Summary
Une description d'une méthode de profilage de la fonction mitochondriale dans les cellules est fournie. Le profil mitochondrial généré fournit quatre paramètres de la fonction mitochondriale qui peuvent être mesurées dans une expérience: le taux de respiration basale, l'ATP lié respiration, fuite de protons, et la capacité de réserve.
Abstract
La capacité de mesurer le métabolisme cellulaire et comprendre la dysfonction mitochondriale, a permis aux scientifiques du monde entier pour faire avancer leurs recherches dans la compréhension du rôle de la fonction mitochondriale dans l'obésité, la toxicité diabète, le vieillissement, le cancer, la fonction cardiovasculaire et de sécurité.
Le métabolisme cellulaire est le processus d'absorption du substrat, comme l'oxygène, glucose, acides gras, et la glutamine, et la conversion d'énergie subséquente à travers une série d'oxydation enzymatique contrôlée et les réactions de réduction. Ces résultats biochimiques intracellulaires réactions dans la production d'ATP, la libération des sous-produits de la chaleur et de produits chimiques, tels que le lactate et le CO 2 dans le milieu extracellulaire.
Des informations précieuses sur l'état physiologique des cellules, et l'altération de l'état de ces cellules, peuvent être acquises grâce à la mesure du taux d'oxygène consommée par les cellules, un indicateur de la respiration mitochondriale - le taux de consommation d'oxygène - ou OCR. Cellules aussi générer l'ATP par la glycolyse, à savoir: la conversion du glucose en lactate, indépendant de l'oxygène. Dans les puits de culture, le lactate est la principale source de protons. Mesure de l'acide lactique produit indirectement via protons libérés dans le milieu extracellulaire entourant les cellules, ce qui provoque une acidification du milieu fournit la vitesse d'acidification extra-cellulaires - ou de l'ECAR.
Dans cette expérience, cellules C2C12 myoblastes sont ensemencées à une densité donnée en plaques Seahorse culture cellulaire. La consommation d'oxygène basale (OCR) et l'acidification extracellulaire (ECAR) les taux sont mesurés pour établir les taux de base. Les cellules sont ensuite métaboliquement perturbé par trois additions de composés différents (successivement) qui déplacent le profil bioénergétique de la cellule.
Ce test est dérivé d'une expérience classique pour évaluer les mitochondries et sert de cadre qui permet de construire des expériences plus complexes visant à comprendre la fonction à la fois physiologiques et physiopathologiques de la mitochondrie et de prédire la capacité des cellules à répondre au stress et / ou des insultes.
Protocol
Dans cette expérience, cellules C2C12 myoblastes sont ensemencées à une densité donnée en plaques Seahorse culture cellulaire. La consommation d'oxygène basale (OCR) et l'acidification extracellulaire (ECAR) les taux sont mesurés pour établir les taux de base.
1. Injection cellules
Les cellules sont métaboliquement perturbé par trois additions de composés différents (successivement) qui déplacent le profil bioénergétique de la cellule. Un groupe servira de témoin, avec les médias courir ajouté que le contrôle "composés".
- La première injection est oligomycine. Oligomycine inhibe la synthèse d'ATP par le blocage du canal à protons de la F o partie ATP synthase (complexe V). Dans la recherche des mitochondries, il est utilisé pour empêcher l'état 3 (phosphorylation) la respiration. Avec les cellules, elle peut être utilisée pour distinguer le pourcentage de la consommation d'O2 consacrée à la synthèse d'ATP et le pourcentage de la consommation d'O2 nécessaire pour surmonter la fuite de protons naturelles à travers la membrane mitochondriale interne.
- La deuxième injection est FCCP. FCCP (carbonyl cyanure de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) est un ionophore qui est un transporteur d'ions mobiles. C'est un agent de découplage, car il perturbe la synthèse d'ATP par le transport des ions d'hydrogène à travers la membrane mitochondriale, au lieu du canal à protons de l'ATP synthase (complexe V). Cet effondrement du potentiel de membrane mitochondriale conduit à une consommation rapide d'énergie et d'oxygène, sans générer de l'ATP. Dans ce cas, les deux OCR et ECAR va augmenter, en raison de l'OCR découplage, et ECAR que les cellules tentent de maintenir leur équilibre énergétique en utilisant la glycolyse pour produire l'ATP.
Le traitement FCCP peut être utilisé pour calculer la capacité de "rechange" respiratoire des cellules, qui est défini comme la différence quantitative entre maximal incontrôlée OCR et l'initiale OCR basale. Il a été proposé que le maintien d'une certaine capacité de réserve des voies respiratoires, même dans des conditions de stimulus physiologique ou physiopathologique maximale est un facteur majeur définissant la vitalité et / ou la survie des cellules. La capacité des cellules à répondre au stress dans des conditions de la demande accrue d'énergie est en grande partie influencée par la capacité des mitochondries bioénergétique. Cette capacité bioénergétique est déterminée par plusieurs facteurs, y compris la capacité de la cellule de livrer substrat à la mitochondrie et la capacité fonctionnelle des enzymes impliquées dans le transport des électrons - Dans la troisième injection, la roténone, un inhibiteur complexe I, est ajouté aux cellules. Ce sera fermé respiration mitochondriale et permettre à la fois les fractions mitochondriale et non mitochondrial contribue à la respiration doit être calculé. On observera une diminution de la ROC en raison de la fonction mitochondriale altérée, avec une augmentation concomitante de l'ECAR que la cellule se déplace vers un état plus glycolytique afin de maintenir son bilan énergétique
La roténone est un inhibiteur mitochondrial qui empêche le transfert d'électrons à partir du centre Fe-S dans le complexe I à l'ubiquinone (coenzyme Q). Cette inhibition du complexe I empêche l'énergie potentielle de NADH d'être convertie en énergie utilisable sous forme d'ATP.
2. Réactifs et matériaux
- Oligomycine, FCCP, et Solutions roténone (Hippocampe Mito Kit Stress Test)
- DMEM Exécution du média (Hippocampe # 100965-000)
- DMSO (Sigma D8418)
- Eau distillée (Gibco 15230-170)
- Tampon d'étalonnage (Hippocampe Bioscience)
3. Milieu de croissance
- 500 ml de DMEM (Gibco 11965-092)
- FBS à 10% (Hyclone SH90070.03)
- 5 ml Penn / Strep (Gibco 15140-122)
- 5 ml pyruvate de sodium (Sigma S8636)
- 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061)
4. Semis Protocole
- Les cellules sont ensemencées dans des cultures cellulaires XF96 plaques avec 10 000 cellules / puits dans 100 ul de milieu de croissance et placé en incubateur à 37 ° C avec 10% de CO 2.
- Les cellules adhèrent à la plaque de culture cellulaire XF96 en 1 heure.
- Cellules de dosage dans XF96 24 heures après l'ensemencement.
5. Préparation du modèle Assay
- Utilisation de l'Assistant Assay (Annexe I), de générer un modèle avec la mise en groupe suivant:
Mise en figure 1. Grille de bien identifier les assignations de colonnes et de groupe
6. Préparation composé
- Préparer les composés suivants dans les milieux DMEM XF Assay comme suit:
10 oligomycine uM, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM roténone,
Ces concentrations représentent la dilution 10X qui sera faite lorsque les composés sont injectés dans le puits. Les concentrations de travail sont:
1 oligomycine uM, 3,0 uM FCCP, la roténone uM 2,0
7. Changer les médias et la préparation cellulaire
8. Chargement cartouche de capteur
- Composés chaude à 37 ° C avant le chargement de la cartouche du capteur et la charge des composés dans les ports d'injection comme suit:
- Colonnes 1-4: Charge 16, 18, et 20 pi de XF Assay médias (DMEM) dans les ports A, B et C, respectivement.
- Colonnes 5-12:
Charge 16 uL d'oligomycine dans les ports A
Charge 18 uL d'FCCP dans les ports B
Charge 20 pl de la roténone dans les ports C
9. Commandes du protocole
| Commande | Temps (min) | Port |
| Calibrer | ||
| Équilibrer | ||
| Boucle de départ | 3X | |
| Mix | 3 | |
| Attendre | 2 | |
| Mesure | 3 | |
| Loop End | ||
| Injecter | Une | |
| Boucle de départ | 2X | |
| Mix | 3 | |
| Attendre | 2 | |
| Mesure | 3 | |
| Injecter | B | |
| Boucle de départ | 2X | |
| Mix | 3 | |
| Attendre | 2 | |
| Mesure | 3 | |
| Injecter | C | |
| Boucle de départ | 2X | |
| Mix | 3 | |
| Attendre | 2 | |
| Mesure | 3 | |
| Fin |
Tableau 1. Commandes Protocole
Discussion
Ce test est dérivé de l'expérience classique de sonder la fonction mitochondriale et sert de cadre qui permet de construire des expériences plus complexes visant à comprendre divers changements dans le métabolisme cellulaire, la fonction mitochondriale, et bioénergétique global.
Tous les composés utilisés dans cette expérience doit être optimisé pour la concentration qui donne l'effet maximal. Autrement dit, on doit effectuer des expériences de titration séparée de vérifier ces valeurs. Ceci est particulièrement important avec FCCP, comme la courbe de titrage tendance à être assez forte, et FCCP trop peut effectivement diminuer les réponses dans l'OCR. Gammes typiques (concentrations finales) pour tester serait:
- 0,1 à 1,0 ug / ml de oligomycine
- 0,1 à 5,0 uM FCCP
- 0,1 à 1,0 uM roténone
Notez que les réponses à chaque composé ci-dessus (surtout FCCP) sera influencée par la composition de dosage des médias (type de base, [glucose], [pyruvate], présence / absence de BSA, etc.) En outre, si le dosage des médias XF composition est modifiée, l'optimisation devra être ré-exécuté. La présence et la concentration du pyruvate est particulièrement important dans l'obtention de la capacité respiratoire maximale en raison de FCCP. Seahorse Bioscience a observé dans un certain nombre de lignes de cellules que l'omission de la pyruvate abroge la capacité des cellules à répondre au maximum (au-dessus de base) à FCCP. Généralement, les concentrations de pyruvate 1-10 mm doivent être testés pour comprendre la concentration optimale de pyruvate pour obtenir la respiration maximale. Notez que [pyruvate] ET [glucose] peut être nécessaire de "cross-titré" pour obtenir les conditions optimales pour l'expérience des médias.
Les résultats typiques de cette expérience sont présentés ci-dessous un graphique montrant l'OCR en fonction du temps et une autre montrant ECAR en fonction du temps:
Figure 2. OCR vs Temps
Figure 3. ECAR vs Temps
Ici, nous avons observé les réponses attendues dans les OCR et ECAR que les cellules sont traitées avec chaque composé successives. Pour oligomycine, ROC diminue en raison du blocage de synthèse d'ATP mitochondriale au Complexe V. Puisque les cellules sont incapables de synthétiser l'ATP par OXPHOS, ils reviennent à la glycolyse pour répondre à leur demande de l'ATP, ce que nous observons une augmentation de l'ECAR. Comme indiqué précédemment, FCCP agit comme un agent de découplage. Puisque les cellules doivent désormais surmonter la fuite de protons à travers la membrane mitochondriale interne, ROC augmente de manière significative que plus d'O2 est consommée pour pomper l'excès de protons de retour à travers la membrane mitochondriale. Enfin, la roténone inhibe complexe mitochondrial I et complexe III, respectivement, ce qui provoque un flux d'électrons à cesser de la chaîne de transport des électrons, et donc la consommation d'O2 est drastiquement réduit.
Figure 4. Respiration paramètres
Au-delà des changements attendus dans la respiration et ECAR, un certain nombre de paramètres respiratoires peuvent être obtenus à partir de ces données. Ceci est résumé dans la figure ci-dessus:
Ici, nous voyons que nous pouvons obtenir des renseignements au sujet de la respiration basale des cellules, la consommation d'O2 pour cent de la production consacrée à l'ATP ainsi que le montant consacré au maintien de la gradient de protons (ions H + en raison de fuites). En outre, nous pouvons obtenir la fréquence respiratoire maximale dans des conditions de la respiration découplée (parfois appelé capacité respiratoire comme pièce de rechange) et enfin, nous pouvons déterminer le montant de la consommation d'O2 n'est pas due à des processus mitochondriaux.
Un nombre rapidement croissant d'études employant ce profil mitochondrial pour évaluer la bioénergétique cellulaire, d'identifier un dysfonctionnement mitochondrial et de prédire la capacité des cellules à répondre au stress et / ou des insultes. Pour de plus amples informations et détails sur cette méthode expérimentale et l'idée de la capacité respiratoire de secours, s'il vous plaît se référer à voir les publications suivantes 1-8.
Disclosures
Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers, et David A. Ferrick sont des employés de Seahorse Bioscience, qui produit des réactifs et des instruments présentés dans cet article.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
