Biology

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

Published: July 30, 2007 doi: 10.3791/250

¹Department of Physiology, University of Texas Health Science Center at San Antonio (UTHSCSA)

Summary

סידן הוא שליח בכל מקום במערכת העצבים, חיוני מפעילה שחרור הנוירוטרנסמיטר ושינויים חוזק סינפטי. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת Ca ^{2 +-אינדיקטורים} לתוך מסופי תסיסנית עצב. אנחנו גם מדגימים המצאה של המנגנון הנדרש ולהדגיש נקודות קריטיות להצלחת הטכניקה.

Abstract

סידן משחק תפקידים רבים במערכת העצבים אבל אף מרשים יותר כמו ההדק לשחרור נוירוטרנסמיטר, ואף אחד עמוק יותר כשליח חיוני הפלסטיות הסינפטית התומכת בלמידה ובזיכרון. כדי להמשיך להבהיר את הבסיס המולקולרי של Ca ^{2 +} תלויי מנגנוני הסינפטי, מערכת מודל נדרש כי הוא גם נזיל גנטית נגיש מבחינה פיזיולוגית. תסיסנית melanogaster מספק מודל כזה. במערכת זו, מקודדים גנטית אינדיקטורים פלורסנט זמינים לזהות Ca ^{2 +} שינויים מסופי העצב. עם זאת, אינדיקטורים אלה מוגבל רגישות Ca ^{2 +} ולעתים קרובות להראות תגובה שאינו ליניארי. האינדיקטורים פלורסנט סינתטי מתאימים יותר למדידת Ca מהירה ^{2 +} שינויים הקשורים לפעילות עצבית. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת dextran-מצומדות סינתטי Ca ^{2 +} אינדיקטורים לתוך מסופי העצב לחיות הזחלים תסיסנית. דגש מיוחד מושם על אותם היבטים של פרוטוקול הקריטי ביותר להצלחה של טכניקה, כמו למשל איך להימנע הפרשות חשמל סטטי לאורך עצבים מבודדת, בשמירה על בריאות הכנת בתקופות טעינה ממושכת, והבטחת הישרדות האקסון ידי מתן Ca ^{2 +} כדי לקדם את האיטום של קצות האקסון ניתק. זיקה נמוכה dextran-מצומדות Ca ^{2 +-אינדיקטורים,} כגון fluo-4 ו rhod, זמינים אשר מראים יחס גבוה אות לרעש בזמן מינימלית לשבש presynaptic Ca ^{2 +} דינמיקה. Dextran-נטיה מסייע במניעת Ca ^{2 +} אינדיקטורים להיות מוחרם לתוך אברונים כגון מיטוכונדריה. הטכניקה הטעינה יכול להיות מיושם באופן שווה, הזחלים עוברים ומבוגרים.

Protocol

בחר מנה לנתיחה נקי כי לא נחשף כל fixatives.
לנתח נודד 3 ^rd instar הזחל תסיסנית בינוני של שניידר תסיסנית המכילה Ca ^{2 +} ו-L-גלוטמין, (לא לחתוך שום עצבים או שרירים סיבי נזק מס '7, 6, 13 או 12).
בחר זכוכית מילוי-פיפטה עם טיפ 12 מיקרון (קוטר פנימי).
באמצעות מזרק צינורות (להפעיל לחץ שלילי פיפטה) להבטיח את קצה פיפטה אינו חסום.
בחר פלסטיק דק מילוי-נימה שניתן להוסיף לאורך פיפטה מזכוכית.
צייר ~ 1 ס"מ של 5 מ"מ dextran-מצומדות Ca ^{2 +-אינדיקטור} לתוך חוט הפלסטיק.
חותכים את כל העצבים קטע.
תמיכה פיפטה על הרמפה שיאפשר את קצה פיפטה הגישה קו האמצע הגחון של הזחל גזור.
צייר את הקצוות של עצב קטע מספר 4, בלי לצבוט את העצב, לתוך סוף פיפטה (כולל כמות קטנה של המדיום של שניידר).
הסר את צינורות והכנס את חוט הניילון לתוך פיפטה עד סוף החוט בתוך 50 מיקרון של סוף לחתוך של העצב (אל תיגע עצב).
הוצא מספיק Ca ^{2 +-חיווי} על עצב את הסוף כדי להגביר את עוצמת הקול של המדיום של שניידר על ידי כ -33% (הריכוז הסופי צריך להיות <2 מ"מ). חשוב - זה חייב להסתיים תוך 5 דקות של חיתוך העצב.
מניחים את הכנת בחושך בטמפרטורת החדר בעוד המון עצב.
לאחר 40 דקות להסיר את Ca ^{2 +-אינדיקטור} באמצעות חוט להט.
השאירו את פיפטה במקום ולמלא אותו לחלוטין עם המדיום שניידר טריים, כמו זה ישמש ליישם פולסים מגרה לעצב.
אפשר Ca ^{2 +-אינדיקטור} לאזן בתוך העצב במשך לפחות 60 דקות, אך לא יותר מ 4 שעות, לפני תחילת Ca ^{2 +} הדמיה.
שוטפים את ההכנה עם מדיום חדש של שניידר כל 30 דקות בזמן שהוא equilibrating.
20 דקות לפני הדמיה להחליף בינוני של שניידר עם פתרון No.6 Hemolymph-Like (HL6; מקלאוד et al 2002;. 2003).
L-חומצה גלוטמית או גלוטמט ניתן להוסיף פתרון HL6 ב 7mm כדי להרדים קולטני גלוטמט postsynaptic למנוע העצבים עורר התכווצות שרירים (מקלאוד et al 2004;. רייף et al 2002;. 2005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	G1626