Summary
2에서 1,000 사이 microdyne 범위에서 뉴런에 힘을 응용 프로그램의 직접 측정은 눈금 유리 바늘을 사용하여 높은 정밀도로 달성하고 있습니다. 이 방법론은 axonal 개시, axonal 긴장, axonal 연신율의 속도 및 힘 벡터를 포함 axonal 개발의 여러 측면을 제어하고 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
의 연결을 axons의 세포 조작 및 확장 10-1000 μdyne 범위 1,2의 병력을 측정하고 적용의 마이크로 섬유 가능 보정 유리로 수행할 수 있습니다. 포스 측정은 직접 경험 방법 3 보정하는 유리 바늘의 굽힘 Hookean의 관찰을 통해 얻을 수 있습니다. , fabricating 보정, 처리하고, 세포에있는 바늘을 사용하는 장비의 요구 사항 및 절차를 완전히 설명되어 있습니다. 무력이 기술은 방법의 유연성을 보여주 적용되었습니다 및 향후 조사 4-6위한 예제로 주어진되는 이전에 사용되며 다른 세포 유형을 정권. 기술적인 장점은 조작에 의해 만들어진 세력의 지속적인 '시각'과 직접적으로 세포 다양한 행사에 개입하는 능력입니다. 뿐만 아니라 분리 및 교양 세포 8 어떤 유형에 기계적 측정, 이들은 직접적인 자극과 axonal 성장과 철회 7 규정을 포함합니다.
Protocol
1. 유리 바늘 만들기.
- 조정 마이크로 니들 풀러는 고체 광선을 닫힌 4 mm 길이 약 테이퍼 팁 바늘을 조작하는 데 사용됩니다. 마찬가지로 긴 유연한 팁 반대로,이 짧은 4mm 길이는 실험 도중 바늘 끝의 진동을 제한합니다. 섬유의 말초 - 대부분의 1mm 직경 2.5 μm의 동안 4mm 섬유의 근위 지역에서, 바늘은 1mm 이내에 15 μm의에 유리 튜브의 직경에서 빠르게 tapers. 우리는 R - 6 유리 모세관, OD 0.9 mm, ID 0.6 mm 8 "길이와 BB - CH 풀러를 사용합니다. 수사관 다른 봄 속성 (다른 길이 또는 즉, 다른 힘 범위, 바늘 측정에 관심이있다면 두께)을 뽑아해야합니다. 각각의 모세관 네 개의 2 "바늘로 가져옵니다. 바늘은 바늘을 가볍게 누르면되는 두개의 모델링 점토 '뱀'으로 160mm 배양 접시를 덮고에 저장됩니다.
- 유리 바늘뿐만 아니라 설명이 될 수있는 와이어 바늘은 본질적으로 무력 원하는 측정에 적합한 강성의 굽힘 온천으로 사용 들보 있습니다. 참고 관계없이 구성의 길이의 큐브로 빔 저울의 굽힘 힘. 따라서, 아래에 설명된 보정 단계에 대해, 충분한 강성의 바늘 / 빔은 단축 소량 (예 : 10 % 단축이 강성에서 28 % 증가, 즉 0.9 3 생산)에 의해 stiffer 만들 수 있습니다.
2. 와이어 바늘 만들기 및 보정
- 그 끝이 부러와 유리 바늘의 내부 (섹션 1.1에서 만든)를 통해 0.001 "크로멜 와이어를 삽입하여 와이어 보정 바늘 만들기는.와 장소에서 26mm와 접착제 그것의 길이에 팁의 와이어를 당겨 슈퍼 접착제가. 후크로 와이어의 말초 1mm 벤드.
- 확인 마이크로 무게 0.003 "콘스탄탄 와이어의 1m에서. 위해서 와이어의 1m의 무게를 와이어, 그것이 바로 가능한 점점 지원하는 m 스틱 테이프를. 측정, 정확하게 1cm 조각으로 잘라, 그리고 굽힘 대에 몇 조각
- 와이어 바늘을 보정하는 것은 측정 십자선과 micromanipulator과 해부 현미경이 필요합니다. 현미경은 와이어 바늘의 아래로 편향을 볼 수 있습니다 이러한 범용 붐 스탠드를 사용하여 자사의 측면에 90 °를 기울여서입니다. 갈고리 지역 현미경의 광축에 직각는 그러한 micromanipulator에 공구 홀더에 섹션 2.1의 와이어 바늘을 탑재합니다. 십자선 마크 와이어 바늘의 후크를 선. 후크에 1cm 마이크로 무게를 잡아와 편향을 기록합니다. 관찰된 편향 (μm의)로 나누어 : 참조 와이어 (μdynes / μm의) 굴곡 상수는 마이크로 무게의 비율 (1 MG = 0.98 다인즈 주)로 계산됩니다. 다음 단계에 대한 와이어 바늘을 준비하기 위해 메스로 무게 지점에서 연결을 차단. 후크의 존재는 추가적인 무게입니다 작은 정도로 숨어은 와이어. 무게가 추가되기 전에 그러므로 그것은 십자선에있는 와이어의 초기 위치를 효과. 무게가 더 벤드 포인트 (전선의 향후 팁)에 추가되었을 때 와이어 스프링 상수의 측정은 전선의 편향에서 파생됩니다. 후크가 차단되었을 때 그것은 철사의 봄 상수 변경되지 않습니다.
3. 중간 유리 바늘을 보정
- 중간 유리 바늘의 교정 안구 십자선과 거꾸로 현미경의 사용을 필요로합니다. 현미경 스테이지의 한쪽에있는 광학 분야의 중심에 제 2의 와이어 바늘을 보유하는 데 사용하는 기계 micromanipulator입니다. 반대쪽에 보정되는 중간 유리 바늘을 이동하는 데 사용되는 세 축 유압 micromanipulator은 (장비 표 참조)입니다. micromanipulators 사용 10X 필드에 물을 X 30mm 페트리 접시 160mm로 ~ 45 ° 각도에서 광학 분야의 중앙에 두 바늘을 함께 가져.
- 피펫 끌어당기는에서 다른 설정으로 뽑았 바늘의 시리즈가 먼저 평가를 위해 생성됩니다. 목표는 20-30 μdynes / μm의 상수의 굽힘 스프링과 중간 유리 바늘을하는 것입니다. 강성의 결정은 와이어 바늘의 편향에 비해 중간 바늘의 편향의 비율을 측정하여 이루어집니다. 예를 들어, 철사, 유리 바늘들이 감동과 함께, 유리 바늘은 와이어 바늘에게 눈 조각을 통해 본으로 십자선에 5마르크의 거리를 비켜로 이동합니다. 유리 바늘을 이동하면 옆으로 바늘을 disengages. 와이어 바늘 다음 원래 시작 위치로 반환하지만, 유리 바늘은 이제 새로운 위치에있을 것입니다. 유리 바늘에 부하는 다음 평등 강제로 부하 (두 바늘이 참여)에서 두 바늘의 위치 마이너스 새로운 제로 강제 위치에서 계산됩니다. 두 바늘이 5 (십자선에 제로에서) 표시 편향 경우에는이 예제에서, 와이어 바늘은 제로로 돌아갑니다 동안 GLA그렇다면 SS 바늘이 25 봄 수도, 그것은 철사 바늘 5마르크을 근육이 수축 같은 힘으로 20마르크을 구부 러. 따라서, 두 바늘 사이의 벤딩의 비율은 유리 바늘의 교정을 제공하고있다 ¼ 와이어 바늘처럼 딱딱한. 섹션 3.4에서 스프링 상수를 계산 그들은 확대 또는 십자선 부문 크기와는 무관합니다 거리의 비율을 사용하므로. 유일한 제한 고려 deflections은 바늘의 선형 탄성 범위에있을 정도로 작은 것입니다.
- 십자선에 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 마르크의 위치에 deflections 일련의 마십시오. 어떤 deflections가 릴리스하는 경우 조기 이러한 단계를 반복합니다. deflections 사이에 제로 정렬 와이어 바늘을 유지. 이러한 deflections 각각에 대해 편향 금액 및 출시된 이후 유리 바늘의 최종 제로로드 위치를 확인합니다. 이것은 데이터 포인트의 10 쌍 생성합니다. 다른 시퀀스를 사용할 수 있지만,이 시리즈는 내부 일관성, 선형성 및 히스테리 시스의 초기 징후를 (deflections 5 결과 + 10 = 15 제공하도록 설계되었습니다, 3 7 = 10; 출시된 이후 5,10,15 deflections가 있어야 약 시작과 끝)에서 동일한.
- 섹션 3.3 기록된 deflections의 선형 회귀 하나의 편향 비율보다 중간 유리 바늘의 굽힘 상수보다 정확한 부량를 제공합니다. 또한 0으로 회귀 선의 절편의 높은 R 가치와 친밀감에 표시된 보정의 바늘과 품질의 선형성의 평가를 제공합니다. 회귀에 대한 섹션 3.3 10 데이터 쌍을 준비하려면, 기록된 쌍 두 번째 번호, 출시된 이후 유리 바늘의 최종 제로 부하 위치의 첫 번째 숫자는 그것 빼는 해당 초기 편향을해야합니다 쌍. 일단이 작업은 새로운 숫자 쌍 세트는 초기 편향 이루어져 수행하고 해당 차이가 계산됩니다. 제로 편향에 대한 제로 강제의 선형 회귀를 앵커로 0,0 이러한 열 실험 데이터 쌍 5 쌍 컨트롤을 추가합니다. 이 절대적으로 필요하지만, 정확도의 추가 학위를 추가하지 않습니다. 0,0에 고정하는 것은 강제가 적용되지 않았을 때 바늘이 구부 러 없다는 원칙을 기반으로합니다. 다음 15 데이터 쌍을 가진 선형 회귀를 계산합니다. 보정되는 유리 바늘의 상수 벤딩 스프링 와이어 바늘은 일정한 굴곡이 회귀 선의 기울기로 나눈 것으로 알려져있다.
4. 작업 유리 바늘을 보정하는 뉴런을 조작하는 데 사용
- 섹션 3에서 설명한대로 뉴런에서 실험적으로 사용되는 충분한 준수 유리 바늘, 2-15 μdynes / μm의는 유사한 방식으로 중간 유리 바늘에 대해 보정됩니다. 즉, 후보 작업 바늘은 제 3의 와이어 바늘의 위치에 배치 알려진 강성의 중간 바늘 비켜. 미만이 μdynes / μm의의 유리 바늘이 약간 적절한 강성 범위에 그들을 가지고 단축 수 있습니다.
5. 바늘은 첨부 파일 요인과 pretreated 아르
- 취급하는 바늘은 바늘만을 끝에이 솔루션에 잠겨 그러한 첨부 파일 팩터 솔루션의 10 ML의 비커 위에 세트 클램프에서 개최 찰흙 덩어리의 측면에 누를 수 있습니다. 그것은 강성을 변경하고 첨부 파일의 바늘의 효능을 lessens 시간 동안 끝에 코팅의 축적을 증가하기 때문에 모세관 샤프트 Immersing하는 것은 바람직하지입니다. 보정 바늘은 약 4 시간을 사용할 수 있으며 정확성에 대해 recalibrated 수 있습니다. 바늘은 30 분 30 분 후 concanavalin (1 MG / PBS에 ML)에 대한 0.1 % polylysine 용액에 순차적으로 감소하고 있습니다. polylysine은 몇 주 동안 반복적으로 사용할 수 있으며 -20 ° C.에 저장됩니다 4 코나 신선한 주간 및 저장소를 만들 ° C. 다른 세포 유형의 바늘을하여 표면에 표시되는 분자 조사의 과정을 직접 수 있습니다.
6. 장비 설정
- 견인 워크 스테이션은 진동 절연 테이블에 설정되어 있습니다. 그것은 무대 위의 왼쪽하고, 그것에 연결된 두 도구 홀더가 삽입되는에, 우리 counterbalanced 사용자 지정 확장을 잡고 유압 조작하는 사람을 따라 막대가 장착되어 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 조작하는 사람의 컨트롤이 자신의 범위를 중심으로하는 동안, 현미경의 조명 경로로의 홀더에 바늘을 넣어, 막대 따라 유압 micromanipulator를 놓습니다. 바늘이 첨부 요소로 취급되고있는 당시 Ringcubator 또는 기타 현미경 스테이지 난방 시스템 설정, 단계는 실험의 시작 부분에 열 평형에하는 것입니다.
7. 바늘을 조심
- 목적은 현미경의 시야에 두 바늘 (참조 및 작업 바늘) 얻을 것은 배열 때문에견인 니들이 접시에 초점에있을 때 그들의 조언 따라서 다소 초점, 문화 접시 위의 참조와 떨어져, 떨어져 약 50 μm의 수 있습니다. 자신의 바늘 소유자의 두 바늘이 작은 micromanipulator 자체 Leica 이중 도구 홀더로 장착할 수 있습니다. 이중 도구 홀더의 미세 조작을 사용하여, 두 팁은 병렬로 정렬로 이동됩니다. 강화 칼라 그것을 손잡이와 이중 공구 홀더의 오른쪽에서이 어셈블리를 게재할 수만큼, 바늘 홀더로 짧은 거리를 참조 바늘을 삽입합니다. 바늘 홀더로 처리 작업 바늘 이분의 일의 길이를 삽입하고 두 도구 홀더의 왼쪽에 놓습니다. 그들은 팁을 함께 매우 가까워지고 방해되지 않도록 두 바늘 팁이 같은 기대 위치로 이동하고 줄지어 때, 그들의 소유자에 바늘의 다른 길이는 체포 서다. 7.4을 통해 섹션 7.2는 확대하지 않고 할 수 있습니다. 제 7.5-7.8는 미세한 관찰하에 이루어집니다.
- 수직 컨트롤이 모든 방법까지되도록 유압 micromanipulator를 미리는 집합. 그들의 범위의 중앙에 다른 컨트롤을 설정하고 또한 도구 소유자의 앞으로 / 뒤로 나사.
- 도구 소유자의 오른쪽에있는 사이드 - 투 - 사이드 조정 나사를 사용하여 함께 두 바늘의 조언을 가져와. 같은 앞으로 위치에 바늘 도움말을 제공할 필요에 따라 다음 두 도구 홀더에서 앞으로 또는 뒤로 바늘 홀더 스스로 밀어. 측면에서 쌍을 검사 및 위 / 아래 같은 비행기에 팁을 가져 나사 오른쪽을 사용합니다. 그 바늘 홀더의 바늘 각도 경우 격차를 닫습니다 도구 홀더에 바늘 홀더를 회전.
- 도구 홀더를 스윙하고 가파르게 그들을 낚시, 대중 매체의 표면 위에 빛의 경로에 조언을 놓으십시오. 당신이 멀리 손을 이동하기 전에 기지에서 공을 공동 나사를 조이십시오.
- 당신이 너무 멀리 내려 그들을 데리고와 휴식을하거나 문화 접시의 바닥에 파편으로 그들을 파울 전에 현미경의 시야에 바늘 팁을 찾아보십시오. 60mm 요리에서 중간의 15 ML는 접시 바닥 위에 안전 마진에 대한 충분한 깊이를 제공합니다. 이 단계의 느낌을 얻을 수있는 uncalibrated 바늘로 초기 연습 마십시오. a10x 목적으로 접시의 바닥에있는 세포가 이상 상승 초점을 맞춤으로써 시작합니다. 멀리 가벼운 민감하거나 모범적인 실험 세포에서 요리의 영역에서이 작업을 수행합니다. 미디어에 바늘을 낮춥니다. 자신의 그림자를 찾는쪽으로 바늘 사이드를 이동합니다. 당신이 그들을 볼 수 없다면, 그들에게 약간을 절감하고 접시에 앞으로 그들을 이동 측면 전달하는 측면을 반복합니다. 뒤로 이동 (또는 전달) 및 아래로, 팁을 찾아보십시오.
- 당신이 발견하는 바늘 볼 수있는 측면 - 투 - 사이드 나사를 돌립니다. 그것이 당신이 참조 바늘에서 찾고있는 나사와 함께 이동하는 경우가되지 않는 경우는 보정 바늘. 보정 바늘, 그 방면 참조 바늘을 밀어 측면 나사에 측면을 사용합니다. 앞으로 그것을 이동하고 다시 참조의 그림자를 찾고. 당신이 찾았 참조 바늘 경우 보정 바늘을 찾는 오른쪽으로 유압을 이동하면서 왼쪽으로 나사.
- 두 바늘이있는 때 그들을 라인 더블 도구 소유자의 좋은 컨트롤을 사용합니다. 접시의 가장자리오고 바늘의 가파른 각도가 아래로 상향 조정 및 단축하기 위해 구성 요소를 연장도 앞으로를 위해 위 / 아래 컨트롤을 발생합니다. 왼쪽, 앞으로 / 뒤로 스크류 컨트롤 팁의 위치를 양육하면서 바늘을 철회, 아래 그릇에 또한 앞으로 팁을입니다 밀고 다시 끄는, 반대 수 있습니다. 따라서, 참조를 제기하고 눈금 바늘을 전진하면 접시 위에 높이의 최적의 관계로 그들을 잡는 동안에도 끝을을 만들어 모두를 길게합니다. 참조 바늘은 훨씬 작업 바늘 초과하는 경우 당신은 할 수 있겠지 / 참조를 스윙하고 두도하고 작업 바늘이 낮은 때까지 그것을 단축하면서 아래와 앞으로 작업 바늘을 밀어. 시간에 나사 범위가 함께 바늘을 가지고하지 않습니다, 그래서 당신은, 부드럽게 홀더 스스로를 슬라이드하는 데 필요한 공이 공동 나사가 잘 강화 있는지 확인하고이 슬라이드에 힘을 적용하는 도구 홀더의 가장자리에 대한 쐐기 손가락을 사용할 수 있습니다 샤프트. 당신은 또한 그들이 가까이 함께 받고있다면보고, 동시에 최대 미디어와 효과를 관찰, 이전과 도구 홀더에 바늘 홀더를 회전 수 있습니다.
- 이 최종 조정 위치의 이미지를 기록, 어떠한 강제 적용하지 않고 바늘의 분리는 제로 기준 거리입니다. 시야의 가장자리에서 표본의 비행기와 '공원'그들 위에 바늘을 올려.
- 바늘에 파편이 초승달 모양으로 그것을 양육하여 제거할 수 있습니다. 우선 서로에 래치 두 도움말을 피하기 위해 멀리 다른 바늘에서 참조 바늘을 이동합니다. 다중 패스가 필요할 수 있습니다. </ 올>
- 이 시점하려면, 바늘은 현미경을 통해 직접 관찰되었습니다. 세포 부착으로 시작, 관찰은 현미경 통해 비디오 화면에 모두 이루어집니다. 모두의 오른쪽 / 왼쪽 측면은 동일하지만, 비디오 화면에서 이미지의 위 / 아래 방향은 현미경에 위아래 (중력)과 동일하지 않습니다. 현미경을 통해 직접 관찰과 같은 영상 화면 관찰로 위 / 아래 방향의 차이점을 명확히하기 위해, 후자는 따옴표에 '최대'및 '다운'즉라고도합니다
- 견인 과정은 비디오 화면에서 왼쪽에서 오른쪽으로 ( '가로')에 두 바늘의 위치를 변경하여 이루어집니다. 따라서, 실험 축삭의 선택은 같은 '가로'방향으로 확장 축삭의 부분에 이루어집니다. 이것은 섹션 8.5의 '추진'책략에 의해 보상됩니다로서 축삭은만큼 15 °에서 '수평'에서 '아래'를 벗어나다 수 있습니다. 또한, 조작을 위해 선택한 축삭은 적극적인 성장 원뿔과 세포 신체의 길이 또는 그 이상해야합니다. 세포 본문의 오른쪽에있는 연장 Axons 인해 참조 바늘의 왼쪽에 장착 작업 바늘로 이중 공구 홀더의 설정, 견인 동안 같은 것을 적용 긴장이 두 바늘 사이의 간격을 widens을 선호하고 있습니다.
- 세포 본문의 왼쪽에있는 확장 프라임 축삭은 바늘 사이의 격차를 확대하고 기준 바늘 좀 들었을 뿐이라고 의해 설정된 두 도구 홀더 reorienting없이 견인하실 수 있습니다. 이것은 견인 바늘 더 많은 공간을 참조 향해 플렉스하고 필요한 경우 아래에 전달할 수 있습니다. 견인 다음 왼쪽으로 진행되며 견인 바늘은 긴장의 증가로 참조 바늘 방향으로 구부 것입니다. 데이터를 분석하면 참조 거리로 긴장 관계에있는이 변경은 제로 참조 거리 대신 측정에서 제로 거리에서 바늘을 분리 측정을 빼서하여 스프레드 시트에 입력됩니다.
- 축삭의 성장 원추에 가까운 바늘을 이동, 다시 제로 거리를 기록 바늘을 인상하고, 진동 절연 테이블 최대 공기.
- 간단히 발전 성장 원뿔 앞에서 작업 바늘을 가하고하면 성장 콘 진보로 자발적인 첨부 파일을 생성합니다. 프로 - 적극적으로 성장 원추에 첨부 파일을 조작하려면, 접시 바닥에 대한 낮은 주사 후 '아래의'성장 콘을 견인 바늘을 아래로 자리합니다. 이것은 바늘이 벤딩과 성장 원추에 접시를 함께 미끄럼 그것을 dislodging과 '상승'그것을 이동 '을'비켜하게됩니다. 충분히 그래서 성장 원추가 바늘 끝 주위 후크 그 접시 바닥으로부터 바늘을 눌러 아니지만 지금까지 그것은 바늘과 역방향 슬라이드 이상 실수할 것을. 그립이 설립 될 수 있도록 20 분이 걸립니다. 경험을 바탕으로, 성공률 90 %만큼 높은 수 있지만 75 % 범위에서 더 일반적이다. 처음에는 성공률이 25 % 가까이있을 수 있습니다. 성장 원뿔 '을 조작을 통해'시작가되면 기본 함정. '추진 단계'의 초기 상호 작용을 몇 초 정도 걸립니다. 성장 원뿔은 다음 회사의 첨부 파일을 양식에 혼자 있어야합니다. 그런 인내는 다음 단계 기간 동안 행사해야합니다.
- 성장 원추가 바늘에되면, 오른쪽에있는 바늘을 이동하여 그 위에 약간의 긴장을 넣어 바늘을 조금 올립니다. 바늘이 제기하면서 앞으로 조금 바늘을 이동하여 '아래'를 이동 보상. 당신이 바늘에서와 접시의 표면 위에 수직 확장 첨부된 과정을 때까지 단계에 올립니다. 바늘 견인이 시작되면이 즉, 그래서 유일한 적용 힘 벡터는 축삭의 축을 따라 즉, 정확한 힘 측정에 필요한 확장 축삭의 수직 배치. 떨어진 바늘에서 견인 프로세스 각도 경우, 강제의 벡터가 아니라 바늘을 굽힘 및 전체 힘을 측정하지보다 바늘의 축을 따라 탄생입니다. 초기 접시 첨부 파일의 현장에서 도망 치고하면 바늘에 지속적인 애착의 전망을 향상시킵니다. 팁은 접시의 표면 (그릇에서 작은 진동이나 초점의 다른 비행기에서 본) 이상 또는 최소 강제로 만질 수 있습니다. 너무 표면 것입니다 스큐 측정에서 드래그합니다. 접시, 또는 기판에 reattaching 셀 프로세스를 지키는 바늘이 당신이 그것을 이동하려고 계속하면 갑자기 첨부 가능한 손실 '느슨한 팝'하는, 로딩 강제로 이어질 것입니다. 이러한 고집 지점에서 바늘을 무료로 대신 더 많은 힘을 (오른쪽) 추가 (화면의 비행기에서 '최대'와 '아래') 뒤로 앞으로 바늘을 이동합니다.
- 견인이 떨어진 세포 본체에서 바늘을 이동하여 강제로 작은 단위를 적용하여 수행됩니다. 미군은 obser 아르바늘 사이의 간격 증가로 ved. 점차 긴장을 증가하는 동안, 조심스럽게 바늘에서 성장 원추의 손상 징후가 관찰합니다.
- 성장 원추가 분리 빠르게 retracting되지 않은 경우, 약간의 긴장을 감소하고 기다리면, 종종 성장 원추는 '합류하고 다시 팁 잡아요. 축삭은 바늘은 바늘과 요리에 대해 그것을 트래핑 및 반복하여 retracts 전에 잡을에서 온다면 '추진'또는 그것에 약간의 긴장을 넣고 다시 첨부 파일에 대한 약 10 분 정도 기다 리 '풀다운' . 두 번의 실연 시도 후, 우리는 다른 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
- 초기 깊이를 나타내기 위해 접시의 측면에 표시를 사용하여 균형을 맞출 증발에 매시간 물을 추가하여 접시에있는 미디어 수준을 유지합니다. 긴 파스퇴르 피펫으로 서서히 바늘 접시의 측면에서 물을 추가합니다. 종종 프로세스 '노점'미디어가 hyperosmotic되는 경우 연장. 증발은 미디어 표면에 오일 코팅 줄어들 수 있지만, 이것은 바늘이 미디어 후 추가하는 것입니다. 바늘이 기름 통과하면, 성장 원추가 훨씬 적은 바늘에 연결 가능성이 높습니다.
- 실험의 끝에, 당신이 접시, 다시 확인의 제로 거리를 바늘을 올려 전에.
- 화면에 수평 축, 세포 본체와 기록 시간의 위치 따라 바늘의 위치를 참조하십시오. 바늘 빼기 바늘 휨 상수 곱한 언로 드 제로 거리의 분리 거리가 적용되는 강제의 μdynes 같습니다. 무대 마이크로 미터를 사용하여 화면 이미지의 거리를 보정합니다.
- 매우 중요한 품질 데이터에 대한 참조 거리 (영 힘) 바늘 사이의 분리를 보장합니다는 실험 기간 동안 변경되지 않습니다. 열 변경 마이크론 규모의 장비에 영향을 미칠 것이다, 즉 실험 동안 에어컨을 켜지 마십시오. 당신의 현미경 난방 시스템 지연 시간이있다면 당신은 온도 안정성을 때까지 또 기다립니다. Ringcubator는 지연 시간을 감소하고 또한 현미경 및 열 제로의 표류와 초점의 변화 떨어지면서 조작 시스템의 나머지 부분에서 접시의 열 변화를 분리합니다. 바늘의 언로 드 분리를 변경 또 다른 힘은 바늘 샤프트의 표면 장력이다. 부하는 접시에 액체의 깊이로 변경됩니다. 바늘을 백업하여 참조 거리를 확인하고 일시적으로 당신이 분리의 변화를 지적하더라도, 실험 기간 동안 가끔 노 강제 제로 거리는 데이터의 품질을 향상 표시됩니다.
8. 세포에 부착
9. 축삭 또는 셀 프로세스를 확장
10. 데이터 분석
11. 대표 결과 :
강제 조정 가벼운 현미경에 의해 직접 시각으로 유리 바늘 쉽게, 보통 성장 원추 모든 셀룰러 지역에 적용할 수 있습니다. 세포 첨부 파일을 얻기 위해 바늘의 적절한 치료와 기계적 장력은 실험적으로 관심의 세포 영역에 적용할 수있는, 또는 지역별로 생산되는 세력을 측정할 수 있습니다. 대표의 연결을 견인 실험은 견인 축삭이 두 시간의 길이는 두 배로되어 그림 1에 표시됩니다.
그림은 1. 견인을위한 기본 방향과 교양 닭고기 등의 루트 신경절 세포가 선택됩니다. 실험 조작이 시작 (A) 전에 바늘 사이의 초기 제로 기준 거리가 기록됩니다. '푸시 최대'책략은 성장 원추 (B)에 적용됩니다. 견인은 바늘 (C)의 분리에 표시된 증가 강제 로딩과 함께 시작됩니다. 견인이 축삭을 확장했다 견인 축삭과 작업 바늘의 '가로'와 수직 정렬 좋은 힘 측정 (D)을 촉진합니다. 바 = 40 μm의. 니들 교정 = 6.9 μdyne / μm의.
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Discussion
세포 세력을 적용하고 측정하는 기술은 오랜 역사 9 있습니다. 우리의 방법은 원래 전동 유압 장치 10 사용하여 일정한 속도로 '견인'뉴런으로 우리와 유사한 유리 바늘을 사용 데니스 브레이의 작품 동기했다. 스테퍼 모터 11, 자석 구슬 12, microfabricated 대들보 13, 유체 흐름 14 : 포함 세포 세력을 적용 다양한 대체 수단이 있습니다. 세포 탐침이 궁극적으로 알려진 강성의 굽힘 빔에 대해 보정한다는 점에서 후자는 우리의 접근 방식과 유사하며 세포 측정 광학 현미경 관찰에 따라 달라집니다. 다른 방법에 비해, 우리의 방법 3의 주요 장점은 동시에 생명 과학학과의 전형적인 장비 (현미경 및 micromanipulators)를 사용하여 μdyne 범위에서 세력을 적용하고 평가할 수있는 능력입니다.
이러한 방법을 사용의 연결을 성장 콘에 의해 끼쳤다 세력 그들은 사전에 15 분 측정 되었기 때문입니다. 긴장에 대응 axonal 신장 속도의 기계적 관계 뉴턴 유체 같은 자극 - 반응 관계 7 따라 결정되었습니다. 긴장에 대응 axons의 상대 감도는 닭 배아 2 말초 신경에 비해 중앙 두뇌 뉴런에 더 큰 것으로 표시되었습니다. axons의 철회는 7 조사되었습니다. 없이 결정 axons과 뉴런은 기계적 장력 5 응용 프로그램에 의해 제어되는 그들의 axonal / 돌기 극성을 할 수 있습니다. GFP - 라벨 굴지 또는 tubulin을 표현 섬유아 세포에서, 우리는 직접뿐만 아니라 바늘 긴장 8 변화에의 대응의 간단한 부착으로 cytoskeleton의 응답을 시각. 셀 서로 첨부 파일 또는 기판은 1 테스트되었습니다. 운동성이있는 세포의 추진력 세력은 검사 수와 접근 filipodia의 당기는 16를 측정 수 있습니다. 견인 axons 이내에 라벨이 mitochondria에 의해 표시되는 동작은 모델 내부 자료 전송 (저속 전송)에 사용되며 뉴런은 axonal 축 6,17의 길이를 따라 intercalated 대량 추가로 성장할 것으로 판단되었습니다.
단순히 그들을 측정하지 않고 세력을 적용에 관심이 조사관은 참조 바늘의 사용이 18 필요하지 않습니다. 힘 측정을 원하는 경우에는 반대로, 참조 바늘이 정확한 데이터를 생성하는 것이 필수적입니다. 전반적으로, 우리는 데이터를 읽는 과정에서 발생하는 오류의 가장 큰 소스와 5 % 10 % 범위에 있어야 절대 강제 측정에 오류가 예상됩니다. 어려움이 정확 defocused 참조 바늘의 위치를 파악하고 작은 뒤로 바늘의 앞뒤 움직임 (진동)의 영향을 최소화하고 있습니다. 참고 바늘없이 오류가 이러한 소스도 큰 것입니다.
실험 조작은 견인 세션 끝이 필요가 없습니다. 견인 성장 원뿔는 다른 세포에 첨부하거나 접시 5 reattached 수 있습니다. 이 조작 기회를 사용의 연결을 마이크로 circutry은 의도적으로 검사하는 다른 세포 유형의 상호 대화를 허용, 구성 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이이 방법론의 개발에 박사 로버트 E. Buxbaum의 중요한 기여를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
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