Summary
Kalsiyum sinir sistemi her yerde bulunan bir haberci, sinaptik gücü nörotransmitter salınımı ve değişiklikleri tetiklenmesi için gerekli. Burada Ca 2 +-göstergeler Drosophila sinir uçları içine yüklemek için bir teknik göstermektedir. Biz de gerekli aparat imalatı göstermek ve tekniğinin başarısı için kritik noktaları vurgulamak.
Abstract
Kalsiyum sinir sistemi birçok roller oynar ama hiçbiri nörotransmitter serbest bırakılması için tetikleyici olarak daha etkileyici ve sinaptik plastisite, öğrenme ve hafıza destekler için gerekli elçi olarak daha hiçbiri daha derin. Ca 2 moleküler temellerinin daha da aydınlatmak için +-bağımlı sinaptik mekanizmalar, genetik uysal ve fizyolojik olarak erişilebilir bir model sistem olması gereklidir . Drosophila melanogaster böyle bir model sağlar. Bu sistemde, sinir uçlarında Ca 2 + değişiklikleri tespit etmek için genetik olarak kodlanmış floresan göstergeler mevcuttur. Ancak, bu göstergeler Ca 2 duyarlılık sınırlı + ve genellikle doğrusal olmayan bir tepki göstermek. Sentetik floresan göstergeler daha iyi, hızlı bir şekilde Ca 2 + sinir aktivitesi ile ilişkili değişiklikler ölçmek için uygundur. Burada Drosophila larvaları canlı sinir terminallerine dekstran-konjuge sentetik Ca 2 + göstergeleri yükleme için kullanılan bir tekniktir göstermektedir. Özellikle vurgu hazırlık sağlığı devamlılığının uzun yükleme dönemleri sırasında sağlanması bakımından, izole sinirler boyunca statik elektrik deşarjları önlemek için ne gibi, tekniği Kullanıcı başarısı için en kritik protokolün bu yönleri üzerine yerleştirilir, ve Ca 2 sağlayan akson hayatta kalma sağlanması . + kopmuş akson uçlarının sızdırmazlık teşvik. Düşük afiniteli dekstran-konjuge fluo-4 ve rhod + göstergeleri, Ca 2 + dinamikleri presinaptik Ca 2 kesintiye minimal yüksek sinyal-gürültü oranı gösteren mevcuttur. Dekstran-konjugasyon Ca 2 + göstergeleri gibi mitokondri gibi organellerin içinde sekestre önlemeye yardımcı olur. Larvaları, embriyoları ve yetişkinler için eşit yükleme tekniği uygulanabilir.
Protocol
- Herhangi bir fiksatif maruz olmamıştır temiz bir diseksiyon çanak seçin.
- Schneider Drosophila Orta Ca 2 içeren bir gezgin 3. instar Drosophila larva teşrih + ve L-glutamin, (herhangi bir sinir ya da hasar kas lifleri No 7, 6, 13 veya 12 kesmeyin).
- 12 mikron ucu (iç çapı) ile bir bardak doldurma pipet seçin.
- (Pipet negatif basınç uygulamak için) bir şırınga ve tüp kullanarak pipet ucu tıkalı olmadığından emin olun.
- Cam pipet uzunluğu aşağı eklenebilir ince bir plastik dolum filament seçin.
- + Göstergesi plastik filament 5 mM dekstran-konjuge Ca 2 ~ 1 cm çizin.
- Tüm segmenti sinirler kesin.
- Pipet disseke larva ventral orta hat yaklaşım sağlayacak bir rampa üzerinde pipet Destek.
- Pipet sonuna (Schneider ve orta küçük bir miktar dahil), sinir sıkışmasını, No.4 segmentine bir sinir kesik ucuna çizin.
- Filament sonunda (sinir dokunmaktan kaçının) sinir kesme sonu 50 mikron girene kadar tüpünü çıkarın ve plastik filament pipet içine yerleştirin.
- Çıkar yeterli Ca 2 +, yaklaşık% 33 (son konsantrasyonu <2mm olmalıdır) Schneider ortamın ses seviyesini artırmak için biten sinir üzerine göstergesi . Önemli - Bu sinir kesme 5 dakika içinde tamamlanması gerekir.
- Oda sıcaklığında, karanlıkta hazırlık yerleştirin sinir yükler.
- 40 dakika filament kullanarak Ca 2 +-gösterge kaldırdıktan sonra.
- Pipet yerde bırakın ve bu sinir uyarıcı darbeler uygulamak için kullanılan olacak gibi tamamen taze Schneider orta doldurun.
- Ca 2 + göstergesi en az 60 dakika boyunca sinir denge sağlaması için izin verin, ancak en fazla 4 saat, Ca 2 + görüntüleme başlamadan önce.
- Taze Schneider orta her 30 dakikada bir değişikti ise hazırlık durulayın.
- Görüntüleme 20 dakika önce hemolimf-Benzeri No.6 çözüm (Macleod ve ark 2002, 2003 HL6) Schneider orta yerine.
- L-glutamik asit ya da glutamat postsinaptik glutamat reseptörleri duyarsızlaştırmak sinir uyarılmış kas kasılması önlemek için 7mm az HL6 çözüm eklenebilir (Macleod ve ark 2004;. Reiff ve ark 2002, 2005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
