות קורות מוצק. בניגוד קצה גמיש ארוך, זה קצר באורך 4 מ"מ גבולות תנודות של קצה המחט במהלך הניסויים. באותו האזור הפרוקסימלי של סיבים 4 מ"מ, המחט נרות במהירות בקוטר של צינורות הזכוכית כדי 15 מיקרומטר תוך 1 מ"מ, ואילו הדיסטלי ביותר 1 מ"מ של סיבים הוא 2.5 מיקרומטר קוטר. אנחנו משתמשים בצינור נימי R-6 זכוכית, OD 0.9 מ"מ, מזהה 0.6 8 מ"מ "אורך BB-CH חולץ. אם החוקר מעוניין מדידת טווחי כוח אחרים, מחטים עם מאפייני האביב שונים (כלומר אורך שונה או ) עובי צריך להיות משך. כל צינור נימי מושך לארבע 2 "מחטים. מחטים מאוחסנים מכוסה 160 מ"מ צלחות פטרי עם "נחשים" שתי פלסטלינה שלתוכו מחטים נלחצים בקלות.
- המחטים זכוכית, וכן מחט חוט כדי לתאר, הם בעצם קורות לשמש מעיינות כיפוף של קשיחות מתאים מדידות הרצוי של כוח. שים לב כי כוח כיפוף של קשקשים הקורה כמו הקובייה אורכו, ללא קשר להרכב. כך, כל הצעדים המתוארים להלן כיול, קרן מחט / של קשיחות מספיק נוקשה יכול להתבצע על ידי כמות קטנה של התקצרות (למשל קיצור מייצרת 10% עלייה של 28% קשיחות, כלומר 0.9 3).
2. ביצוע כיול מחט חוט
- בצע כיול חוט ומחט ידי הוספת 0.001 "חוט Chromel דרך החלק הפנימי של מחט זכוכית (עשה בסעיף 1.1) עם קצהו ניתק. משוך את החוט מתוך קצה לאורך של 26 מ"מ ודבק אותו במקום עם דבק סופר. בנד דיסטלי 1 מ"מ של חוט לתוך וו.
- בצע מיקרו משקולות מ 1 מטר של חוט 0.003 Constantan ". כדי למדוד את חוט, סרט זה מקל מטר לסייע מקבל את זה ישר ככל האפשר. לשקול מ '1 של תיל, מדויק לחתוך אותו לחתיכות 1 ס"מ, לכופף כמה חתיכות לתוך Vs
- כיול המחטים חוט דורשת לנתח מיקרוסקופ עם reticle מדידה micromanipulator. המיקרוסקופ מוטה 90 מעלות על צידו שימוש לעמוד בום אוניברסלי, כזה הסטייה כלפי מטה של המחט חוט ניתן לצפות. הר מחט חוט סעיף 2.1 לתוך המחזק כלי על micromanipulator כזה באזור מכור הוא בניצב לציר האופטי של המיקרוסקופ. קו את הקרס של מחט את החוט עם סימן reticle. תלו את 1 ס"מ מיקרו משקל על הוו ולהקליט את הסטייה. קבוע כיפוף (μdynes / מיקרומטר) של התיל התייחסות מחושב כיחס בין משקל מיקרו (הערה: 1 מ"ג = 0.98 dynes) מחולק סטיה הנצפה (מיקרומטר). כדי להכין את המחט חוט לשלב הבא, לנתק את הקרס בנקודה לשקול את באזמל. הנוכחות של הקרס הוא משקל נוסף מכופף את החוט במידה קטנה. לכן תופעות העמדה הראשונית של התיל ב reticle לפני משקל הוא הוסיף. המדידה של קבוע הקפיץ חוט נגזר סטיה של חוט כאשר המשקל הוא הוסיף נקודה העיקול (טיפ לעתיד של התיל). כאשר וו נחתך זה לא משנה באביב קבוע של התיל.
3. כיול המחטים זכוכית ביניים
- כיול של מחטים זכוכית ביניים מחייב שימוש במיקרוסקופ הפוכה עם reticle עינית. בצד אחד של הבמה מיקרוסקופ הוא micromanipulator מכני נהגו לקיים את המחט חוט סעיף 2 במרכז השדה אופטי. בצד השני הוא micromanipulator שלושה צירי הידראולי (ראה טבלה ציוד) משמש כדי להזיז את המחט זכוכית ביניים מכוילים. שימוש micromanipulators, להביא את שני מחטים ביחד במרכז השדה אופטי זווית ~ 45 מעלות לתוך 160 מ"מ x 30 מ"מ צלחת פטרי מים בשדה 10x.
- סדרה של מחטים משך עם הגדרות שונות על חולץ פיפטה נוצרות הראשון הערכה. המטרה היא להפוך את מחט זכוכית ביניים עם קפיץ כיפוף קבוע של 20-30 μdynes / מיקרומטר. קביעת קשיחות נעשית על ידי מדידת היחס בין הסטייה של מחט הביניים לעומת הסטייה של מחט את החוט. לדוגמה, עם מחטים תיל זכוכית נוגע ללב, המחט זכוכית מועבר להסיט את המחט תיל מרחק של 5 סימנים על reticle כפי שהוא נראה דרך החלקים העין. הזזת מחט זכוכית לצדדים מתנתקת המחטים. חוט ומחט ואז חוזר למצב המקורי החל, אבל מחט זכוכית עכשיו יהיה בעמדה חדשה. עומס על מחט זכוכית מחושב אז מעמדת חדש אפס כוחה מינוס בעמדה של מחטים הן עומס כוח שווה (מחטים הן עסקו). בדוגמה זו, אם הן מחטים מוסח לציון 5 (מאפס על reticle), חוט המחט תחזור אפס ואילו GLAss מחט תזנק ל 25, ואם כן, זה כפוף 20 סימני בכוח באותו כופף את המחט חוט 5 סימנים. לכן, היחס של כיפוף בין שתי מחטים נותן הכיול של המחט זכוכית וזה ¼ נוקשה כמו מחט את החוט. בגלל חישובים באביב קבוע בסעיף 3.4 להשתמש יחס המרחקים הם עצמאיים או הגדלה של גודל החלוקה reticle. השיקול היחיד הוא כי הגבלת deflections הם קטנים מספיק כדי להיות בטווח אלסטי ליניארי של המחטים.
- האם סדרת deflections על עמדות 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 סימנים על reticle. אם deflections כל שחרור מוקדם מדי לחזור על אותן. בין deflections לשמור את המחט חוט מיושרים אפס. עבור כל אחד deflections אלה, שים לב לכמות מוסח ואת המיקום הסופי אפס עומס של המחט זכוכית לאחר שחרורו. זה יוצר 10 זוגות של נקודות נתונים. רצפים אחרים עשויים לשמש, אך סדרה זו נועדה לתת סימנים מוקדמים של ליניאריות עקביות פנימית, hysteresis (תוצאות deflections 5 + 10 = 15; 3 7 = 10; 5,10,15 deflections לאחר שחרורו צריך להיות כ אותו בתחילת וסיום).
- רגרסיה לינארית של deflections רשמה בסעיף 3.3 נותן כימות מדויק יותר של קבוע כיפוף של מחט זכוכית ביניים מאשר יחס סטיה אחת. הוא גם מספק הערכה של הליניאריות של המחט ואיכות כיול המצוין על ידי ערך r גבוה וקרבה של יירוט של קו הרגרסיה לאפס. כדי להכין את 10 זוגות נתונים בסעיף 3.3 עבור רגרסיה, מספר השני של זוגות שנרשמו, את המיקום הסופי אפס עומס של המחט זכוכית לאחר שחרורו, חייבת להיות סטיה ראשונית המקביל מפחיתים את זה, המהווה את המספר הראשון של צמד. לאחר פעולה זו מבוצעת סדרה של זוגות המספר החדש מורכב סטיה הראשוני ההבדל המקביל מחושב. הוסף 5 זוגות השליטה 0,0 אלה 10 זוגות נתונים ניסיוניים לעגן את רגרסיה לינארית לעבר כוח אפס אפס סטיה. זה אינו נדרש לחלוטין, אך מוסיף תואר נוסף של דיוק. עיגון ב 0,0 מבוסס על העיקרון כי המחט לא כפופה כאשר כוח לא מוחל. עם אלה 15 זוגות נתונים לחשב רגרסיה ליניארית. באביב כיפוף קבוע של המחט זכוכית מכוילים היא מחט חוט ידוע קבוע כיפוף חלקי השיפוע של קו רגרסיה זה.
4. כיול את המחט זכוכית עובד משמש כדי לתפעל נוירונים
- מחטים זכוכית עמידה מספיק, 2-15 μdynes / מיקרומטר, כדי לשמש בניסוי על נוירונים מכוילים נגד המחט זכוכית ביניים באופן מקביל, כמתואר בסעיף 3. כלומר, מחטים מועמד העבודה להסיט מחט ביניים של קשיחות ידוע להציב בעמדה של מחט את החוט בסעיף 3. מחטים זכוכית של פחות מ -2 μdynes / מיקרומטר עלול להתקצר מעט להביא אותם לתחום קשיחות המתאים.
5. מחטים הן pretreated עם גורמים מצורף
- מחטים שיתייחסו נלחצים לתוך הצד של גוש חימר שנערך מהדק קבוצה מעל כוס 10 מ"ל של תמיסת מצורף גורם, כך רק קצה המחט הוא שקוע בפתרון. טבילת הפיר צינור נימי אינה רצויה משום שהיא מגבירה את הצטברות של ציפוי על קצה לאורך זמן, אשר משנה את נוקשות מפחית יעילות של המחט של הקובץ המצורף. מחט מכויל ניתן להשתמש רק כ 4 פעמים וניתן recalibrated לדיוק. מחטים הם טבל ברצף בפתרון polylysine 0.1% למשך 30 דקות ולאחר מכן concanavalin (1 מ"ג / מ"ל PBS) במשך 30 דקות. Polylysine ניתן להשתמש שוב ושוב במשך מספר שבועות והוא מאוחסן ב -20 ° C. בצע שבועי conA חנות טריים ב 4 ° C. עבור סוגי תאים אחרים מולקולות בפני השטח שלהם על ידי המחט עשוי לכוון את מהלך החקירה.
6. ציוד להגדיר
- תחנת עבודה גרירה מוגדר על שולחן בידוד רעידות. זה מורכב מיקרוסקופ הפוכה מצויד בבר יחד שמאל מעל הבמה מניפולטור הידראולי קשור אליו, מחזיק הארכה מותאם אישית counterbalanced שלנו, תוך שבעל כלי כפול מוכנס. מקם את micromanipulator הידראולי לאורך הבר, על ידי הצבת מחט המחזק שלו לתוך נתיב האור של המיקרוסקופ, בעוד שולט של מניפולטור מרוכזים בטווחים שלהם. באותו זמן את המחט מטופל עם גורמים המצורף, הפעל Ringcubator או מיקרוסקופ אחר שלב מערכת חימום, ולכן בשלב זה בשיווי משקל תרמי בתחילת הניסויים.
7. יישור מחטים
- המטרה היא לקבל את שתי מחטים (התייחסות מחט עבודה) בשדה הראיה של מיקרוסקופ מסודרים כךהעצות שלהם על 50 מיקרומטר בנפרד, בנפרד, תוך התייחסות לעיל המנה תרבות, ולכן קצת מחוץ לפוקוס, כאשר מחט גרירה היא להתמקד המנה. שתי מחטים מחזיקי מחט שלהם מורכבים לתוך המחזק לייקה פעמיים כלי, אשר היא עצמה micromanipulator קטן. שימוש המיקרומניפולציה של בעל הכלי פעמיים, שני טיפים מובאים לתוך יישור מקבילים. הכנס את המחט לתוך הפניה מחזיק מחט רק מרחק קצר, מספיק כדי לאפשר את הקולר הידוק לאחוז אותו למקום הזה הרכבה בצד הימני של בעל כלי כפול. הכנס התייחסו עובד half מחט אורכו לתוך מחזיק מחט ולמקם אותו בצד שמאל של בעל כלי כפול. כאשר שני טיפים מחט מובאים עמדת קדימה אותו בשורה, באורכים שונים של מחטים מחזיקי שלהם להתנודד צווארונים כדי שלא לעכב מקבל עצות קרובים מאוד זה לזה. סעיפים 7.2 עד 7.4 נעשות ללא הגדלה. סעיפים 7.5-7.8 נעשים תחת השגחה מיקרוסקופיים.
- טרום להגדיר את micromanipulator הידראולי כך שליטה אנכית היא כל הדרך למעלה. קביעת פקדים אחרים למרכז הטווח שלהם, וגם קדימה / אחורה הבורג של בעל הכלי.
- הביאו את שתי עצות מחטים יחד באמצעות בורג בצד אל הצד התאמת בצד ימין של בעל הכלי. ואז לדחוף את מחזיקי מחט עצמם קדימה או אחורה מחזיק בכלי כפול הדרוש כדי להביא את הטיפים מחט לתפקיד אותו קדימה. בדוק את צמד מהצד ולהשתמש בצד ימין למעלה / למטה בורג להביא את הטיפים אל אותו מישור. סובב מחזיקי מחט בעל הכלי כדי לסגור את הפער אם זוויות מחט בעל מחט שלה.
- החזר את תופסן כלי והמקום טיפים לתוך נתיב האור מעל פני השטח של התקשורת, לדוג אותם למטה תלולה. הדקו את הבורג בכדור משותף בבסיס לפני שתעביר את היד שלך משם.
- מצא טיפים מחט שלך בשדה הראיה של מיקרוסקופ לפני שאתה מביא אותם רחוק מדי למטה לשבור אותם או רע להם עם פסולת בתחתית המנה תרבות. בכל צלחת 60 מ"מ, 15 מ"ל של מדיום מספק עומק מספיק מרווח ביטחון מעל לתחתית צלחת. האם אימון ראשוני עם מחט uncalibrated לקבל את התחושה של צעד זה. בגין על ידי התמקדות לעיל מעלה את התאים על תחתית הצלחת במטרה a10x. האם זה באזור של המנה במרחק אור תאים ניסיוניים רגיש או למופת. מנמיכים את המחטים לתוך התקשורת. העבר את צד מחטים לצד מחפש צל שלהם. אם אתה לא רואה אותם, להוריד אותם קצת ולהעביר אותם קדימה בצלחת, לחזור על הצד לעבור צד. מצא קצה, על ידי הזזת בחזרה (או קדימה) ומטה.
- סובבו את בורג מצד אל צד כדי לראות איזה מחט שמצאת. אם זה נע עם הבורג אתה מסתכל על המחט התייחסות, אם זה לא זה את המחט מכויל. עבור המחט מכויל, השתמש צד בורג בצד לדחוף את המחט התייחסות אליה. הזז אותו קדימה ואחורה מחפש צל של התייחסות. אם זה את המחט התייחסות שמצאת, בורג זה שמאלה תוך העתקת הידראולי ימינה לחפש מחט מכויל.
- כאשר הן מחטים ממוקמים להשתמש בפקדים קנס של בעל כלי כפול לקו אותם. הזווית החדה של מחטים מגיע מעבר לקצה של המנה גורם למעלה / למטה שליטה יש גם קדימה, התארכות רכיב ההתאמה כלפי מעלה קיצור עם מטה. הצד השמאלי, קדימה / אחורה לשלוט בורג יש את ההיפך, דוחף את קצה קדימה גם לתוך התבשיל, מושך אותו חזרה תיסוג את המחט תוך העלאת עמדת קצה. לכן, העלאת התייחסות דוחפים קדימה את המחט מכויל יתארך גם כדי להפוך אותם אפילו בקצותיהן גם בעת הבאתם היחסים אופטימלי גבהים מעל המנה. אם המחט התייחסות חורגת הרבה מעבר המחט עובד אתה יכול לדפוק / לדחוף את המחט עובד למטה וקדימה בזמן מניף את הפניה למטה וקיצור עד שני הם אפילו את המחט עבודה הוא נמוך יותר. לפעמים את מגוון ברגים לא יביא את המחטים יחד, ולכן ייתכן שיהיה צורך להחליק בעדינות המחזיקים עצמם, לוודא את הבורג בכדור משותף להדק היטב להשתמש באצבעות שלך תקוע על קצה של בעל כלי להפעיל כוח כדי להחליק את פירים. אתה יכול גם לסובב את מחזיקי מחט בעל כלי כמו קודם, בעוד למעלה בתקשורת התבוננות למעשה, לראות אם הם מתקרבים זה לזה.
- הקלט את התמונה של בתנוחה זו מותאם הסופי, ההפרדה של מחטים ללא להחיל כוח הוא המרחק התייחסות אפס. הרם את המחטים מעל למישור הדגימה "פארק" אותם בקצה שדה הראייה.
- רסיסים על מחט ניתן להסיר באמצעות העלאת אותו דרך המניסקוס. ראשית להזיז את המחט התייחסות מן המחט אחרים כדי למנוע את שתי עצות ללכוד את אחד את השני. עובר מרובים עשוי להיות נחוץ. </ Ol>
- עד כה, המחטים נצפו ישירות דרך המיקרוסקופ. עם תחילת ההתקשרות התא, תצפיות ייעשה הן באמצעות המיקרוסקופ לבין על מסך וידאו. ההיבט ימינה / שמאלה של שניהם זהה, אבל הכיוון למעלה / למטה של התמונה על מסך הווידיאו אינו זהה (הכבידה) מעלה ומטה על המיקרוסקופ. כדי להבהיר את ההבדלים בין הכיוונים מעלה / מטה כפי שנצפה ישירות דרך המיקרוסקופ לבין כפי שנצפו על מסך וידאו, שהאחרון יהיה המכונה 'מעלה' ו 'למטה', כלומר במרכאות
- תהליך הגרירה נעשית על ידי שינוי המיקום של שתי מחטים משמאל לימין ("אופקי") על מסך וידאו. לכן, הבחירה של האקסון הניסוי נעשה בחלקו על האקסון המשתרעים לאותו כיוון "אופקי". האקסון יכול לסטות 'מטה' מ 'אופקי' על ידי ככל 15 מעלות, כמו זו יפוצו על ידי לתמרן את "לדחוף את 'סעיף 8.5. בנוסף, האקסון נבחר מניפולציה צריך להיות אורך גוף התא או יותר, עם חרוט צמיחה פעילים. אקסונים הארכת בצד ימין של גוף התא הם העדיפו בשל להגדיר של בעל כלי כפול עם המחט עבודה רכוב בצד שמאל של המחט התייחסות, כך מתח מיושם במהלך גרירה מרחיבה את הפער בין שתי מחטים.
- האקסון הממשלה המשתרע בצד שמאל של גוף התא יכול להיגרר ללא לצידוד בעל פעמיים כלי שהוקם על ידי הרחבת הפער בין המחטים והעלאת מחט התייחסות קצת. זה מאפשר מרחב מחט גרירה יותר לכופף לכיוון הפניה ולעבור מתחתיו במידת הצורך. גרירה לאחר מכן להתקדם שמאלה את המחט גרירה יוטו לכיוון המחט התייחסות כמו עליות מתח. כאשר מנתחים את הנתונים לשינוי זה במערכת היחסים של מתח למרחק הפניה היא נכנסה האלקטרוני על ידי הפחתת מדידה ההפרדה מחט ממרחק אפס התייחסות במקום מרחק אפס מן המדידה.
- הזז את המחטים קרוב חרוט הצמיחה של האקסון, שיא המרחק אפס שוב, להעלות את המחטים, האוויר למעלה בטבלה בידוד רעידות.
- כל שעליך לעשות הוא לשים את המחט עבודה מול חרוט צמיחה לקידום עשויה לייצר מצורף ספונטנית כמו ההתקדמות חרוט צמיחה. כדי הפרו פעיל לתמרן קובץ מצורף חרוט צמיחה, במקום מחט גרירה למטה "למטה" חרוט צמיחה ואז להנמיך את המחט נגד לתחתית צלחת. זה יגרום המחט להסיט את "למעלה", כיפוף הזזה לאורך תבשיל לתוך חרוט צמיחה, השתחרר ומרגש זה "מעלה". לחצו על מחט נגד לתחתית צלחת מספיק כך חרוט צמיחה ווים סביב קצה המחט, אבל לא כל כך רחוק שזה מחליק מעל המחט ומחליק לאחור. חכו 20 דקות כדי לאפשר אחיזה להתבסס. עם ניסיון, שיעור ההצלחה יכול להיות גבוה ככל 90%, אבל הוא יותר בדרך כלל בטווח של 75%. בתחילה שיעור ההצלחה עשוי להיות קרוב יותר ל -25%. מכשול העיקרי כאשר בתחילת היא "מעל לתפעל" חרוט צמיחה. האינטראקציה הראשונית "צעד לדחוף את" לוקח כמה שניות. חרוט הצמיחה אמור להיות לבד כדי ליצור התקשרות המשרד. אז סבלנות יש למימוש במהלך השלבים הבאים.
- כאשר חרוט הצמיחה על המחט, את מתח קלה על זה על ידי הזזת המחטים ימין, ולהעלות את המחט קצת. פיצוי על המחט נעה "כלפי מטה" על ידי הזזת המחט מעט קדימה תוך העלאת. הרם בשלבים עד שיש לך את התהליך מצורף הארכת בניצב מן המחט ומעל פני השטח של המנה. הסדר אנכי של האקסון המשתרעת המחטים פעם גרירה החלה נדרש כוח מדידות מדויקות, כלומר כך וקטור היחידה הכוח המופעל הוא לאורך ציר של האקסון. אם הזוויות תהליך נגרר מן המחט, וקטור הכוח נולד לאורך ציר של המחט במקום לכופף את המחט כוח מוחלט אינו נמדד. קבלת מהמקום של הקובץ המצורף צלחת הראשונית משפר את סיכויי מצורף קיימא המחט. הטיפ יכול להיות מעל פני השטח של המנה (לראות תנודות קטנות או מטוס אחר של המוקד מן המנה) או לגעת בו בעוצמה מינימלית. יותר מדי לגרור על פני השטח יהיה להטות את המדידות. מחט דבק צלחת, או תהליך התא reattaching למצע יוביל כוח טעינת אם אתה כל הזמן מנסה להעביר אותו, מה פתאום "צץ רופף" עם אובדן אפשרי של הקובץ המצורף. כדי לשחרר את המחט מנקודת כזה דבק, להזיז את המחט קדימה ואחורה ('מעלה' ו 'למטה' במישור של המסך) במקום להוסיף כוח יותר (מימין).
- גרירה מושגת על ידי יישום במרווחים קטנים של כוח על ידי הזזת המחטים מהגוף התא. כוחות הם obserVED כמו פער הולך וגדל בין המחטים. אמנם בהדרגה את המתח, בזהירות להתבונן על סימני ניתוק של חרוט צמיחה של המחט.
- אם חרוט צמיחה מתנתק ואינו במהירות retracting, להקטין את המתח קצת ולחכות, לעתים קרובות חרוט הצמיחה "להדביק" לתפוס על קצה שוב. אם האקסון יורד המחט לתפוס אותו לפני שהוא חזר בו על ידי השמנה זה נגד צלחת עם המחט ולחזור על "דחיפה למעלה" או "לנתץ" להכניס קצת מתח עליו להמתין כ -10 דקות עבור קובץ מצורף מחדש . אחרי שני ניסיונות כושלים, מומלץ להשתמש תאים שונים.
- לשמור על רמת התקשורת המנה על ידי הוספת מים מדי שעה כדי לאזן אידוי, באמצעות סימן בצד המנה, כדי לציין את עומק הראשונית. בעזרת פיפטה פסטר ארוך, לאט לאט להוסיף מים לצד המנה במרחק של המחטים. הרחבה של תהליך לעתים קרובות "דוכנים" אם התקשורת הופכת hyperosmotic. אידוי יכול להיות פחתה עם ציפוי נפט על פני התקשורת, אבל זה היה צריך להיות הוסיף לאחר המחט היא בתקשורת. אם המחט עוברת דרך הנפט, חרוט צמיחה הרבה פחות סביר לצרף המחט.
- בסוף הניסוי, לפני שאתה להרים את המחטים מתוך ולבדוק את המנה, את המרחק לאפס.
- קראו את העמדות של המחטים לאורך ציר אופקי על המסך, את המיקום של גוף התא ושעות שיא. מרחק ההפרדה בין מחטים מינוס המרחק אפס פרקו מוכפל קבוע עבור כיפוף המחט שווה μdynes כוח מיושמים. כייל את תמונת המסך מרחקים באמצעות מיקרומטר הבמה.
- חשוב מאוד עבור איכות הנתונים היא להבטיח את המרחק התייחסות (אפס כוח) הפרדה בין המחטים אינה משתנה במהלך הניסוי. שינויים תרמי ישפיע על ציוד בסולם מיקרון, כלומר לא להפעיל את המזגן במהלך ניסוי. גם אם מערכת החימום מיקרוסקופ שלך יש זמן השהיה לחכות עד שיש לך יציבות תרמית. Ringcubator מקטין את זמן השהיה גם מבודד את השינויים תרמית בצלחת משאר המיקרוסקופ ומערכת מניפולציה הפוחתת סחיפה תרמית של אפס לבין שינויים בפוקוס. עוד כוח לשנות את ההפרדה פרקו של מחט הוא מתח הפנים על פירים מחט. עומס משתנה עם העומק של הנוזל בצלחת. בדיקת מרחק הפניה באמצעות גיבוי מחטים זמנית לראות את המרחק ללא כוח אפס מדי פעם במהלך ניסוי משפרת את איכות הנתונים, גם אם אתה וציין שינוי ההפרדה.
8. צירוף תאים
9. הרחבת תהליך האקסון או תא
10. ניתוח נתונים
11. נציג תוצאות:
כוח מכויל מחטים זכוכית יכול בקלות להיות מיושם על כל האזור הסלולר, בדרך כלל חרוט צמיחה, כמו דמיינו ישירות על ידי מיקרוסקופ אור. עם טיפול מתאים של המחט להשיג מצורף הסלולר, מתח מכני יכול להיות מיושם באופן ניסיוני באזור הסלולר של עניין, או כוחות המיוצר על ידי האזור שניתן למדוד. הניסוי נציג העצבית גרירה מוצג באיור 1, שבו האקסון נגרר הוכפל אורך שעתיים.
באיור 1. עוף תרבותי שורש הגנגליון הגבי תא עם האוריינטציה המועדפת עבור גרירה נבחר. המרחק הראשוני בין אפס התייחסות המחטים נרשם לפני מניפולציה ניסויית מתחיל (A). התמרון "לדחוף מעלה" מוחל על חרוט צמיחה (B). גרירה מתחילה עם טעינת כוח מוגבר כפי שצוין על ידי הפרדה של מחטים (C). גרירה האריך את האקסון, את המערכים 'אופקי' ו בניצב של האקסון נגרר ו מחט העבודה הקלו מדידות כוח טוב (D). בר = 40 מיקרומטר. כיול מחט = 6.9 μdyne / מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות ליישם ולמדוד כוחות הסלולר יש היסטוריה ארוכה 9. השיטה שלנו נבעה במקור על ידי העבודה של דניס בריי, שהשתמשו במחטים זכוכית דומה לשלנו לנוירונים "גרירה" בקצב קבוע באמצעות מכשיר הידראולי ממונע 10. ישנם אמצעים חלופיים רבים של החלת כוחות תאים הכוללים: stepper מנועים 11, 12 חרוזים מגנטיים, קורות microfabricated 13 ו - 14 זורם נוזל. האחרון דומים הגישה שלנו כי בדיקה הסלולר הוא מכויל בסופו של דבר נגד קרן כיפוף של קשיחות ידוע מדידות הסלולר תלויה תצפיות מיקרוסקופיות אופטיות. בהשוואה לגישות אחרות, היתרון העיקרי של השיטה שלנו 3 הוא היכולת בו זמנית להחיל ולמדוד כוחות בטווח μdyne שימוש בציוד (מיקרוסקופים micromanipulators) טיפוסי של מחלקות מדעי החיים.
שימוש בשיטות אלה, הכוחות המופעל על ידי קונוסים הצמיחה העצבית כפי שהם מראש נמדדו 15. הקשר המכאני של קצב התארכות axonal בתגובה המתח נקבע לעקוב אחרי הניוטונית נוזל דמוי הגירוי תגובה היחסים 7. הרגישות היחסית של אקסונים בתגובה למתח הוצגה להיות גדול יותר הנוירונים במוח מרכזי מאשר הנוירונים ההיקפיים של העובר עוף 2. הכחשה של אקסונים גם נחקרו 7. נוירונים עם אקסונים לא נקבע יכולה להיות קוטביות axonal / הדנדריטים שלהם נשלטת על ידי יישום של מתח מכני 5. ב fibroblasts להביע GFP שכותרתו אקטין או טובולין, אנחנו ישירות דמיינו את תגובת cytoskeleton כדי התקשרות פשוטה של מחט, כמו גם התגובה שלו לשינויים של מתח 8. מצורפים תא אחד לשני או מצעים נבדקו 1. כוחות הנעה של תאים ניעתי ניתן היה לבדוק את המשיכה של filipodia מתקרב ניתן היה למדוד 16. תנועות המוצגים על ידי המיטוכונדריה שכותרתו בתוך אקסונים נגרר שימשו להובלת המודל הפנימי חומר (תחבורה מהירות נמוכה) ולקבוע כי בנוסף לנוירונים לגדול על ידי המוני intercalated לאורך הפיר axonal 6,17.
עבור חוקרים מעוניינים פשוט ביישום כוחות בלי למדוד אותם, שימוש במחט ההתייחסות אינה נדרשת 18. לעומת זאת, אם מדידות בכוח הרצוי המחט התייחסות חיונית להפקת נתונים מדויקים. בסך הכל, אנו מעריכים את השגיאה המדידות כוח מוחלט להיות בטווח של 5% עד 10% עם המקור הגדול ביותר של טעות שמקורה בתהליך הנתונים הקריאה. הקושי הוא דווקא זיהוי מיקומו של המחט התייחסות ממוקד ומזעור ההשפעות של גב קטן ושוב תנועות (ויברציות) של המחטים. ללא מחט התייחסות, אלה מקורות של טעות יהיה אפילו גדול יותר.
מניפולציות ניסויית לא צריך להסתיים הפגישה גרירה. קונוסים צמיחה נגרר יכול להיות מצורף תאים אחרים או לחבר מחדש את המנה 5. שימוש מניפולטיבי את ההזדמנות הזו, circutry מיקרו העצבית יכולה להיות מוגדרת בכוונה, המאפשר לדבר צלב של תאים מסוגים שונים כדי להיבחן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו בתודה להכיר התרומות החשובות של ד"ר רוברט בוקסבאום בפיתוח מתודולוגיה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
