Summary
وتقدم وصفا لطريقة لتوصيف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا. ملف الميتوكوندريا ولدت يوفر أربعة معلمات وظيفة الميتوكوندريا التي يمكن قياسها في تجربة واحدة : القاعدية معدل التنفس ، والتنفس ATP المرتبطة ، تسرب بروتون ، وقدرة احتياطية.
Abstract
وقد أتاح القدرة على قياس وفهم الأيض الخلوي الخلل الميتوكوندريا ، والعلماء في جميع أنحاء العالم لتطوير الأبحاث في فهم دور وظيفة الميتوكوندريا في البدانة ، والسكري ، والشيخوخة والسرطان والقلب والأوعية الدموية وظيفة سلامة السمية.
الأيض الخلوي هو عملية امتصاص الركيزة ، مثل الأوكسجين والجلوكوز والأحماض الدهنية ، والجلوتامين ، وبعد تحويل الطاقة من خلال سلسلة من الأكسدة وردود الفعل للرقابة إنزيمي التخفيض. هذه الخلايا نتيجة التفاعلات الكيميائية الحيوية في إنتاج ATP ، والإفراج عن الحرارة والمشتقات الكيميائية ، مثل اللاكتات وCO 2 في البيئة خارج الخلية.
معرفة ثاقبة الحالة الفسيولوجية للخلايا ، وتغيير للدولة من تلك الخلايا ، ويمكن المكتسبة من خلال قياس نسبة الأوكسجين المستهلكة من قبل الخلايا ، وهو مؤشر للتنفس الميتوكوندريا -- معدل استهلاك الأوكسجين -- أو OCR. توليد الخلايا أيضا من خلال تحلل ATP ، أي : تحويل الجلوكوز لاكتات ومستقلة من الأوكسجين. مثقف في الآبار ، اللاكتات هي المصدر الرئيسي للبروتونات. قياس حامض اللبنيك المنتجة غير مباشر عن طريق البروتونات التي يتم إطلاقها في المتوسط خارج الخلية التي تحيط الخلايا ، والذي يسبب تحمض على المديين المتوسط ويوفر معدل التحمض خارج الخلوي -- أو ECAR.
في هذه التجربة ، هي خلايا المصنف myoblast C2C12 في مناطق ذات كثافة معينة في لوحات فرس البحر ثقافة الخلية. ويتم قياس استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) وخارج الخلية تحمض المعدلات (ECAR) لتحديد معدلات الأساس. ثم يتم التمثيل الغذائي للخلايا بالقلق قبل ثلاثة الإضافات للمركبات مختلفة (على التوالي) التي تحول ملف الطاقة البيولوجية للخلية.
ويستمد هذا الاختبار من التجربة الكلاسيكية لتقييم الميتوكوندريا ويخدم كإطار التي لبناء تجارب أكثر تعقيدا تهدف إلى فهم وظيفة كل من فيزيولوجي والفسيولوجية المرضية من الميتوكوندريا والتنبؤ قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد و / أو الشتائم.
Protocol
في هذه التجربة ، هي خلايا المصنف myoblast C2C12 في مناطق ذات كثافة معينة في لوحات فرس البحر ثقافة الخلية. ويتم قياس استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) وخارج الخلية تحمض المعدلات (ECAR) لتحديد معدلات الأساس.
1. حقن الخلايا
هي عملية الأيض في الخلايا بالقلق قبل ثلاثة الإضافات للمركبات مختلفة (على التوالي) التي تحول ملف الطاقة البيولوجية للخلية. ومجموعة واحدة بمثابة السيطرة ، مع تشغيل وسائل الاعلام وأضاف بأنه "مركبات" السيطرة.
- الحقنة الأولى oligomycin. Oligomycin يثبط تخليق ATP عن طريق منع القناة من بروتون سينسيز فهرنهايت بطولة الجزء (V مجمع). في مجال البحوث الميتوكوندريا ، يتم استخدامه لمنع الدولة 3 (phosphorylating) التنفس. مع الخلايا ، ويمكن استخدامه للتمييز بين نسبة استهلاك O2 المكرسة لتركيب ATP ونسبة استهلاك O2 المطلوبة للتغلب على تسرب بروتون الطبيعي عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية.
- والثاني هو حقن FCCP. FCCP (الكربونيل السيانيد - P - trifluoromethoxyphenylhydrazone) هو ionophore التي هي الناقل أيون المحمول. وهي وكيل لأنه يعطل uncoupling التجميعي للاعبي التنس المحترفين عن طريق نقل أيونات الهيدروجين عبر الغشاء الميتوكوندريا بدلا من قناة بروتون من سينسيز اعبي التنس المحترفين (V مجمع). هذا الانهيار المحتمل للغشاء الميتوكوندريا يؤدي الى استهلاك سريع للطاقة والأوكسجين دون توليد ATP. في هذه الحالة ، سيقوم كل من التعرف الضوئي على الحروف وECAR الزيادة ، بسبب uncoupling OCR ، وكما ECAR الخلايا محاولة للحفاظ على التوازن في مجال الطاقة باستخدام تحلل لتوليد ATP.
ويمكن استخدام العلاج FCCP لحساب "غيار" قدرة الجهاز التنفسي من الخلايا التي يتم تعريفها على أنها الفرق بين الكمية القصوى غير المنضبط OCR التعرف الضوئي على الحروف الأولية والقاعدية. وقد اقترح أن المحافظة على القدرات التنفسية بعض الغيار حتى في ظل ظروف القصوى التحفيز الفيزيولوجية المرضية في جسم المريض ، أو هو أحد العوامل الرئيسية التي تحدد حيوية و / أو البقاء على قيد الحياة من الخلايا. قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد في ظل ظروف من زيادة الطلب على الطاقة هو في جزء كبير تتأثر قدرة الطاقة البيولوجية من الميتوكوندريا. هذه القدرة هي ردع الطاقة البيولوجية ، الذي تستخرجه عدة عوامل ، بما في ذلك قدرة الخلايا على توفير الركيزة إلى الميتوكوندريا والقدرة الفنية للأنزيمات تشارك في نقل الإلكترون - في حقن الثالثة ، يضاف روتينون ، مثبط أنا المعقدة ، إلى الخلايا. هذا وسوف تغلق التنفس الميتوكوندريا وتمكين كل من الكسور الميتوكوندريا الميتوكوندريا وعدم المساهمة في التنفس يتم حسابها. وسوف نلاحظ واحدة انخفاضا في OCR بسبب ضعف وظيفة الميتوكوندريا ، مع ما يصاحب ذلك زيادة في ECAR باعتبارها الخلية تتحول إلى حالة أكثر في حال السكر من أجل الحفاظ على التوازن في مجال الطاقة
روتينون الميتوكوندريا هو المانع الذي يحول دون انتقال الإلكترونات من وسط الحديد - S في مجمع يوبيكوينون الأول (الإنزيم س). هذا تثبيط مجمع ابن يمنع الطاقة الكامنة في NADH من تحويلها الى طاقة قابلة للاستخدام في شكل ATP.
2. الكواشف والمواد
- Oligomycin ، FCCP ، والحلول روتنون (فرس البحر اختبار الإجهاد ميتو كيت)
- DMEM تشغيل الوسائط (فرس البحر # 100965-000)
- DMSO (سيغما D8418)
- الماء المقطر (Gibco 15230-170)
- معايرة العازلة (فرس البحر العلوم البيولوجية)
3. نمو متوسطة
- 500 مل DMEM (Gibco 11965-092)
- 10 ٪ FBS (Hyclone SH90070.03)
- 5 مل بنسلفانيا / بكتيريا (Gibco 15140-122)
- 5 مل البيروفات الصوديوم (سيغما S8636)
- 5 مل Glutamax (Gibco 35050-061)
4. بذر البروتوكول
- هي المصنفة الخلايا في خلية XF96 الثقافات مع لوحات 10000 خلية / ميكرولتر جيدا في 100 متوسطة النمو وضعت في الحاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 10 ٪ 2.
- وسوف تلتزم الخلايا إلى لوحة خلية ثقافة XF96 في حدود 1 ساعة.
- مقايسة الخلايا في ال 24 ساعة XF96 بعد البذر.
5. إعداد قالب الفحص
- الفحص باستخدام معالج (الملحق الأول) ، إنشاء قالب مع تخطيط المجموعة التالية :
الشكل 1. تخطيط الشبكة حسنا تحديد العمود ومجموعة تعيينات
6. مجمع التحضير
- اعداد المركبات التالية في الفحص XF DMEM الإعلام على النحو التالي :
10 Oligomycin UM ، UM FCCP 30.0 ، 20.0 روتنون ميكرومتر ،
وتمثل هذه التركيزات التخفيف 10X أنه سيتم بذل عندما يتم حقن هذه المركبات في البئر. تركيزات العمل هي :
1 Oligomycin UM ، 3.0 أوقية FCCP ، 2.0 ميكرومتر روتنون
7. وسائل الإعلام ، وإعداد تغيير الخلية
8. تحميل خرطوشة الاستشعار
- المركبات الحارة الى 37 درجة مئوية قبل التحميل خرطوشة استشعار وتحميل المركبات في منافذ حاقن على النحو التالي :
- الأعمدة 1-4 : تحميل 16 ، 18 ، و 20 ميكرولتر من XF الفحص وسائل الإعلام (DMEM) إلى منافذ A ، B و C ، على التوالي.
- أعمدة 5-12 :
تحميل 16 ميكرولتر من Oligomycin في الموانئ A
تحميل 18 ميكرولتر من FCCP باء في الموانئ
تحميل 20 ميكرولتر من روتنون في الموانئ C
9. أوامر بروتوكول
| أمر | الوقت (دقيقة) | المنفذ |
| معايرة | ||
| وازن | ||
| حلقة ابدأ | 3X | |
| مزيج | 3 | |
| انتظر | 2 | |
| قياس | 3 | |
| نهاية الحلقة | ||
| حقن | A | |
| حلقة ابدأ | 2X | |
| مزيج | 3 | |
| انتظر | 2 | |
| قياس | 3 | |
| حقن | B | |
| حلقة ابدأ | 2X | |
| مزيج | 3 | |
| انتظر | 2 | |
| قياس | 3 | |
| حقن | C | |
| حلقة ابدأ | 2X | |
| مزيج | 3 | |
| انتظر | 2 | |
| قياس | 3 | |
| نهاية |
الجدول 1. أوامر البروتوكول
Discussion
ويستمد هذا الاختبار من التجربة الكلاسيكية للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا ويخدم كإطار التي لبناء تجارب أكثر تعقيدا تهدف إلى فهم مختلف التغيرات في التمثيل الغذائي للخلية ، وظيفة الميتوكوندريا والطاقة الحيوية بشكل عام.
وينبغي أن يكون الأمثل جميع المركبات المستخدمة في هذه التجربة من أجل التركيز الذي يوفر تأثير القصوى. وهذا هو ، يجب على المرء أن إجراء تجارب للتأكد من معايرة منفصلة هذه القيم. وهذا أمر مهم خصوصا مع FCCP ، ومنحنى المعايرة يميل إلى أن يكون حادا جدا ، والكثير من FCCP يمكن أن تقلل في الواقع الردود في التعرف الضوئي على الحروف. ويتراوح نموذجي (تركيزات النهائي) لاختبار ما يلي :
- 0،1-1،0 ميكروغرام / مل من Oligomycin
- 0،1-5،0 UM FCCP
- 0،1-1،0 روتنون UM
علما أنه سيتم أثرت في الردود على كل مجمع أعلاه (وخاصة FCCP) من قبل وسائل الاعلام مقايسة التكوين (النوع الأساسي ، [الجلوكوز] ، [البيروفات] ، وجود / غياب جيش صرب البوسنة ، الخ). علاوة على ذلك ، إذا تم تغيير التركيبة XF مقايسة وسائل الاعلام ، وسوف تحتاج إلى التحسين يعاد تنفيذها. وجود وتركيز البيروفات مهم بشكل خاص في الحصول على القدرات التنفسية القصوى بسبب FCCP. وقد لاحظ فرس البحر العلوم البيولوجية في عدد من خطوط الخلايا التي إغفال البيروفات يلغي قدرة الخلايا على الاستجابة إلى الحد الأقصى (فوق خط الأساس) لFCCP. عادة ، يجب اختبار تركيزات البيروفات ملي 10-10 لفهم تركيز الأمثل للحصول على التنفس البيروفات القصوى. علما بأن [البيروفات] و [الجلوكوز] قد تحتاج إلى أن يكون "عبر معاير" للحصول على أفضل الشروط وسائل الاعلام عن التجربة.
وتعرض نتائج هذه التجربة النموذجية أدناه في الرسم البياني يظهر OCR مقابل مرة وآخر مرة يظهر مقابل ECAR :
الشكل 2 دوام مقابل OCR
الشكل 3 دوام مقابل ECAR
لاحظ هنا أننا الردود المتوقعة في التعرف الضوئي على الحروف وECAR كما يتم التعامل مع الخلايا مع كل مجمع المتعاقبة. لoligomycin ، OCR النقصان نتيجة لعرقلة التوليف اعبي التنس المحترفين في مجمع الميتوكوندريا خامسا منذ الخلايا غير قادرة على تجميع ATP عبر OXPHOS ، فإنها تعود إلى تحلل لتلبية مطلبهم لاعبي التنس المحترفين ، وبالتالي فإننا نلاحظ زيادة في ECAR. كما هو موضح سابقا ، FCCP كوكيل uncoupling. منذ الآن يجب أن تتغلب على الخلايا تسرب بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية ، والتعرف الضوئي على الحروف بشكل ملحوظ كما استهلكت أكثر O2 ضخ البروتونات الزائدة عبر غشاء الميتوكوندريا. أخيرا ، أنا روتينون يمنع مجمع مجمع الميتوكوندريا والثالث ، على التوالي ، والذي يسبب تدفق الالكترونات توقف في سلسلة نقل الإلكترون ، وبذلك يتم خفض كبير في استهلاك O2.
الشكل 4. التنفس المعلمات
ما وراء التغيرات المتوقعة في التنفس وECAR ، قد حصلت على عدد من المعلمات الجهاز التنفسي من هذه البيانات. وتتلخص هذه في الشكل أعلاه :
هنا نرى أننا قد الحصول على معلومات حول التنفس القاعدية من الخلايا ، في المئة من استهلاك O2 المكرسة لإنتاج ATP فضلا عن المبلغ المخصص لصيانة التدرج بروتون (بسبب تسرب + H). كذلك ، قد نحصل على معدل التنفس في ظل الظروف القصوى للتنفس uncoupled (يشار إليه أحيانا على القدرات التنفسية كما الغيار) ، وأخيرا ، يمكننا تحديد كمية استهلاك O2 لا يرجع الى عمليات الميتوكوندريا.
وهناك عدد متزايد من الدراسات وبسرعة توظيف هذا الملف الميتوكوندريا لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية ، وتحديد الخلل الميتوكوندريا والتنبؤ قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد و / أو الشتائم. لمزيد من المعلومات والتفاصيل حول هذا الأسلوب التجريبي وفكرة قدرة الجهاز التنفسي الغيار ، يرجى الرجوع إلى رؤية المنشورات التالية 1-8.
Disclosures
مين وو ، لكل جنسن بو ، جورج دبليو روجرز ، وديفيد Ferrick ألف من العاملين في العلوم البيولوجية فرس البحر ، والتي تنتج الأجهزة والكواشف واردة في هذه المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
