Summary
세포의 mitochondrial 기능을 프로 파일링하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다. 기초 호흡 속도, ATP 링크된 호흡, 양자 누설, 그리고 예비 용량 : 생성된 mitochondrial 프로필 한 실험에서 측정할 수 mitochondrial 함수의 네 가지 매개 변수를 제공합니다.
Abstract
세포 신진 대사를 측정하고 mitochondrial 장애를 이해하는 능력은, 비만에 mitochondrial 함수의 역할을 이해, 당뇨병, 노화, 암, 심혈관 기능과 안전성 독성의 연구 발전을 위해 전 세계 과학자들을 수있게되었습니다.
세포 대사는 산소, 포도당, 지방산, 그리고 글루타민, 그리고 효소 제어 산화와 환원 반응 일련의를 통해 이후의 에너지 변환과 같은 기판 이해의 과정입니다. ATP 등 락트 산 및 세포외 환경으로 CO 2와 같은 열 및 화학적 부산물의 릴리스의 생산에서 이러한 세포 생화학 반응 결과.
산소 소비 속도 - - 또는 OCR 세포의 생리 상태, 그리고 그 세포의 상태의 변경에 대한 값진 통찰력은, 세포, mitochondrial 호흡의 지표에 의해 소비 산소의 비율을 측정을 통해 얻은 수 있습니다. 락트 산으로 포도당의 전환, 산소의 독립 : 세포도 작용을 통해 IE를 ATP를 생성합니다. 교양 우물에서, 락트 산은 양자의 기본 소스입니다. 또는 ECAR - 매체의 산성화는 엑스트라 셀룰러 산성화 속도를 제공 일으키는 세포를 둘러싼 세포 매체에 발표 양자를 통해 간접적으로 생산 젖산을 측정.
본 실험에서는 C2C12 myoblast 세포는 씨호스 세포 배양 접시에 주어진 밀도에 씨앗을 품고있다. 기초 산소 소비 (OCR)와 세포외 산성화 (ECAR) 요금은 기본 요금을 수립하기 위해 측정합니다. 세포는 다음 metabolically 세포의 bioenergetic 프로필을 이동 다른 화합물의 세 추가 (연속)에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다.
이 분석은 mitochondria 평가하는 고전적인 실험에서 파생된과 mitochondria의 physiologic과 pathophysiologic 두 기능을 이해하기위한보다 복잡한 실험을 구축하고 스트레스 및 / 또는 모욕에 대응하는 세포의 능력을 예측하는있는 프레임 워크 역할을합니다.
Protocol
본 실험에서는 C2C12 myoblast 세포는 씨호스 세포 배양 접시에 주어진 밀도에 씨앗을 품고있다. 기초 산소 소비 (OCR)와 세포외 산성화 (ECAR) 요금은 기본 요금을 수립하기 위해 측정합니다.
1. 세포 주입
세포는 metabolically 세포의 bioenergetic 프로필을 이동 다른 화합물의 세 추가 (연속)에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 한 그룹은 통제 "화합물"로 추가 미디어를 실행하여, 컨트롤 역할을합니다.
- 첫 번째 주사 oligomycin입니다. Oligomycin은 F O 부분 ATP synthase의 (단지 V)의 양자 채널을 차단하여 ATP 합성을 억제. mitochondrial 연구, 그것은 주 3 (phosphorylating) 호흡을 방지하는 데 사용됩니다. 전지, 그것은 ATP 합성과 내부 mitochondrial 멤브레인에 걸쳐 자연 프로톤 누설을 극복하는 데 필요한 산소 소비의 비율에 전념 O2 소비량의 비율을 구분하는 데 사용할 수 있습니다.
- 두 번째 주사 FCCP입니다. FCCP은 (카르보닐는 청산 가리 - P - trifluoromethoxyphenylhydrazone) 모바일 이온 항공사입니다 ionophore입니다. 그것은 mitochondrial 멤브레인 대신 ATP synthase의 (단지 V)의 양자 채널에 걸쳐 수소 이온을 운반하여 ATP 합성을 방해하기 때문에 uncoupling 요원입니다. mitochondrial 막 잠재력이 붕괴는 ATP의 생성없이 에너지와 산소의 급속한 소비로 연결. 세포는 ATP를 생성하는 작용을 사용하여 자신의 에너지 균형을 유지하려고 시도로서이 경우에는 OCR 및 ECAR 모두 인해 uncoupling으로 OCR 및 ECAR 증가합니다.
FCCP 치료는 최대한 억제 OCR 및 초기 기저 OCR 사이의 양적 차이로 정의 세포의 "여분의"호흡 용량을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 심지어 최대한의 생리적 또는 pathophysiological 자극의 조건 하에서 몇 가지 여분의 호흡 능력의 유지는 생명력 및 / 또는 세포의 생존을 정의하는 주요 요인임을 제안되었습니다. 증가 에너지 수요의 조건 스트레스에 대응하는 세포의 능력은 mitochondria의 bioenergetic 용량의 영향을 상당 부분에 있습니다. 이 bioenergetic 용량은 mitochondria 및 전자 수송에 관련된 효소의 기능 용량 기판을 제공하는 세포의 능력 등 여러 가지 요인에 의해 억제 - 채굴입니다 - 세 번째 주사에 rotenone, 복잡한 I 억제제는 세포에 추가됩니다. 이것은 mitochondrial 호흡을 종료하고 계산하는 호흡에 기여 mitochondrial 및 비 - mitochondrial 분수를 모두 사용합니다. 세포가 더 glycolytic 상태로 교대로 하나는 에너지 균형을 유지하기 위해 ECAR에 수반하는 증가, 장애인 mitochondrial 기능으로 인해 OCR의 감소를 관찰합니다
Rotenone 콤플렉스에서 철 - S 센터 I ubiquinone로 (보조 효소 Q)에서 전자의 전송을 방지 mitochondrial 억제제이다. 단지 이러한 억제 내가 ATP의 형태로 사용할 에너지로 변환되는 NADH의 잠재 에너지를 방지할 수 있습니다.
2. 시약 및 재료
- Oligomycin, FCCP 및 Rotenone 솔루션 (씨호스 미토 스트레스 테스트 키트)
- DMEM 러닝 미디어 (씨호스 # 100965-000)
- DMSO (시그마 D8418)
- 소주 워터 (Gibco 15230-170)
- 보정 버퍼 (씨호스 Bioscience)
3. 성장 매체
- 500 ML DMEM (Gibco 11965-092)
- 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
- 5 ML 펜 / Strep (Gibco 15140-122)
- 5 ML 나트륨 Pyruvate (시그마 S8636)
- 5 ML Glutamax (Gibco 35050-061)
4. 프로토콜을 심는
- 전지 / 잘 성장 매체의 100 μL 10,000 전지 XF96 셀 문화 접시에 씨앗을 10 %의 CO 2 ° C 배양기 37에 배치됩니다.
- 세포는 1 시간 이내에 XF96 세포 배양 판을 준수합니다.
- 시딩 후 XF96 24 시간 이내에 분석 세포.
5. 검정 템플릿의 준비
- 분석 마법사 (부록 I)를 사용하여 다음과 같은 그룹의 레이아웃과 템플릿을 생성합니다 :
열 및 그룹 할당을 식별 그림 1. 웰 그리드 레이아웃
6. 컴파 운드 준비
- 다음과 같이 XF DMEM 어세 미디어 다음 화합물 준비 :
10 음 Oligomycin, 30.0 음 FCCP, 20.0 μm의의 Rotenone,
이러한 농도는 화합물이 우물에 주입하는 경우 이루어집니다 10X 희석을 나타냅니다. 작업 농도는 다음과 같습니다
한 음 Oligomycin, 3.0 음 FCCP, 2.0 μm의의 Rotenone
7. 미디어 변화와 셀 준비
8. 센서 카트리지를 로딩
- 37 따뜻한 화합물 ° C 이전에 센서 카트리지를로드하고 다음과 같이 연료 분사 장치를 포트에 화합물을 로드할 수 :
- 열 1-4 : 각각 포트 A, B 및 C로로드 16, 18, 그리고 XF 어세 미디어 (DMEM) 20 μL.
- 열 5-12 :
포트에 Oligomycin 16 μL를 로드할
포트 B에 FCCP 18 μL를 로드할
포트 C에 Rotenone 20 μL를 로드할
9. 프로토콜 명령
| 명령 | 시간 (분) | 포트 |
| 조정 | ||
| 평형을 유지하다 | ||
| 루프 시작 | 배 | |
| 혼합 | 3 | |
| 잠깐 만요 | 2 | |
| 조치 | 3 | |
| 루프 엔드 | ||
| 주사 놓기 | ||
| 루프 시작 | 2X | |
| 혼합 | 3 | |
| 잠깐 만요 | 2 | |
| 조치 | 3 | |
| 주사 놓기 | B | |
| 루프 시작 | 2X | |
| 혼합 | 3 | |
| 잠깐 만요 | 2 | |
| 조치 | 3 | |
| 주사 놓기 | C | |
| 루프 시작 | 2X | |
| 혼합 | 3 | |
| 잠깐 만요 | 2 | |
| 조치 | 3 | |
| 끝 |
표 1. 프로토콜 명령
Discussion
이 분석은 mitochondrial 기능을 탐사하기 위해 고전적인 실험에서 파생된과 세포 신진 대사, mitochondrial 기능, 그리고 전반적인 bioenergetics의 다양한 변화를 이해하기위한보다 복잡한 실험을 구축과 함께 프레임 워크 역할을합니다.
본 실험에 사용된 모든 성분이 최대한의 효과를 제공하는 농도를 위해 최적화해야합니다. 그 하나는 이러한 값을 확인할 별도의 적정 실험을 수행해야합니다. 적정 곡선이 매우 날카로운하는 경향, 그리고 너무 많은 FCCP 실제로 OCR의 반응을 축소 할 수 있듯이, FCCP 특히 중요합니다. 테스트 일반적인 범위 (최종 농도)과 같다 :
- 0.1-1.0 UG / Oligomycin의 ML
- 0.1-5.0 음 ... FCCP
- 0.1-1.0 음의 Rotenone
위의 각각의 화합물 (특히 FCCP)로 응답 검정 미디어 구성 (기본 유형, [포도당], [pyruvate] BSA의 존재 / 부재 등)에 의해 영향을받을됩니다. XF의 분석 미디어 구성이 변경되면 또한, 최적화를 다시 수행해야합니다. 존재와 pyruvate의 농도가 FCCP로 인해 최대한의 호흡 능력을 얻기에 특히 중요합니다. Bioscience 씨호스는 pyruvate의 누락이 FCCP하기 (기본 이상) maximally 반응 세포의 능력을 abrogates되는 세포 라인의 번호를 관찰했다. 일반적으로 1-10 MM의 pyruvate의 농도는 최대한 호흡을 얻기 위해 pyruvate의 최적 농도를 이해하기 위해 테스트해야합니다. 참고 [pyruvate]과 [포도당] 실험을위한 최적의 매체 조건을 얻기 위해 "교차 titrated"해야 할 수 있습니다.
본 실험의 전형적인 결과는 OCR 대 시간과 다른 표시 ECAR 대 시간을 보여주는 그래프 아래에 제공됩니다 :
그림 2. OCR 대 시간
그림 3. ECAR 대 시간
세포 각 연속된 화합물로 취급됩니다으로서 여기에 우리는 OCR과 ECAR의 예상 반응을 관찰했다. oligomycin 들어, OCR은 mitochondrial 콤플렉스에서 V. 세포 OXPHOS을 통해 ATP를 합성 수 있으므로, 그들이 ATP에 대한 그들의 수요를 충족하기 위해 작용으로 되돌아 ATP 합성을 차단의 결과로 감소, 따라서 우리는 ECAR의 증가를 관찰. 이전과 같이, FCCP는 uncoupling 대리인 역할을합니다. 세포 이제 내부 mitochondrial 멤브레인 전체 프로톤 누수를 극복해야하므로 더 많은 O2가 mitochondrial 막 너머로 여분의 양자를 펌프에 소비이므로, OCR이 크게 증가합니다. 마지막으로, rotenone은 각각 mitochondrial 복잡한 I 및 복합 III을 억제하는가 전자 수송 체인의 중단에 전자의 흐름의 원인, 따라서 O2의 소비가 크게 줄어 듭니다.
그림 4. 호흡 매개 변수
호흡과 ECAR의 예상 변화 외에도, 호흡 매개 변수의 숫자는이 데이터로부터 얻을 수 있습니다. 이것은 위의 그림에 요약입니다 :
여기서 우리는 세포의 기저 호흡, ATP의 생산뿐 아니라 양성자 기울기를 (H + 누설로 인한) 유지하는데 최선을 다해 금액에 전념 O2 소비의 비율에 대한 정보를 얻을 수 있습니다 참조하십시오. 또한, 우리는 uncoupled 호흡 (때로는 같은 여분의 호흡 능력 함)의 조건에서 최대한의 호흡 속도를 얻을 수 있습니다 그리고 마지막으로, 우리는 mitochondrial 프로세스에 의한하지 O2 소비의 양을 결정할 수 있습니다.
연구 급속하게 증가하고, 세포 bioenergetics을 평가 mitochondrial 장애를 파악하고 스트레스 및 / 또는 모욕에 대응하는 세포의 능력을 예측하는이 mitochondrial 프로필을 채용하고 있습니다. 이 실험적인 방법과 여분의 호흡 능력의 개념에 대한 자세한 정보와 내용은 다음과 같은 간행물 1-8를 참조 참조하십시오.
Disclosures
보 젠슨, 조지 W. 로저스, 데이비드 A. Ferrick 당 민 우,이 문서의 특징 시약 및 장비를 생산 Bioscience 씨호스의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
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