Summary
2000-1000 microdyne aralığında nöronların kuvvet uygulanması ve doğrudan ölçümler kalibre cam iğneler kullanılarak yüksek hassasiyet ile elde edilir. Bu metodoloji aksonal başlatılması, aksonal gerginlik, aksonal uzama hızı, ve kuvvet vektörleri aksonal geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli yönleri, kontrol etmek ve ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Nöron aksonları Hücre ve uzatma manipülasyonlar, mikro-fiberler 10-1000 μdyne aralığı 1,2 güçlerini ölçme ve uygulama yeteneğine sahip kalibre cam ile yapılabilir . Force ölçümler doğrudan ve deneysel yöntem 3 kalibre cam iğneler, bükme Hookean gözlem yoluyla elde edilir. Imalatı, kalibrasyon, tedavi, ve hücreler üzerinde iğneler kullanarak için donatım gereksinimleri ve prosedürleri tam olarak açıklanmıştır. Kuvvet, bu tekniklerin, metodoloji esneklik göstermek uygulanan ve gelecekteki çalışmalar için 4-6 örnek olarak verilmiştir hangi daha önce kullanılan ve farklı hücre tipleri rejimleri. Teknik avantajları manipülasyonlar tarafından üretilen güçlerin sürekli 'görselleştirme ve hücresel olayların çeşitli doğrudan müdahale etme yeteneği vardır. Dekolmanı ve yanı sıra, herhangi bir tür kültür hücre 8 mekanik ölçümler Bu doğrudan uyarılması ve aksonal büyüme ve retraksiyon 7 düzenlenmesi .
Protocol
1. Cam iğne yapma.
- Ayarlanabilir bir mikro iğne çektirmenin katı kirişler kapalı 4 mm uzunlukta ve yaklaşık bir sivri ucu ile iğne imal etmek için kullanılır. Uzun bir esnek ucu aksine, bu kısa 4 mm uzunluğunda, deneyler sırasında iğne ucu titreşimleri sınırlar. 4 mm fiber proksimal bölgede fiber en distal 1 mm çapında 2.5 mm iken, iğne, cam tüp içinde 15 mikron 1 mm çapına hızla tapers. Biz R-6 cam kapiller tüp, OD 0.9 mm, ID 0,6 mm 8 "uzunluğunda ve BB-CH çektirmesi kullanın. Araştırmacı farklı yay özellikleri (yani farklı uzunlukta ve diğer kuvvet aralıkları, iğne ölçme ilgi kalınlık) çekilmelidir. Her dört 2 "iğne kapiller tüp içine çeker. İğneler içine iğne hafifçe basıldığında iki kil modelleme 'yılan' ile 160 mm Petri kapları kapalı tutulur.
- Yanı sıra cam iğneler, tarif edilebilir bir tel iğne, aslında istenilen güç ölçümleri için uygun sertlik, bükme yayları olarak kullanılan kirişler. Unutmayın ne olursa olsun kompozisyon uzunluğu küp olarak bir ışın ölçeklerin bükme kuvveti,. Böylece, herhangi biri için, aşağıda açıklanan kalibrasyon adımları, bir iğne yeterli sertlik / kiriş, küçük bir miktar kısaltılması (örneğin% 10 kısalma sertliği% 28 artış, yani 0.9 3 üretir) tarafından sert yapılmış olabilir.
2. Bir tel iğne yapma ve kalibrasyon
- Bir tel kalibrasyon iğne ucu kırık cam bir iğnenin içinde (bölüm 1.1 yapılan) ile 0.001 ", krom tel takarak olun. Uzunluğu 26 mm ve tutkal o yerde ucu tel çekin süper yapıştırıcı bir kanca tel 1 mm distalinden bükün.
- Mikro-ağırlıkları 0.003 "constantan tel 1 metre ile 1 metre tel tel, düz mümkün almak yardımcı olmak için bir metre sopa bant ölçmek tartılır, doğru 1 cm adet kesme, ve viraj Vs içine birkaç adet
- Tel iğne Kalibre bir ölçüm dürbün ağı ve bir mikromanipülatör ile diseksiyon mikroskobu gerektirir. Mikroskop kullanarak kendi tarafında tel iğne Çökmelerin görülebilir böyle evrensel bir patlama standı, 90 ° açı yapar. Bölüm 2.1 tel iğne bağladım bölgede mikroskop optik eksene dik olduğunu, böyle bir mikromanipülatör bir araç sahibi içine monte edin. Retikül bir işareti ile tel iğne kanca Hattı. Kanca Hang 1 cm'lik mikro-ağırlık ve saptırma kayıt. Defleksiyonun bölünmesiyle (mikron): (μdynes / mm) referans tel bükme sürekli mikro-ağırlık oranı (1 mg = 0.98 dynes notu) olarak hesaplanır. Bir sonraki adım için tel iğne hazırlamak için, bir bistüri ile tartmak noktada kanca kesti. Kanca varlığı ek ağırlık olduğunu tel küçük bir dereceye kadar virajlı. Böylece ağırlık eklenir önce retikül tel başlangıç konumunu etkiler. Ağırlığı bend noktası (tel gelecek ucu) eklendiğinde, tel yay sabit ölçüm tel sapma elde edilir. Kanca kesilir tel yay sabiti değişmez.
3. Ara cam iğneler Kalibre
- Kalibrasyon ara cam iğneler bir göz retikül ile ters bir mikroskop kullanımını gerektirir. Mikroskop sahne Bir tarafta optik alanının merkezinde bölüm 2 tel iğne tutmak için kullanılan bir mekanik mikromanipülatör. Diğer taraftan kalibre ara cam iğne taşımak için kullanılan bir üç eksenli hidrolik mikromanipülatör (ekipman tabloya bakınız). Mikromanipülatörler kullanarak, 10x bir alanda su x 30 mm Petri kabı 160 mm ~ 45 ° açı optik alanında merkezi hem de iğne bir araya getirmek.
- Iğneler pipet çektirmenin farklı ayarlar ile çekilmiş bir dizi değerlendirme için üretilir. Amaç, 20-30 μdynes / mikron sabit bir bükme yayı ile bir ara cam iğne yapmak. Sertlik tayini, tel iğne saptırma ile karşılaştırıldığında orta iğne sapma oranını ölçerek yapılır. Örneğin, tel ve cam iğneler dokunmadan, cam iğne, tel iğne göz parçaları ile görüldüğü gibi bir mesafe retikül 5 işaretleri saptırmak için taşınır. Cam iğne Hareketli yana iğneler açılana. Tel iğne sonra orijinal başlangıç pozisyonuna geri döner, ama şimdi yeni bir konuma cam iğne olacak. Cam iğne üzerinde yük daha sonra eşit kuvvet yük (her iki iğne yapan) iki iğne pozisyonu eksi yeni kuvvet sıfır konumu hesaplanır. Bu örnekte, her iki iğne 5 (sıfır dürbün ağı) işaretlemek için deflected eğer tel iğne sıfıra dönecektir glaeğer öyleyse ss iğne, 25 yay, tel iğne 5 puan fleksiyondayken aynı güçle 20 işaretleri eğildi. Bu nedenle, iki iğne arasında bükme oranı cam iğne kalibrasyon verir ve bu ¼ tel iğne gibi sert. Bölüm 3.4 'de yay sabiti hesaplamaları retikül bölünme boyutu büyütme veya bağımsız mesafeler oranları kullanın. Sadece sınırlayıcı göz deplasmanlar iğneler doğrusal elastik aralığında edilebilecek kadar küçük olmasıdır.
- Sapmaların retikül 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 işaretleri pozisyonlarda bir dizi yapın. Herhangi bir deplasmanlar bırakırsanız erken bu tekrarlayın. Deplasmanlar arasında sıfırdan uyumlu tel iğne tutun. Bu sapmaların her biri için, deflected miktarı ve yayımlanmasından sonra cam iğne son sıfır yük konumu unutmayın. Bu veri noktalarını 10 çift oluşturur. Diğer dizileri kullanılan olabilir, ancak, bu serisi, iç tutarlılık, doğrusallık ve histerezis erken işaretler (defleksiyonlar 5 + 10 = 15 vermek için tasarlanmıştır; 3 +7 = 10; yayımlanmasından sonra 5,10,15 deplasmanlar olmalıdır yaklaşık başında ve sonunda) aynı.
- Bölüm 3.3 kaydedilen sapmaların lineer regresyon ara cam iğne bükme sabit tek bir sapma oranına göre daha doğru bir kantifikasyon verir. Ayrıca iğne sıfıra regresyon çizgisinin kesme yüksek r değeri ve yakınlığı ile gösterilir kalibrasyon ve kalite doğrusallık bir değerlendirmesini sağlar. Regresyon için bölüm 3.3 10 veri çiftleri hazırlamak için, kaydedilen çifti ikinci sayısını yayımlanmasından sonra cam iğne son yük sıfır konumu, ilk sayısı çıkarılır ilgili ilk sapma olması gerekir çifti. Bu işlemi yeni bir numara çiftleri ilk sapma oluşur yapılır ve ilgili fark hesaplanır. Sıfır sıfır sapma gücü lineer regresyon demirlemek için bu 10 deneysel veri çiftleri 0,0 5 kontrol çiftleri ekleyin. Bu kesinlikle gereklidir, ancak ekstra bir doğruluk derecesi ekler değildir. 0,0 Demirleme kuvvetin uygulandığı zaman iğnesi eğilerek olduğu ilkesine dayanır. Lineer regresyon bu 15 veri çiftleri ile hesaplar. Kalibre edilen cam iğne sabit bükme yayı tel iğne bükme sürekli bu regresyon çizgisinin eğimi bölünmüş bilinmektedir.
4. Kalibre çalışma cam iğne nöronlar işlemek için kullanılan
- 3. bölümünde açıklandığı gibi, benzer bir şekilde ara cam iğne karşı nöronlar üzerindeki deneysel olarak kullanılmak üzere yeterli uyum cam iğneler, 2-15 μdynes / mm, kalibre edilir. Yani, aday çalışma iğneler bölüm 3 tel iğne pozisyonu yerleştirilir bilinen sertlik bir ara iğne saptırmak. 2'den az μdynes / mm Cam iğneler uygun sertlik aralığı içine getirmek için biraz kısalabilir.
5. İğneler eklenti faktörler ön işlem
- Tedavi edilecek İğneler ek faktör çözümü, çözüm sadece iğne ucu batırılır böyle bir 10 ml beher üstünde bir kelepçe yapılan kil bir yumru tarafına bastırılır. Zaman içinde sertlik değişiklikler ve eki iğne etkinliğini azaltır ucunda kaplama birikimi artar, çünkü kılcal tüp mil içine çeker istenmeyen bir durumdur. Kalibre edilmiş bir iğne sadece yaklaşık 4 kat ve doğruluk için kalibre edilebilir. Iğneler, 30 dakika ve 30 dakika sonra Concanavalin A (1 mg / ml PBS) için% 0.1 polylysine çözüm sırayla daldırılır. Polylysine birkaç hafta boyunca tekrar tekrar kullanılabilir ve -20 ° C'de saklanan 4 CONA taze haftalık ve mağaza olun ° C Diğer hücre türleri için iğne ile, yüzey molekülleri soruşturma yönlendirebilir.
6. Ekipman kurdu
- Bir titreşim izolasyonu masaya çekme çalışma istasyonu kurulur. Bu aşamada yukarıda sol ve ona bağlı çift takım tutucu içine eklenir, bizim karşı özel bir uzantısı tutan hidrolik manipülatör boyunca bar ile donatılmış bir inverted mikroskop oluşur. Manipülatör kontrolleri kendi aralıkları merkezli iken, mikroskop ışık yolu onun tutucu bir iğne koyarak çubuğu boyunca hidrolik mikromanipülatör yerleştirin. Eklenti faktörler iğne ile tedavi edildiği zaman, Ringcubator veya diğer mikroskop aşamalı ısıtma sistemi açmak, sahne, deneylerin başında termal dengeye yer almaktadır.
7. Iğneler hizalama
- Amacı, mikroskop görsel alanda iki iğneler (referans ve çalışma iğne) almak için düzenlenmiş, böyleceçekme iğne çanak odaklanmak olduğunda, bu nedenle bir nevi odak, ipuçları, kültür çanak üzerinde referansı ile ayrı ayrı yaklaşık 50 mikron. Iğnelikler iki iğne, küçük bir mikromanipülatör kendisi Leica çift takım tutucu, içine monte edilmiştir. Çift takım tutucu mikromanipülasyon kullanarak, iki ipuçları paralel hizaya getirilir. Sıkma yaka bu kavrama ve bu derleme çift araç sahibinin sağ tarafında yere yetecek kadar sadece kısa bir mesafe, bir iğne tutucu referans iğne takın. Tedavi edilen çalışma iğne yarım uzunluğu iğne tutucu içine yerleştirin ve çift araç sahibinin sol tarafına yerleştirin. Ipuçlarını bir araya çok yakın bir engel kalmaz iki iğne uçları aynı pozisyonda öne doğru getirdi ve dizilmiş, sahiplerine iğneler farklı uzunluklarda yaka bocalama. 7.2 - 7.4 üzerinden Bölüm büyütme olmaksızın yapılır. Bölüm 7,5-7,8 mikroskobik gözlem altında yapılır.
- Dikey kumanda tüm yolu böylece hidrolik mikromanipülatör Pre-set. Kapsama alanının merkezine diğer denetimleri ayarlayın, hem de araç sahibinin ileri / geri vida.
- Araç sahibinin sağ tarafında yan-yan ayar vidası kullanarak iki iğne ipuçları bir araya getirin. Sonra aynı pozisyonda öne doğru iğne uçları getirmek için gerektiği gibi çift takım tutucu ileri veya geri iğnelikler kendilerini itin. Yan çifti inceleyin ve sağ tarafında yukarı / aşağı, aynı düzlem içine ipuçları getirmek için vida kullanın. Iğne, iğne tutucu bir iğne açıları eğer açığını kapatmak için takım tutucu sahipleri döndürün.
- Swing ve araç sahibinin dik onları aşağı olta balıkçılığı, medya yüzeyinden ışık yolu ipuçları. Uzakta elinizi taşımadan önce dibinde topu eklem vidayı sıkın.
- Bunları aşağı çok getirmek ve kırmak onları veya kültür çanak alt enkaz onları kötü önce mikroskop görsel alanda iğne ipuçlarını bulun. 60 mm çanak çanak alt üstünde bir emniyet payı için, 15 ml orta, yeterli derinliği sağlar. Bu adımın hissetmek için kalibre edilmemiş bir iğne ile bir ilk uygulama yapın. A10x amacı ile çanak alt hücreleri üzerinde yukarı doğru odaklanarak başlayın. Çanak, ışığa duyarlı ya da örnek deneysel hücrelerin uzak bir alanda bunu yapın. Medya iğneler indirin. Onların gölgesinde arayan iğneleri yan tarafına doğru hareket ettirin. Onları görmek istemiyorsanız, onları biraz daha düşük ve çanak ileri hareket, yan yan geçmek tekrar. Geriye doğru hareket (veya ileri) ve aşağı ucu bulun.
- Bulundu hangi iğne görmek için yan-yan vida açın. , Referans iğne arıyoruz vida ile hareket etmezse kalibre iğne bulunuyor. Kalibre iğne için referans iğne, doğru itmek için yan tarafında vida kullanın. Ileri geri hareket ettirin ve referans gölge arıyor. Bulduğum referans iğne kalibre iğne arıyoruz sağ hidrolik hareket ederken, sola doğru vida.
- Her iki iğne bulunan çift araç sahibinin bunları hizaya ince denetimlerini kullanın. Yemeğin kenarına gelen iğneleri dik açı aşağı yukarı ayarlama ve bir kısalma bileşeni uzatma, aynı zamanda bir ileri, yukarı / aşağı kontrol neden olur. Sol tarafında, ileri / geri vida kontrolü iğne ucu konumunu yükselterek çekilmesi, aşağı çanak içine de ileri ucu iterek geri çekerek, bunun tam tersi vardır. Bu nedenle, referans kalibre iğne yükseltme ve ileriye iterek, çanak üzerindeki yüksekliklerde optimal bir ilişki içine getirerek ucunda bile bunları yapmak için de uzatacaktır. Referans iğne çalışma iğnesi çok ötesine uzanan Eğer vida / referans aşağı sallanan ve iki hatta ve çalışma iğne alt kadar kısaltılması ise çalışma iğne aşağı ve ileri itin. Zamanlarda vida aralığı iğne bir araya getirmek değil, bu yüzden hafifçe sahipleri kendilerini slayt, topu eklem vida iyi sıkıldığından emin olun ve slayt araç sahibinin kenarına sıkışmış kuvvet uygulamak için parmaklarınızı kullanın miller. Ayrıca birbirine yaklaştırır görmesini, medya ve etkisini gözlemleyerek, daha önce olduğu gibi takım tutucu iğnelikler döndürmek olabilir.
- Bu son düzeltilmiş pozisyonda görüntü kaydetme, herhangi bir kuvvet uygulandığında olmadan iğneler mesafeyi sıfır referans mesafedir. Görme alanının kenarında örnek düzlem ve 'parkı' onlar üzerinde iğneler kaldırın.
- Enkaz bir iğne aracılığıyla menisküs yükselterek kaldırılmış olabilir. Önce birbirlerini üzerine kilitlenen iki ipuçları önlemek için referans diğer iğne iğne hareket. Çoklu geçer gerekli olabilir. </ Ol>
- Bu noktaya kadar, iğneler mikroskop aracılığıyla doğrudan gözlenmiştir var. Hücre eki ile başlayarak, gözlemler, mikroskop aracılığıyla ve video ekranı hem yapılacaktır. Hem de sol / sağ yönü aynıdır, fakat video ekranı üzerinde görüntü yukarı / aşağı yukarı ve aşağı yönü mikroskop (yerçekimi) ile aynı değildir. Mikroskop aracılığıyla doğrudan gözlenemeyen ve video ekranda görüldüğü gibi, aşağı / yukarı yönde arasındaki farkları açıklığa kavuşturmak için, ikincisi tırnak içinde 'yukarı' ve 'aşağı' yani olarak adlandırılır.
- Çekme işlemi video ekranda soldan sağa ('yatay') iki iğne pozisyonu değiştirerek yapılır. Sonuç olarak, deneysel akson seçimi aynı 'yatay' yönünde uzanan akson kısmen yapılır. Bu bölüm 8.5 'push up' manevrası ile telafi edilecektir olarak akson kadar 15 ° 'yatay' 'aşağı' farklı olabilir. Buna ek olarak, aktif bir büyüme konisi ile manipülasyon için seçilen akson, bir hücre gövdesi uzunluğu ya da daha fazla olmalıdır. Hücre gövdesi sağa uzanan aksonlar nedeniyle referans iğne sol monte çalışma iğne ile çift araç sahibinin kurmak, çekme sırasında, uygulanan gerilim iki iğne arasındaki boşluğu genişler tercih edilmektedir.
- Hücre gövdesi sola uzanan bir başbakan akson iğneler arasındaki uçurum giderek büyümektedir ve referans iğne biraz yükselterek tarafından belirlenen çift takım tutucu yeniden yön olmadan çekilebilir. Bu çekme iğne daha fazla alan referans doğru esnetin ve gerekirse bunun altından geçmek sağlar. Çekme sonra sola doğru ilerler ve çekme iğne gerginlik arttıkça referans iğne doğru kıvırın. Verileri analiz ederken referans mesafe gerginlik ilişki bu değişimin sıfır referans mesafe ölçüm yerine sıfır mesafe iğne ayırma ölçümü çıkarılarak tablo girilir.
- Akson büyüme konisi yakın iğneler Taşı, tekrar sıfır mesafe kaydetmek iğneler yükseltmek ve titreşim izolasyonu masa hava.
- Sadece çalışma iğne koyarak ilerleyen bir büyüme konisi önünde büyüme konisinin ilerledikçe kendiliğinden eki üretebilir. Pro-aktif büyüme konisinin bir ek işlemek için çanak alt karşı düşük iğne daha sonra 'aşağıdan' büyüme konisi çekme iğne aşağı yerleştirin ve. Bu iğne bükme ve büyüme konisinin içine çanak üzerinde hareket, onu yerinden oynatmamaya ve yukarı doğru hareket, '' saptırmak için neden olacaktır. Yeterli büyüme konisi, iğne ucu etrafında kanca çanak dibine iğne basın, ancak şimdiye kadar iğne ve geriye slaytlar üzerinde kayıyor. Kurulmuş bir kavrama olmak için 20 dakika bekleyin. Tecrübesi ile başarı oranı% 90 gibi yüksek olabilir, ancak daha tipik olarak% 75 aralığında. İlk başta başarı oranı% 25'e yakın olabilir. Büyüme konisi 'manipüle' over başına zaman birincil bir hatadır. 'Push up adım' ilk etkileşim birkaç saniye sürer. Büyüme konisi sonra sağlam bir eklenti oluşturmak için tek başına bırakılmalıdır. Daha sonra aşağıdaki adımları sırasında sabır olunmalıdır.
- Büyüme konisi iğne, iğneler sağa hareket ettirerek üzerinde hafif bir gerginlik koymak ve iğne biraz daha yükseltmek. Iğne yükselterek biraz daha ileri bir iğne hareket 'aşağı' hareketli telafi. Iğne ve çanak yüzeyinden dik uzanan bağlı işlemine kadar kademeli olarak yükseltin. Akson iğneleri çekme başladı sonra yani bu yüzden, doğru kuvvet ölçümleri için gerekli olan tek uygulanan kuvvet vektörü akson ekseni boyunca uzanan dik düzenleme. Eğer iğne uzak çekili süreci açıları iğne iğne bükme ve ölçülen toplam kuvvet değil daha ziyade ekseni boyunca bir vektör, kuvvet doğar. Ilk çanak eki spot uzak iğne kalıcı bir eki umutları artırır. Ucu çanak yüzeyinde (çanak çok az titreşim ya da farklı bir odak düzlemine görülen) üzerinde ya da çok az güç dokunmadan olabilir. Çok fazla yüzey olacak eğrilik ölçümleri sürükleyin. Yemek, ya da hücre süreci Yüzey reattaching yapışmasını iğne taşımak için denemeye devam, sonra aniden kaybı ile eki mümkün 'gevşek' açılan, yükleme zorlamak için yol açacaktır. Böyle bir düğüm noktası iğne serbest bırakmak yerine, daha fazla güç (sağda) ekleme (ekran düzlemde 'up' ve 'aşağı') iğne ileriye taşımak ve.
- Çekme, hücre gövdesi uzak iğne hareket ettirerek güç küçük artışlarla uygulanarak yapılır. Kuvvetleri gözlenirkeniğneler arasında giderek artan bir boşluk olarak ved. Yavaş yavaş gerginliği artırırken, iğne büyüme konisinin dekolmanı herhangi bir işaret için dikkatlice gözlemleyin.
- Büyüme konisi ayrılır ve hızla geri çekilmeden değilse, biraz gerginliği azaltmak ve bekleyin, genellikle büyüme konisi 'yakalamak' ucuna tekrar kapmak. Akson iğne iğne ile çanak karşı yakalama ve tekrarlayarak bu geri çekilmeler önce onu yakalamak gelirse 'push up' ya da küçük bir gerginlik koymak ve re-eki için yaklaşık 10 dakika bekleyin 'aşağı çekin' . Iki başarısız denemeden sonra, biz farklı bir hücre kullanmanızı öneririz.
- Çanak çanak tarafında ilk derinliğini göstermek için bir işareti kullanarak dengelemeye buharlaşma saatlik su ekleyerek medya seviyesini korumak. Uzun bir Pasteur pipeti ile, yavaş yavaş iğneler yemeğin kenarındaki su ekleyin. Uzatma genellikle bir süreç 'tezgahları' medya Hiperozmatik hale gelirse. Buharlaşma, medya yüzey üzerinde bir petrol kaplama ile azalmış olabilir, ancak bu iğne medya sonra eklenecek olurdu. Iğne yağı ile geçerse, büyüme konisi çok daha az iğne eklemek için muhtemeldir.
- Bir denemenin sonunda, çanak, gözden geçirmenizde yarar sıfır mesafe iğne dışarı çıkarmadan önce.
- Iğneler, hücre gövdesi ve kayıt süreleri pozisyonu ekranda yatay bir eksen boyunca pozisyonları okuyun. Iğneler eksi iğne için bükme sabiti ile çarpılır boş sıfır mesafe uzaklık uygulanan kuvvet μdynes eşittir. Bir sahne mikrometre kullanarak ekran görüntüsünü mesafeler kalibre edin.
- Kaliteli veri için çok önemli bir referans mesafe (sıfır kuvvet) iğneler arasındaki mesafeyi sağlamak deney sırasında değişmez. Termal değişiklikler mikron ölçekte ekipman etkileyecek, yani bir deney sırasında klima açmak yok. Mikroskop ısıtma sistemi bir gecikme süresi eğer termal kararlılık kadar bekleyin. Ringcubator gecikme süresi azalır ve mikroskop ve termal sıfır sürüklenme ve odak değişiklikleri azalan manipülasyon sistemi geri kalanı da çanak termal değişiklikleri yalıtır. Iğne boş ayrılması değiştirerek başka bir güç, iğne milleri yüzey gerilimi. Yük tabak sıvı derinliği ile değiştirir. Iğneler yedekleyerek referans mesafe kontrol edilmesi ve geçici olarak ayrılması bir değişiklik belirterek olsa bile, bazen bir deney sırasında herhangi bir kuvvet sıfır mesafe veri kalitesini artırır görme.
8. Hücrelere tutunmasını
9 - Akson veya hücre sürecinin uzatılması
10 Veri Analizi
11. Temsilcisi Sonuçlar:
Kuvvet kalibre ışık mikroskobu ile doğrudan görüntülendi cam iğneler kolay, genellikle büyüme konisi, herhangi bir hücresel bölgeye uygulanan olabilir. Uygun tedavi ile hücresel eki elde etmek için iğne, mekanik gerilim deneysel ilgi hücresel bölgeye uygulanabilir, ya da o bölgede üretilen güçleri ölçülebilir. Bir temsilci nöronal çekme deneyi çekili akson iki saat uzunluğunda iki katına olmuştur Şekil 1 de gösterilmiştir.
Şekil 1 çekme için tercih edilen bir yönlendirme ile kültürlü bir tavuk dorsal kök ganglion hücre seçilir . Deneysel manipülasyon başlar (A) önce, iğneler arasındaki ilk sıfır referans mesafe kaydedildi. 'Push up' manevra büyüme konisi (B) uygulanır. Çekme iğneler (C) ayrılması belirtildiği gibi artan güç yüklemesi ile başlar. Çekme akson genişletmiştir çekili akson ve çalışma iğne "yatay ve dikey hizalanmalar iyi kuvvet ölçümleri (D) kolaylaştırmıştır. Bar = 40 mm. İğne kalibrasyon = 6.9 μdyne / mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücresel güçleri uygulamak ve ölçmek için Teknikleri, uzun bir geçmişi 9 var . Bizim yöntemi başlangıçta motorlu hidrolik cihaz 10 ile sabit bir oranda 'çekici' nöron bizimkine benzer cam iğneler kullanılır Dennis Bray, çalışmalarını motive oldu. Step motorlar 11, manyetik boncuk 12, microfabricated kirişler 13 ve akışkanlar 14: dahil hücreleri kuvvetleri uygulayarak birçok alternatif imkan vardır. Hücresel prob sonuçta bilinen sertlik bending beam karşı kalibre olduğunu, ikinci yaklaşıma benzer ve hücresel ölçümler optik mikroskobik gözlemler bağlıdır. Diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bizim yöntem 3 birincil avantajı tipik yaşam bilimleri bölümlerinin donatımı (mikroskoplar ve mikromanipülatörler) kullanarak μdyne çeşitli kuvvetler aynı anda uygulamak ve ölçmek için yeteneğidir .
Nöronal büyüme konileri tarafından uygulanan kuvvetler bu yöntemleri kullanarak, önceden 15 ölçülmüştür gibi. Newton bir akışkan gibi uyaran-yanıt ilişkisi 7 takip gerginlik yanıt aksonal uzama hızı mekanik ilişki tespit edilmiştir. Gerginlik yanıt akson bağıl duyarlılık tavuk embriyo 2 çevre nöronlar için daha merkezi beynin nöron için daha fazla olduğu gösterilmiştir. Akson Retraksiyon 7 incelenmiştir. Belirlenmiş aksonlar Nöronlar mekanik gerilim 5 uygulama tarafından kontrol aksonal / dendritik polarite olabilir. GFP etiketli aktin veya tubulin ifade fibroblastlar, doğrudan hücre iskeletinin iyi iğne gerginlik 8 değişiklikleri cevabı basit ek yanıt görüntülendi. Hücre birbirlerine ek veya substratları 1 test edilmiştir. Hareketli hücreler itici güçleri muayene olabilir ve yaklaşan filipodia çekme 16 ölçülen olabilir. Çekili aksonların içinde etiketli mitokondri tarafından görüntülenen hareketleri model iç malzeme taşıma (düşük hızda taşıma) için kullanılan ve nöronların aksonal şaft 6,17 uzunluğu boyunca ardalanmalı kütle ilavesi ile büyümek olduğunu tespit edilmiştir.
Ölçmeden kuvvetler uygulayarak basitçe ilgilenen araştırmacılar için referans iğne 18 kullanımı gerekli değildir. Kuvvet ölçümleri istendiğinde aksine, referans iğne doğru veri oluşturmak için önemlidir. Genel olarak, biz, mutlak güç ölçümlerinde hata veri okuma sürecinde hata ortaya çıkan en büyük kaynağı ile% 5 ila% 10 aralığında olması tahmin ediyoruz. Zorluk odak dışı referans iğne yerini tam olarak belirlenmesi ve küçük bir sırt ve iğneler ileri hareketleri (titreşim) etkilerinin en aza indirilmesi. Bir referans iğne olmadan, bu hata kaynakları daha büyük olacaktır.
Deneysel manipülasyonlar çekme oturum ile sona gerekmez. Çekili büyüme konileri, diğer hücrelere bağlı veya çanak 5 reattached olabilir . Bu manipülatif fırsatı kullanarak, nöronal mikro-circutry kasıtlı olarak incelenmek üzere farklı hücre türlerine çapraz konuşma sağlayan, yapılandırılmış olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz bu metodolojinin geliştirilmesi Dr. Robert E. Buxbaum önemli katkılar minnetle kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
