Laddar Drosophila nervterminaler med kalcium indikatorer

Summary

Kalcium är en allestädes närvarande budbärare i nervsystemet som är viktiga för att utlösa frisättningen av neurotransmittorer och förändringar i synaptisk styrka. Här visar vi en teknik för laddning Ca ^{2 +-indikatorer} i Drosophila nervändslut. Vi visar också tillverkningen av de erforderliga apparater och understryka punkter kritiska för tekniken framgång.

Abstract

Kalcium spelar många roller i nervsystemet, men ingen mer imponerande än som utlösare för frisättningen av neurotransmittorer, och ingen djupare än som budbärare viktigt för synaptisk plasticitet som stödjer inlärning och minne. För att ytterligare klarlägga den molekylära grunderna för ^{Ca2 +-beroende} synaptiska mekanismer, är en modell som krävs som är både genetiskt formbar och fysiologiskt tillgängliga. Drosophila melanogaster ger en sådan modell. I detta system, genetiskt kodade fluorescerande indikatorer för att upptäcka Ca ^{2 +} förändringar i nervändslut. Har dock dessa indikatorer begränsad känslighet för Ca ^{2 +} och ofta visar en icke-linjär respons. Syntetiska fluorescerande indikatorer är bättre lämpade för att mäta snabba Ca ^{2 +} förändringar i samband med nerv aktivitet. Här visar vi en teknik för laddning dextran-konjugerade syntetiska Ca ^{2 +} indikatorer till levande nerv terminaler i Drosophila larver. Särskild tonvikt läggs på de aspekter av protokollet mest kritiska till tekniken framgång, exempelvis hur man kan undvika statisk elektricitet utsläpp längs den isolerade nerver, bevara hälsan av preparatet under längre lastning perioder, och se till Axon överlevnad genom att ge Ca ^{2 +} för att främja tätning av avhuggna Axon slut. Låg affinitet dextran-konjugerade ^{Ca2 +-indikatorer,} såsom fluo-4 och Rhod, finns tillgängliga som visar ett högt signal-brus-förhållande medan minimalt störa presynaptiska Ca ^{2 +} dynamik. Dextran-konjugering förhindrar Ca ^{2 +} indikatorer som binds in i organeller som mitokondrier. Lastning teknik kan tillämpas lika på larver, embryon och vuxna.

Protocol

1. Välj en ren dissektion maträtt som inte har varit utsatt för någon fixeringsmedel.
   
   
2. Dissekera en vandrande 3: ^e INSTAR Drosophila larv i Schneiders Drosophila medium som innehåller Ca ^{2 +} och L-glutamin, (skär inte några nerver eller skada muskelfibrer Nos 7, 6, 13 eller 12).
   
   
3. Välj ett glas fyllning-pipett med en 12 micron spets (inre diameter).
   
   
4. Med hjälp av en spruta och slang (för att tillämpa undertryck på pipett) se till att pipettspetsen inte hindras.
   
   
5. Välj en fin plastfyllning-filament som kan sättas ner längden på glaspipett.
   
   
6. Rita ~ 1 cm på 5 mm dextran-konjugerade ^{Ca2 +-indikator} i plasten glödtråden.
   
   
7. Klipp alla segment nerver.
   
   
8. Stöd pipetten på en ramp som gör det möjligt för pipettspetsen att närma sig den ventrala mittlinjen av dissekeras larv.
   
   
9. Rita den avskurna ändan av en nerv att segmentera No.4, utan att klämma nerven, i slutet av pipetten (inkluderar en liten mängd av Schneiders medium).
   
   
10. Ta bort slangen och sätt in plast glödtråden i pipetten till slutet av glödtråden är inom 50 mikron på den kapade ändan av nerven (undvik att röra nerven).
    
    
11. Mata ut tillräckligt ^{Ca2 +-indikator} på nervänden att öka volymen av Schneiders mediet med ca 33% (slutliga koncentrationen ska vara <2mm). Viktigt - Det här måste vara avslutad inom 5 minuter att klippa nerven.
    
    
12. Placera preparatet i mörker vid rumstemperatur medan nerven laster.
    
    
13. Efter 40 minuter bort ^{Ca2 +-indikator} med hjälp av glödtråden.
    
    
14. Låt pipetten på plats och fylla den helt med färska Schneiders medium, eftersom detta kommer att användas för att tillämpa stimulerande pulser till nerven.
    
    
15. Låt Ca ^{2 +-indikatorn} att balansera i nerven i minst 60 minuter, men inte mer än 4 timmar, innan ^{Ca2 +-avbildning.}
    
    
16. Skölj preparatet med färska Schneiders medel var 30 minuter medan den utjämnande.
    
    
17. 20 minuter innan bildhantering ersätta Schneider medium med Hemolymph-Som No.6 lösning (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
    
    
18. L-glutaminsyra eller glutamat kan läggas till HL6 lösning på 7mm att okänsliga postsynaptiska glutamatreceptorer för att förhindra nerv-framkallat muskelkontraktion (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	G1626