Summary
Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.
Abstract
Hücresel metabolizma ölçen ve mitokondriyal disfonksiyonu anlamak için yetenek, mitokondriyal fonksiyon obezite, şeker hastalığı, yaşlanma, kanser, kardiyovasküler fonksiyon ve emniyet toksisite rolünü anlamak araştırma ilerlemek için dünya çapında bilim adamları sağladı.
Hücresel metabolizma, oksijen, glikoz, yağ asitleri, glutamin, ve enzimatik oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonları kontrol bir dizi sonraki enerji dönüşüm gibi substrat alımı, bir süreçtir. Bu hücre içi biyokimyasal reaksiyonlar sonucu ATP üretimi, ısı ve kimyasal yan, ekstrasellüler ortama laktat ve CO 2 gibi serbest bırakılması.
Oksijen Tüketim Hızı - ya da OCR hücre fizyolojik devlet ve devletin bu hücrelerin değişiklik değerli içgörü, hücreleri, mitokondriyal solunumun bir göstergesi tarafından tüketilen oksijen oranı ölçüm yoluyla elde edilebilir. Oksijen, glikoz ve laktat dönüşüm bağımsız: Hücreler aynı zamanda, yani glikoliz yoluyla ATP üretmek. Kültürlü bir kuyu, laktat proton birincil kaynağıdır. Dolaylı veya ECAR - orta asitlenme Ekstra Hücresel Asidifikasyon Oranı neden hücreleri çevreleyen ekstrasellüler ortama salınan protonlar ile üretilen laktik asit ölçümü.
Bu deneyde, C2C12 myoblast hücreleri Denizatı hücre kültürü plakaları belli bir yoğunlukta numaralı seribaşı. Bazal oranları kurmak için bazal oksijen tüketimi (OCR) ve ekstraselüler asitlenme (ECAR) oranları ölçülür. Bu hücreler daha sonra metabolik farklı bileşiklerin hücrenin biyoenerjetik profili vardiya üç eklemeler (arkaya) tarafından rahatsız edilir.
Bu testte mitokondri değerlendirmek için klasik bir deney türetilmiştir ve mitokondri hem fizyolojik ve patofizyolojik işlevini anlamak amacıyla daha karmaşık deneyler inşa etmek ve stres ve / veya hakaret cevap hücrelerinin yeteneği tahmin etmek için bir çerçeve olarak hizmet vermektedir.
Protocol
Bu deneyde, C2C12 myoblast hücreleri Denizatı hücre kültürü plakaları belli bir yoğunlukta numaralı seribaşı. Bazal oranları kurmak için bazal oksijen tüketimi (OCR) ve ekstraselüler asitlenme (ECAR) oranları ölçülür.
1. Hücreler Enjeksiyon
Hücreler metabolik farklı bileşiklerin hücrenin biyoenerjetik profili vardiya üç eklemeler (arkaya) tarafından rahatsız. Bir grup medya kontrolü "bileşikler" olarak eklendi çalışan, kontrol olarak hizmet verecek.
- İlk enjeksiyon oligomycin. Oligomycin F o kısmı ATP sentaz (Kompleks V) proton kanalı bloke ederek ATP sentezini inhibe eder. Mitokondriyal araştırmada, devlet 3 (fosforilleyerek) solunum önlemek için kullanılır. Hücreleri ile, ATP sentezi ve iç mitokondrial membran genelinde doğal proton sızıntısı üstesinden gelmek için gerekli O2 tüketimi yüzde ayrılmış O2 tüketimi yüzde ayırt etmek için kullanılabilir.
- Ikinci enjeksiyon FCCP. FCCP (Karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) mobil bir iyon taşıyıcı bir İyonofor. Mitokondrial membran yerine ATP sentaz (Kompleks V) proton kanal üzerinden hidrojen iyonlarının taşınması ATP sentezini bozar çünkü uncoupling bir ajandır. Bu çöküş mitokondrial membran potansiyeli ATP üretimi olmadan hızlı bir enerji ve oksijen tüketimine yol açar. Bu durumda, hücreler ATP üretmek için glikoliz ile enerji dengesini korumak için bir girişim olarak hem OCR ve ECAR nedeniyle uncoupling OCR ve ECAR artacaktır.
FCCP tedavi maksimum kontrolsüz OCR ve ilk bazal OCR arasındaki sayısal fark olarak tanımlanır hücrelerinin "yedek" solunum kapasitesini hesaplamak için kullanılabilir. ,, Maksimal fizyolojik veya patofizyolojik uyaran koşullar altında bile bazı yedek solunum kapasitesi bakım, canlılık ve / veya hücre hayatta kalma tanımlanmasında önemli bir faktör olduğu ileri sürülmektedir. Mitokondri biyoenerjetik kapasitesi etkilenir büyük bir kısmı artan enerji talebinin şartlar altında hücrelerin strese cevap yeteneği. Bu biyoenerjetik kapasitesi hücrenin mitokondri ve elektron taşıma alan enzimlerin fonksiyonel kapasite substrat sunmak için yeteneği dahil olmak üzere birçok faktör tarafından caydırmak-mayınlı - Rotenone Kompleks I inhibitörü, üçüncü enjeksiyon, hücreleri eklenir. Bu mitokondriyal solunum kapatmaya ve hesaplanacak solunum katkıda mitokondriyal ve non-mitokondrial kesirler sağlayacaktır. Bir hücre daha glikolitik devlet vardiya olarak enerji dengesini korumak amacıyla ECAR eşlik eden bir artış, mitokondriyal fonksiyon bozukluğu nedeniyle OCR bir azalma gözlemlemek olacaktır
Rotenone Kompleksi Fe-S merkezi Ben ubikinon (Koenzim Q) elektron transferini önleyen bir mitokondriyal bir inhibitörüdür. Kompleksi bu inhibisyonu ATP formunda kullanılabilir enerjiye dönüştürülür NADH potansiyel enerji engeller.
2. Reaktifler ve Malzeme
- Oligomycin, FCCP ve Rotenone Çözümleri (Seahorse Mito Stres Testi Kiti)
- DMEM Koşu Media (Seahorse # 100.965-000)
- DMSO (Sigma D8418)
- Damıtılmış Su (Gibco 15.230-170)
- Kalibrasyon tamponu (Seahorse Bioscience)
3. Büyüme Orta
- 500 ml DMEM (Gibco 11.965-092)
- % 10 FBS (Hyclone SH90070.03)
- 5 ml Penn / Strep (Gibco 15.140-122)
- 5 ml sodyum piruvat (Sigma S8636)
- 5 ml Glutamax (Gibco 35.050-061)
4. Protokol Seeding
- Hücre / besi 100 mcL 10.000 hücreleri ile XF96 hücre kültürleri plakalar numaralı seribaşı ve% 10 CO 2 ° C inkübatör 37 yerleştirilir.
- Hücreler 1 saat içinde XF96 hücre kültürü plakası uyacaktır.
- Tohumlama sonra XF96 24 saat içinde Testi hücreleri.
5. Testi Şablon Hazırlama
- Testi Sihirbazı (Ek I) kullanarak, aşağıdaki grup düzeni ile bir şablon oluşturmak:
Şekil 1 sütun ve grup atamaları belirlenmesi Kuyu ızgara düzeni
6. Bileşik Hazırlık
- XF DMEM Testi medya aşağıdaki bileşikler aşağıdaki gibi hazırlayın:
10 UM Oligomycin, 30.0 um FCCP, 20,0 mcM Rotenone
Bu konsantrasyonları bileşikler kuyuya enjekte edilir yapılacaktır 10X seyreltme temsil eder. Çalışma konsantrasyonları:
1 UM Oligomycin, 3.0 um FCCP, 2.0 mcM Rotenone
7. Medya Değişim ve Hücre Hazırlama
8. Sensör Kartuş yükleme
- Sıcak bileşikler 37 ° C sensör kartuş önce yükleme ve enjektör bağlantı noktaları aşağıdaki gibi bileşikler yüklemek için:
- Sütunlar 1-4: Yük sırasıyla A, B ve C portu, içine 16, 18, ve 20 XF Testi medya (DMEM) mcL.
- Sütunlar 5-12:
Port içine Oligomycin 16 mcL Yük A
Port Yatak içine FCCP 18 mcL yükleyin
Port C içine Rotenone 20 mcL yükleyin
9 - Protokol Komutlar
| Komuta | Süresi (dak) | Liman |
| Ayarlamak | ||
| Dengelemek | ||
| Loop Start | 3X | |
| Karışım | 3 | |
| Bekleyin | 2 | |
| Ölçmek | 3 | |
| Loop End | ||
| Enjekte | A | |
| Loop Start | 2X | |
| Karışım | 3 | |
| Bekleyin | 2 | |
| Ölçmek | 3 | |
| Enjekte | B | |
| Loop Start | 2X | |
| Karışım | 3 | |
| Bekleyin | 2 | |
| Ölçmek | 3 | |
| Enjekte | C | |
| Loop Start | 2X | |
| Karışım | 3 | |
| Bekleyin | 2 | |
| Ölçmek | 3 | |
| Son |
Tablo 1. Protokolü komutları
Discussion
Bu testte, mitokondriyal fonksiyon prob klasik deney türetilen ve çeşitli değişiklikler hücre metabolizmasını, mitokondriyal fonksiyon ve genel biyoenerjetik anlayış amaçlayan daha karmaşık deneyler inşa etmek için bir çerçeve olarak hizmet vermektedir.
Bu deneyde kullanılan tüm bileşikler, maksimal etkisi sağlar konsantrasyonu için optimize edilmelidir. Yani bu değerler bir tespit için ayrı titrasyon deneyleri gerçekleştirmek gerekir. Titrasyon eğrisi oldukça keskin olma eğilimindedir ve çok FCCP aslında OCR yanıtları azaltabilir, FCCP özellikle önemlidir. Tipik aralıkları (son konsantrasyonları) test etmek olacaktır:
- 0,1 - 1,0 ug / Oligomycin mL
- 0.1 - 5,0 um FCCP
- 0,1 - 1,0 UM Rotenone
(Özellikle FCCP) üzerindeki her bileşik yanıtları tahlil medya kompozisyonu (taban türü, [glikoz], [piruvat] BSA varlığı / yokluğu, vb.) Etkilenir unutmayın. Ayrıca, XF tahlil medya kompozisyonu değişti ise, optimizasyon, yeniden yapılması gerekecektir. Varlığı ve pirüvat konsantrasyonu FCCP nedeniyle maksimal solunum kapasitesi elde etmek için özellikle önemlidir. Bioscience Denizatı pirüvat ihmal FCCP (bazal yukarıda) maksimum cevap hücrelerinin yeteneği lağvetti hücreleri hatları bir dizi gözlemledi. Tipik olarak, 1-10 mM piruvat konsantrasyonları maksimal solunum elde etmek için en uygun konsantrasyonda pirüvat anlamak için test edilmelidir. Not: [piruvat] ve [glikoz] deneme için en uygun ortam koşulları elde etmek için "cross-titre" olmak gerekebilir.
Bu deneyde tipik sonuçlar OCR vs zaman ve gösteren başka bir ECAR vs zamanı gösteren bir grafik aşağıda sunulmuştur:
Şekil 2 OCR vs Zaman
Şekil 3 ECAR vs Zaman
Burada hücrelerin birbirini izleyen bileşik ile tedavi olarak OCR ve ECAR beklenen tepkileri gözlemlenmiştir. Oligomycin için, OCR, mitokondriyal Kompleksi V. hücrelerin Kadıköy ATP sentezlenmesi mümkün olduğundan, onlar için ATP talebi karşılamak için glikoliz dönmek ATP sentezini bloke bir sonucu olarak azalır, böylece biz ECAR bir artış gözlemliyoruz. Daha önce de gösterildiği gibi, FCCP uncoupling bir ajan olarak hareket eder. Hücreler artık iç mitokondrial membran boyunca proton sızıntısı üstesinden gelmek zorunda olduğundan daha fazla O2 mitokondriyal membrandan aşırı proton pompa tüketildiği gibi, OCR önemli ölçüde artırır. Son olarak, rotenone, sırasıyla, mitokondriyal Kompleks I ve Kompleks III inhibe elektron taşıma zinciri sona elektronların akmasına neden olur ve böylece O2 tüketimi önemli ölçüde azalır.
Şekil 4 Solunum parametreleri
Solunum ve ECAR beklenen değişikliklerin ötesinde, solunum parametreleri bir dizi bu verileri elde edilebilir. Bu yukarıdaki şekilde özetlenebilir:
İşte biz, ATP üretiminin yanı sıra, proton degrade (H + kaçak nedeniyle) korumak için ayrılan miktar ayrılmış O2 tüketiminin yüzde hücrelerinin bazal solunum hakkında bilgi alabilirsiniz görüyoruz. Ayrıca, biz Kuplajsız solunum (bazen solunum kapasitesi gibi yedek anılacaktır) koşulları altında maksimal solunum hızı elde edebilir ve nihayet, mitokondriyal süreçleri nedeniyle O2 tüketim miktarını belirlemek.
Çalışmalar hızla artan sayıda hücresel biyoenerjetik değerlendirmek, mitokondriyal fonksiyon bozukluğu tespit ve, stres ve / veya hakaret cevap hücrelerinin yeteneği tahmin etmek için bu mitokondriyal profil kullanıyorlar. Bu deneysel yöntem ve yedek solunum kapasitesi fikir hakkında daha fazla bilgi ve detaylar için, aşağıdaki yayınlara 1-8 bakın bakın.
Disclosures
Ortalama Min Wu Bo Jensen, George W. Rogers ve David A. Ferrick Bioscience Denizatı, bu makalede yer reaktifler ve enstrümantasyon üreten çalışanları.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
