Summary
Misure di applicazione e diretto di forze sui neuroni nel range 2000-1000 Microdyne sono realizzati con la massima precisione utilizzando aghi di vetro calibrato. Questa metodologia può essere utilizzato per controllare e misurare diversi aspetti dello sviluppo assonale, incluso l'avvio assonale, tensione assonale, la velocità di allungamento assonale e vettori di forza.
Abstract
Manipolazione delle cellule e l'estensione degli assoni neuronali può essere realizzato con vetro calibrato micro-fibre in grado di misurare ed applicare le forze in campo μdyne 1,2 1-10. Misure di forza sono ottenute attraverso l'osservazione del Hookean flessione degli aghi di vetro, che sono tarati con un metodo diretto ed empirica 3. Requisiti attrezzature e le procedure per la fabbricazione, la calibrazione, il trattamento, e utilizzando gli aghi sulle cellule sono descritti. La forza di regimi di tipi di cellule precedentemente utilizzati e diversi a cui queste tecniche sono state applicate dimostrano la flessibilità della metodologia e sono dati come esempi per la ricerca futura 4-6. I vantaggi tecnici sono il continuo 'visualizzazione' delle forze prodotte dalle manipolazioni e la possibilità di intervenire direttamente in una varietà di eventi cellulari. Questi includono la stimolazione diretta e regolazione della crescita assonale e retrazione 7; così come distacco e di misure meccaniche su qualsiasi tipo di cellule in coltura 8.
Protocol
1. Rendere gli aghi di vetro.
- Un micro-ago regolabile estrattore viene utilizzato per fabbricare gli aghi con punta affusolata circa 4 mm di lunghezza e che sono chiuse solide travi. Al contrario di una punta flessibile lungo, questo breve 4 mm di lunghezza limiti vibrazioni della punta dell'ago durante gli esperimenti. Nella regione prossimale della fibra 4 mm, l'ago si assottiglia rapidamente dal diametro del tubo di vetro a 15 micron entro 1 mm, mentre la maggior parte distale-1 mm di fibra è di 2,5 micron di diametro. Noi usiamo R-6 di vetro capillare, OD 0,9 mm, ID 0,6 millimetri 8 "lunghezza e una BB-CH estrattore. Se l'investigatore è interessato a campi di misura altra forza, aghi con proprietà diverse molla (cioè di lunghezza diversa e o ) lo spessore deve essere tirata. Ogni tubo capillare tira in quattro 2 "aghi. Gli aghi vengono memorizzati in coperta 160 millimetri Petri con 'serpenti' due plastilina, in cui gli aghi vengono quindi premuti leggermente.
- Gli aghi di vetro, così come un ago filo per essere descritto, sono essenzialmente le travi utilizzate come fonti di curvatura di rigidità appropriato per la misura desiderata della forza. Si noti che la forza di piega di un fascio di scale come il cubo della sua lunghezza, indipendentemente dalla composizione. Così, per una qualsiasi delle fasi di calibrazione descritta di seguito, un fascio ago / di rigidità insufficiente può essere fatta più rigida con una piccola quantità di grasso (per esempio una riduzione del 10% produce un aumento del 28% della rigidità, cioè 0,9 3).
2. Fare e calibrare un ago filo
- Fai un ago di calibrazione filo inserendo un 0.001 "filo Chromel attraverso l'interno di un ago di vetro (fatto nella sezione 1.1) con la sua punta rotto. Tirare il filo dalla punta ad una lunghezza di 26 mm e la colla in posizione con colla super. Piegare la distale 1 mm dal filo in un gancio.
- Fai la micro-pesi da 1 metro di 0.003 "filo di costantana. Per misurare il filo, nastro adesivo di un metro per aiutare a ottenere la diritta possibile. Pesare il 1 m di filo, accuratamente tagliato a pezzi di 1 cm, e piegare diversi pezzi in Vs
- Calibrare gli aghi fili richiede un microscopio da dissezione con un reticolo di misura e un micromanipolatore. Il microscopio è inclinato di 90 ° su un lato con un supporto universale boom, in modo tale che una deflessione verso il basso del filo dell'ago può essere osservato. Montare l'ago filo di sezione 2.1 in un portautensile su un micromanipolatore tale che la regione è agganciato perpendicolare all'asse ottico del microscopio. Allineare il gancio del filo dell'ago con un segno di reticolo. Agganciare il 1 centimetro micro-peso sul gancio e registrare la flessione. La costante flessione (μdynes / micron) del filo di riferimento è calcolato come rapporto tra il micro-peso (nota: 1 mg = 0,98 dyne) divisa per la deviazione osservata (micron). Per preparare l'ago filo per il passo successivo, tagliato fuori dai guai durante la pesata punto con un bisturi. La presenza del gancio è il peso supplementare che si piega il filo di un piccolo grado. Così gli effetti la posizione iniziale del filo nel reticolo prima che il peso è aggiunto. La misura della costante della molla filo deriva dalla deviazione del filo, quando il peso è aggiunto al punto di curvatura (punta il futuro del filo). Quando il gancio è tagliato fuori non cambia la costante elastica del filo.
3. Calibrare gli aghi di vetro intermedio
- Calibrazione degli aghi di vetro intermedio richiede l'utilizzo di un microscopio invertito con un reticolo oculare. Su un lato del palco è un microscopio micromanipolatore meccanico utilizzato per contenere l'ago filo della sezione 2 nel centro del campo ottico. Dall'altro lato è un tre assi micromanipolatore idraulico (vedi tabella attrezzature) usati per spostare l'ago di vetro intermedio sta calibrando. Utilizzando il micromanipolatori, portare sia aghi insieme al centro del campo ottico in un ~ 45 ° angolo in una 160 mm x 30 mm piastra di Petri di acqua in un campo di 10x.
- Una serie di aghi tirati con impostazioni diverse sul estrattore pipetta vengano prima generate per la valutazione. L'obiettivo è quello di fare un ago intermedio di vetro con una molla di curvatura costante di 20-30 μdynes / micron. Determinazione della rigidità viene effettuata misurando il rapporto tra la deflessione dell'ago intermedia rispetto alla flessione del filo dell'ago. Ad esempio, con gli aghi e fili di vetro toccare, l'ago di vetro viene spostato a deviare l'ago del filo una distanza di 5 punti sul reticolo, visti attraverso i pezzi occhio. Spostare l'ago di vetro stacca lateralmente gli aghi. L'ago filo poi ritorna nella sua posizione originale di partenza, ma l'ago di vetro sarà ora in una nuova posizione. Il carico sul ago di vetro viene poi calcolata la sua nuova posizione di forza zero meno la posizione di entrambi gli aghi a carico forza uguale (entrambi impegnati aghi). In questo esempio, se entrambi gli aghi vengono deviati a segnare 5 (da zero il reticolo), l'ago filo tornerà a zero, mentre il GLAss ago potrebbe primavera a 25, se è così, piegata 20 punti con la stessa forza che il filo di flesso ago 5 punti. Pertanto, il rapporto di curvatura tra i due aghi consente la calibrazione del ago di vetro ed è ¼ rigido come l'ago filo. Poiché i calcoli costante elastica nella sezione 3.4 uso rapporti di distanze che sono indipendenti di ingrandimento o la dimensione divisione reticolo. L'unica considerazione di limitazione è che le deformazioni sono piccole abbastanza per essere in campo elastico lineare degli aghi.
- Fare una serie di deviazioni nelle posizioni di 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 segni sul reticolo. Se sviamenti rilascio prematuramente ripetere quelle. Tra deviazioni tenere l'ago del filo allineati a zero. Per ognuna di queste deviazioni, si noti l'ammontare deviato e la finale zero carico posizione dell'ago di vetro dopo il rilascio. Questo crea 10 coppie di punti dati. Sequenze possono essere utilizzati altri, ma questa serie è stato progettato per fornire le prime indicazioni di coerenza interna, linearità e isteresi (risultati di deviazioni 5 + 10 = 15; 3 +7 = 10; il 5,10,15 deviazioni dopo il rilascio dovrebbe essere di circa la stessa all'inizio e alla fine).
- Regressione lineare dei deviazioni registrate da sezione 3.3 fornisce una quantificazione più precisa della costante flessione del ago di vetro intermedio di un rapporto di deflessione singolo. Fornisce inoltre una valutazione della linearità dell'ago e la qualità della calibrazione indicata da un valore di r più elevato e la vicinanza del intercetta della retta di regressione a zero. Per preparare i 10 coppie di dati dalla sezione 3.3 per la regressione, il secondo numero delle coppie registrate, la finale zero carico posizione dell'ago di vetro dopo il rilascio, deve avere la flessione iniziale corrispondente sottratto da esso, che è il primo numero di la coppia. Una volta che questa operazione viene eseguita l'insieme delle coppie costituite nuovo numero della deflessione iniziale e la corrispondente differenza calcolata. Aggiungere 5 coppie di controllo di 0,0 a queste 10 coppie di dati sperimentali per ancorare la regressione lineare a zero forza per lo zero flessione. Questo non è assolutamente necessaria, ma aggiunge un ulteriore grado di precisione. Ancoraggio a 0,0 si basa sul principio che l'ago non è piegato quando la forza non è applicata. Con questi 15 coppie di dati calcolare una regressione lineare. La molla di flessione costante del ago di vetro da tarare è l'ago filo noto costante flessione diviso per la pendenza di questa retta di regressione.
4. Calibrare l'ago lavorazione del vetro usato per manipolare i neuroni
- Aghi di vetro di conformità sufficiente, 2-15 μdynes / micron, per essere utilizzati in via sperimentale sui neuroni sono calibrati contro l'ago di vetro intermedio in modo analogo, come descritto nella sezione 3. Cioè, aghi candidato di lavoro deviare un ago intermedio di rigidità conosciute nella posizione dell'ago filo nella sezione 3. Aghi di vetro di meno di 2 μdynes / micron può essere leggermente accorciato per renderle la gamma di rigidità appropriato.
5. Gli aghi sono pretrattati con fattori di adesione
- Aghi da trattare vengono pressati sul lato di un pezzo di argilla tenuto in un morsetto posto sopra un bicchiere da 10 ml di soluzione attaccamento fattore, in modo tale che solo la punta dell'ago sia immersa nella soluzione. Immergendo l'albero tubo capillare è indesiderabile perché aumenta l'accumulo di vernice sulla punta nel corso del tempo, che cambia la rigidità e riduce l'efficacia dell'ago di attaccamento. Un ago calibrato può essere utilizzato solo circa 4 volte e può essere ricalibrato per la precisione. Gli aghi sono immersi in sequenza a 0,1% soluzione polilisina per 30 minuti e poi concanavalina A (1 mg / ml in PBS) per 30 minuti. Il polilisina può essere utilizzato ripetutamente per diverse settimane ed è conservato a -20 ° C. Fai settimanale fresca Cona e conservare a 4 ° C. Per altri tipi di cellule le molecole presentato alla loro superficie con l'ago può dirigere il corso delle indagini.
6. Attrezzatura installata
- Il posto di lavoro di traino è impostato su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. È costituito da un microscopio invertito dotato di una barra sulla sinistra sopra il palco e un manipolatore idraulico collegato ad esso, tenendo la nostra estensione controbilanciato personalizzati, in cui il portautensili doppio è inserito. Posizionare il micromanipolatore idraulico lungo la barra, mettendo un ago nel suo supporto nel percorso di luce del microscopio, mentre i controlli del manipolatore sia concentrata in loro gamme. Al momento l'ago è in trattamento con fattori di attaccamento, accendere il Ringcubator o altro sistema di microscopio fase di riscaldamento, per cui la scena è in equilibrio termico all'inizio degli esperimenti.
7. Allineando gli aghi
- L'obiettivo è quello di ottenere i due aghi (il riferimento e l'ago di lavoro) nel campo visivo del microscopio disposti in modoi loro suggerimenti sono di circa 50 micron a parte, a parte, con il riferimento di cui sopra il piatto della cultura, quindi un po 'fuori fuoco quando l'ago di traino è a fuoco sul piatto. I due aghi nel loro porta-aghi sono montati in una doppia portautensili Leica, che è essa stessa un micromanipolatore piccolo. Utilizzando la micromanipolazione del doppio strumento di supporto, le due punte sono portati in allineamento parallelo. Inserire l'ago di riferimento in una porta aghi a breve distanza, quanto basta per consentire al collo stringendo la presa e questa assemblea posto nella parte destra del portautensili doppio. Inserire il trattato di lavoro ago metà della sua lunghezza nel supporto ago e posizionarlo nella parte sinistra del portautensili doppio. Quando le due punte aghi vengono portati nella stessa posizione in avanti e in fila, le lunghezze differenti degli aghi nelle loro titolari barcollare i collari in modo da non ostacolare ottenere le punte molto vicini tra loro. Sezioni 7.2 con 7,4 sono fatte senza ingrandimento. Sezioni 7,5-7,8 si fanno sotto osservazione microscopica.
- Pre-impostare il micromanipolatore idraulico in modo che il controllo verticale è tutto il senso fino. Impostare gli altri controlli al centro della loro gamma, e anche la avanti / indietro vite del portautensili.
- Portare le due punte aghi insieme utilizzando il lato a lato vite di regolazione sul lato destro del portautensili. Quindi spingere il porta-aghi stessi in avanti o indietro nel portautensile doppia necessario per portare la punta dell'ago nella stessa posizione in avanti. Esaminare la coppia di lato e utilizzate la parte destra su / giù vite per portare le punte nel piano stesso. Ruota porta-aghi nel supporto strumento per colmare il divario se un ago in angoli sua porta aghi.
- Ruotare il portautensili e luogo le punte nel percorso della luce sopra la superficie del supporto, pesca giù ripida. Stringere la vite di giunto sferico alla base prima di spostare la mano.
- Trova il tuo punte ago nel campo visivo del microscopio prima di portare troppo in basso e romperli o fallo con detriti sul fondo del piatto cultura. In un piatto da 60 mm, 15 ml di mezzo fornisce profondità sufficiente per un margine di sicurezza al di sopra del fondo piatto. Fare una pratica iniziale con un ago non calibrato per avere la sensazione di questo passo. Iniziate puntando verso l'alto sopra le cellule sul fondo del piatto con l'obiettivo a10x. Fate questo in una zona del piatto lontano da cellule sensibili alla luce o esemplari sperimentali. Abbassare il aghi nella media. Spostare il lato aghi a lato cerca di ombra. Se non li vedi, li un po 'più basso e spostare in avanti nel piatto, ripetere il lato di passare lato. Trova la punta, spostando indietro (o avanti) e verso il basso.
- Ruotare il lato a lato vite per vedere che l'ago si è trovato. Se si muove con la vite che stai cercando l'ago di riferimento, se non è l'ago calibrato. Per l'ago calibrato, utilizzare il lato di vite laterale per spingere l'ago di riferimento verso di essa. Muoverlo avanti e indietro in cerca di ombra il riferimento è. Se è l'ago di riferimento che avete trovato, vite a sinistra mentre si muove l'idraulico a destra cercando l'ago calibrato.
- Quando entrambi gli aghi si trovano utilizzare i controlli belle del portautensili doppio di allineamento. L'angolo ripido degli aghi provenienti oltre il bordo del piatto provoca la salita / discesa di avere anche un attaccante, allungamento dei componenti per l'adeguamento verso l'alto e verso il basso con un accorciamento. Il lato sinistro, avanti / indietro di controllo vite è l'opposto, spingendo la punta in avanti è anche giù nel piatto, tirandolo indietro si ritira l'ago, aumentando nel contempo la posizione della punta. Pertanto, aumentando il riferimento e spingendo in avanti l'ago calibrato si allungano sia per renderli ancora alle punte, mentre anche loro messa in rapporto ottimale di altezza sopra il piatto. Se l'ago di riferimento si estende ben oltre l'ago di lavoro è possibile avvitare / spingere l'ago di lavoro basso e in avanti, mentre il riferimento oscillare verso il basso e accorciando fino i due sono ancora e l'ago di lavoro è inferiore. A volte la gamma di viti non porterà gli aghi insieme, quindi potrebbe essere necessario far scorrere dolcemente i titolari stessi, assicurarsi che la vite giunto a sfera è ben stretto e utilizzare le dita incastrato contro il bordo del titolare strumento per applicare la forza per far scorrere il alberi. È inoltre possibile ruotare il porta-aghi nel portautensile come prima, mentre nella media e osservando l'effetto, vedere se sono sempre più vicini.
- Registrare l'immagine di questa posizione finale regolata, la separazione degli aghi senza alcuna forza applicata è la distanza di riferimento pari a zero. Alza gli aghi sopra il piano del campione e 'parco' li ai margini del campo visivo.
- Detriti su un ago può essere rimosso aumentando attraverso il menisco. In primo luogo spostare l'ago di riferimento lontano da l'ago altro per evitare le due punte bloccandosi sul vicenda. Più passaggi può essere necessario. </ Ol>
- A questo punto, gli aghi sono stati osservati direttamente attraverso il microscopio. Cominciando con l'attaccamento di cellule, le osservazioni saranno effettuate sia attraverso il microscopio e sullo schermo video. L'aspetto sinistra / destra di entrambi è identico, ma l'orientamento alto / basso dell'immagine sullo schermo del video non è la stessa (gravitazionale) su e giù sul microscopio. Per chiarire le differenze tra le direzioni alto / basso, come osservato direttamente attraverso il microscopio e come osservato sullo schermo del video, il secondo sarà denominato 'up' e 'basso', cioè tra virgolette
- Il processo di traino viene fatto modificando la posizione dei due aghi da sinistra a destra ('orizzontale') sullo schermo video. Di conseguenza, la scelta di assone sperimentale è fatta in parte l'assone si estende nella stessa direzione 'orizzontale'. L'assone può deviare 'verso il basso' da 'orizzontale' di ben 15 °, in quanto questa sarà compensata dalla manovra il 'push up' della sezione 8.5. Inoltre, l'assone scelto per la manipolazione deve essere la lunghezza del corpo cellulare, o più, con un cono di crescita attiva. Gli assoni si estende alla destra del corpo cellulare sono da preferire per il set up del portautensili doppio con l'ago di lavoro montato a sinistra dell'ago di riferimento, in modo che la tensione applicata durante traino allarga il divario tra le due aghi.
- Un assone principale che si estende a sinistra del corpo cellulare può essere trainato senza riorientare il doppio strumento di supporto istituito dal allargando il divario tra gli aghi e sollevando l'ago di riferimento un po '. Questo permette lo spazio ago traino più a flettere verso il riferimento e passare sotto di esso, se necessario. Il traino poi avanzare verso sinistra e l'ago di traino si piega verso l'ago di riferimento con l'aumentare della tensione. Quando si analizzano i dati di questo cambiamento nel rapporto di tensione alla distanza di riferimento è inserito nel foglio di calcolo sottraendo la misura di separazione ago dalla distanza di riferimento zero al posto della distanza zero dalla misurazione.
- Spostare gli aghi nei pressi del cono di crescita dell'assone, registrare la distanza zero ancora una volta, alzare gli aghi, e l'aria il tavolo isolamento dalle vibrazioni.
- Basta mettere l'ago di lavoro davanti ad un cono di crescita avanza può produrre attaccamento spontaneo come avanza il cono di crescita. Per proattivo manipolare un attaccamento al cono di crescita, l'ago di traino verso il basso 'sotto' il cono di crescita e quindi abbassare l'ago contro il fondo piatto. Questo farà sì che l'ago deviare 'su', piegatura e scivolare lungo il piatto nel cono di crescita, sloggiare e spostandolo 'verso l'alto'. Premete l'ago contro il fondo piatto quanto basta in modo che il cono di crescita ganci attorno alla punta dell'ago, ma non così lontano che scivola sopra l'ago e scivola indietro. Attendere 20 minuti per consentire una presa stabilirsi. Con l'esperienza, la percentuale di successo può raggiungere il 90%, ma è più tipicamente nel range 75%. In un primo momento il tasso di successo può essere più vicino al 25%. L'insidia principale è quella di quando inizio 'nel manipolare' il cono di crescita. L'interazione iniziale del 'push up step' dura pochi secondi. Il cono di crescita dovrebbe poi essere lasciati soli a formare un fermo attaccamento. Poi la pazienza deve essere esercitato durante i seguenti passaggi.
- Quando il cono di crescita è l'ago, mettere una leggera tensione su di esso, spostando gli aghi a destra e sollevare l'ago un po '. Compensare l'ago in movimento 'al ribasso', spostando l'ago avanti un po ', aumentando nel contempo. Sollevare in più fasi fino ad ottenere il processo collegato estende perpendicolarmente dal ago e sopra la superficie del piatto. La disposizione perpendicolare delle assone si estende dagli aghi, una volta di traino è iniziato, è richiesto per le misurazioni accurate forza, cioè in modo che il vettore unica forza applicata è lungo l'asse del assone. Se gli angoli processo trainato dalla ago, un vettore della forza nasce lungo l'asse dell'ago piuttosto che piegare l'ago e la forza totale non viene misurata. Allontanarsi dal luogo dell'attacco piatto iniziale migliora le prospettive di un attaccamento duratura l'ago. La punta può essere al di sopra della superficie del piatto (visto in vibrazioni poco o un diverso piano di messa a fuoco dal piatto) o toccando con forza minima. Troppo trascinare in superficie sarà inclinare le misure. Un ago per attaccare il piatto, o il processo cellulare ricollegamento al substrato porterà a forzare il caricamento se si continuano a cercare di spostarlo, che poi improvvisamente 'si apre sciolti' con possibile perdita di attaccamento. Per liberare l'ago da un tale punto critico, spostare l'ago avanti e indietro ('up' e 'giù' sul piano dello schermo) invece di aggiungere una forza maggiore (a destra).
- Traino viene eseguita applicando piccoli incrementi della forza, spostando gli aghi di distanza dal corpo cellulare. Forze sono osservazionived come un crescente divario tra gli aghi. Mentre aumentando gradualmente la tensione, osservare attentamente per eventuali segni di distacco del cono di crescita dall'ago.
- Se il cono di crescita si stacca e non è rapidamente scomparsa, diminuire la tensione un po 'e aspettare, spesso il cono di crescita' recuperare 'e afferrare la punta di nuovo. Se l'assone si stacca l'ago prenderlo prima che si ritrae dalla cattura contro il piatto con l'ago e ripetere il 'push up' o una 'abbattere' di mettere un po 'di tensione su di esso e attendere circa 10 minuti per la ri-attacco . Dopo due tentativi falliti, si consiglia di utilizzare una cella diversa.
- Mantenere il livello dei media nel piatto con l'aggiunta di acqua ogni ora a controbilanciare l'evaporazione, utilizzando un segno sul lato del piatto per indicare la profondità iniziale. Con una lunga pipetta Pasteur, aggiungere lentamente l'acqua a lato del piatto lontano dagli aghi. Proroga di un processo spesso 'bancarelle' se i media diventa iperosmotico. Evaporazione potrebbe essere diminuita con uno strato di olio sulla superficie media, ma questo dovrebbe essere aggiunto dopo che l'ago è nella media. Se l'ago passa attraverso l'olio, il cono di crescita è di gran lunga meno probabile da allegare al ago.
- Alla fine di un esperimento, prima di sollevare gli aghi dal ricontrollare piatto, la distanza zero.
- Leggi le posizioni degli aghi lungo un asse orizzontale sullo schermo, la posizione del corpo cellulare e tempi record. La distanza degli aghi meno la distanza scaricato a zero moltiplicato per la costante flessione per l'ago è uguale alla μdynes della forza applicata. Calibrare le distanze schermo immagine utilizzando un micrometro.
- Molto importante per la qualità dei dati è garantire la distanza di riferimento (zero forza) la separazione tra gli aghi non cambia durante l'esperimento. Cambiamenti termici danneggi l'apparato sulla scala micron, cioè non accendere l'aria condizionata durante un esperimento. Anche se il vostro sistema di riscaldamento microscopio ha un tempo di ritardo attendere di avere stabilità termica. Il Ringcubator diminuisce il tempo di ritardo e isola anche le variazioni termiche nel piatto dal resto del microscopio e del sistema di manipolazione diminuzione deriva termica dello zero e le modifiche a fuoco. Un'altra forza alterando separazione scaricato l'ago è la tensione superficiale sugli alberi ago. Il carico cambia con la profondità del liquido nel piatto. Controllo della distanza di riferimento eseguendo il backup degli aghi e temporaneamente vedere il no-force distanza zero occasionalmente durante un esperimento migliora la qualità dei dati, anche se si sta notando un cambiamento nella separazione.
8. Connessione a cellule
9. Estensione di un processo assone o cella
10. Analisi dei dati
11. Rappresentante dei risultati:
La forza-calibrato aghi di vetro possono essere facilmente applicate a qualsiasi regione del cellulare, di solito il cono di crescita, come visualizzato direttamente al microscopio ottico. Con un appropriato trattamento dell'ago per ottenere l'attaccamento cellulare, la tensione meccanica può essere sperimentalmente applicato alla regione cellulari di interesse, o le forze prodotte da quella regione può essere misurata. Un rappresentante esperimento neuronale di traino è illustrato nella figura 1, dove l'assone trainato è stata raddoppiata in lunghezza in due ore.
Figura 1. Colto dorsale pollo radice cellule gangliari con l'orientamento preferenziale per il traino viene scelto. La distanza di riferimento iniziale pari a zero tra gli aghi viene registrata prima che la manipolazione sperimentale inizia (A). Il 'push up' manovra viene applicata al cono di crescita (B). Traino inizia con carico di forza maggiore, come indicato dalla separazione degli aghi (C). Traino ha esteso l'assone, gli allineamenti 'orizzontale' e perpendicolare dell'assone rimorchiati e aghi di lavoro hanno facilitato le misurazioni buona forza (D). Bar = 40 micron. Calibrazione ago = 6,9 μdyne / micron.
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Discussion
Tecniche da applicare e misurare le forze di cellulari hanno una lunga storia 9. Il nostro metodo è stato originariamente motivato dal lavoro di Dennis Bray, che ha usato gli aghi di vetro simile al nostro a 'trainare' i neuroni a velocità costante utilizzando un dispositivo motorizzato idraulico 10. Ci sono molti mezzi alternativi di applicare forze di cellule che comprendono: motori passo-passo 11, perline magnetico da 12, travi microfabbricazione 13 e fluido 14. Questi ultimi sono simili al nostro approccio che la sonda cellulare è in ultima analisi, calibrato contro un raggio di curvatura di rigidità conosciute e le misurazioni cellulare dipendono osservazioni al microscopio ottico. In confronto ad altri approcci, il vantaggio principale del nostro metodo 3 è la capacità di applicare contemporaneamente e misurare le forze in campo μdyne uso di apparecchiature (microscopi e micromanipolatori) tipiche dei dipartimenti delle scienze della vita.
L'utilizzo di questi metodi, le forze esercitate dai coni di crescita neuronale come anticipo sono stati misurati 15. Il rapporto meccanico del tasso di allungamento assonale in risposta alla tensione è stata determinata a seguire un fluido newtoniano come stimolo-risposta 7. La sensibilità relativa di assoni in risposta alla tensione è risultata essere maggiore per i neuroni del cervello centrale che per i neuroni periferici di un embrione di pollo 2. Retrazione degli assoni è stato anche valutato 7. I neuroni senza assoni determinato possono avere il loro polarità assonale / dendritiche controllato mediante l'applicazione di tensione meccanica 5. Nei fibroblasti che esprimono GFP-etichettata actina e tubulina, noi direttamente visualizzata la risposta del citoscheletro all'attaccamento semplice dell'ago e la sua risposta ai cambiamenti di tensione 8. Gli allegati delle cellule tra loro o substrati sono stati testati 1. Le forze propulsive delle cellule mobili potrebbe essere esaminata e la forza di avvicinarsi filipodia potrebbe essere misurato 16. I movimenti visualizzati dai mitocondri etichettato all'interno trainato assoni sono stati utilizzati per il trasporto di materiale modello interno (trasporto a bassa velocità) e di determinare che i neuroni crescono con l'aggiunta di massa intercalati lungo tutta la lunghezza dell'albero assonale 6,17.
Per gli investigatori semplicemente interessati a presentare domanda senza misurare le forze, l'uso dell'ago di riferimento non è necessario 18. Al contrario, se le misurazioni sono voluti forzare l'ago di riferimento è essenziale per generare dati accurati. Nel complesso, si stima l'errore nelle misurazioni forza assoluta di essere nel range del 5% al 10% con la massima fonte di errore che sorgono nel processo di lettura dei dati. La difficoltà è proprio nel definire la posizione dell'ago riferimento defocused e minimizzando gli effetti di ritorno di piccole e indietro movimenti (vibrazioni) degli aghi. Senza un ago di riferimento, queste fonti di errore sarebbe ancora più grande.
Manipolazioni sperimentali non deve terminare con la sessione di traino. Coni di crescita trainato può essere collegato ad altre cellule o riattaccato al piatto 5. Utilizzando questa opportunità manipolativo, neuronale micro-circutry potrebbe intenzionalmente essere configurato, permettendo cross talk di diversi tipi di cellule da esaminare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine gli importanti contributi del Dr. Robert E. Buxbaum nello sviluppo di questa metodologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
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