Summary
कोशिकाओं में mitochondrial समारोह की रूपरेखा के लिए एक विधि का वर्णन प्रदान की है. बेसल श्वसन दर, श्वसन एटीपी जुड़े, प्रोटॉन रिसाव, और आरक्षित क्षमता: mitochondrial उत्पन्न प्रोफ़ाइल mitochondrial समारोह के चार मापदंडों है कि एक प्रयोग में मापा जा सकता है है प्रदान करता है.
Abstract
सेलुलर चयापचय को मापने के लिए और mitochondrial रोग को समझने की क्षमता, उनके शोध मोटापे में mitochondrial समारोह की भूमिका, मधुमेह, उम्र बढ़ने, कैंसर, हृदय समारोह और सुरक्षा विषाक्तता को समझने में अग्रिम करने के लिए दुनिया भर के वैज्ञानिकों सक्षम है.
सेलुलर चयापचय सब्सट्रेट तेज, जैसे ऑक्सीजन, ग्लूकोज, फैटी एसिड, और glutamine, और enzymatically नियंत्रित ऑक्सीकरण और कमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से बाद में ऊर्जा रूपांतरण की प्रक्रिया है. इन intracellular एटीपी, लैक्टेट और बाह्य वातावरण में सीओ 2 के रूप में में गर्मी और रासायनिक byproducts की रिहाई के उत्पादन में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का परिणाम है.
ऑक्सीजन की खपत दर - या ओसीआर कक्षों की शारीरिक स्थिति, और उन कोशिकाओं के राज्य के परिवर्तन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि, ऑक्सीजन कोशिकाओं, mitochondrial श्वसन का एक संकेतक द्वारा खपत की दर को मापने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. कक्ष भी ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से एटीपी उत्पन्न, अर्थात्: ग्लूकोज की लैक्टेट के लिए रूपांतरण, ऑक्सीजन की स्वतंत्र. सुसंस्कृत कुओं में लैक्टेट प्रोटॉन का प्राथमिक स्रोत है. मापने या ECAR - लैक्टिक एसिड प्रोटॉन कोशिकी कोशिकाओं के आसपास के मध्यम में जारी है, जो का कारण बनता है मध्यम के अम्लीकरण अम्लीकरण अतिरिक्त सेलुलर दर प्रदान करता है के माध्यम से परोक्ष रूप से उत्पादन.
इस प्रयोग में, C2C12 myoblast कोशिकाओं Seahorse सेल संस्कृति प्लेटों में एक दिया घनत्व वरीयता प्राप्त हैं. बेसल ऑक्सीजन की खपत (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) आधारभूत दरों को स्थापित करने के लिए मापा जाता है. कोशिकाओं तो metabolically विभिन्न यौगिकों के तीन परिवर्धन (उत्तराधिकार में) है कि सेल के bioenergetic प्रोफ़ाइल बदलाव से परेशान.
इस परख mitochondria के आकलन के लिए एक क्लासिक प्रयोग से ली गई है और एक रूपरेखा के साथ जो और अधिक जटिल mitochondria की दोनों शारीरिक और pathophysiologic समारोह को समझने के उद्देश्य से प्रयोगों का निर्माण करने के लिए और करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को तनाव और / या अपमान का जवाब की भविष्यवाणी रूप में कार्य करता है.
Protocol
इस प्रयोग में, C2C12 myoblast कोशिकाओं Seahorse सेल संस्कृति प्लेटों में एक दिया घनत्व वरीयता प्राप्त हैं. बेसल ऑक्सीजन की खपत (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) आधारभूत दरों को स्थापित करने के लिए मापा जाता है.
1. कक्ष इंजेक्शन
कोशिकाओं metabolically विभिन्न यौगिकों के तीन परिवर्धन (उत्तराधिकार में) है कि सेल के bioenergetic प्रोफ़ाइल बदलाव से परेशान हैं. एक समूह के नियंत्रण के रूप में नियंत्रण "यौगिकों" के रूप में जोड़ा मीडिया चलाने के साथ सेवा करेंगे.
- पहले इंजेक्शन oligomycin है. Oligomycin एफ ओ भाग एटीपी synthase (परिसर वी) के प्रोटॉन चैनल अवरुद्ध करके एटीपी संश्लेषण को रोकता है. Mitochondrial अनुसंधान में, यह राज्य 3 (phosphorylating) श्वसन को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है. कोशिकाओं के साथ, यह O2 की खपत का प्रतिशत एटीपी संश्लेषण और O2 भीतर mitochondrial झिल्ली भर में प्राकृतिक प्रोटॉन रिसाव पर काबू पाने के लिए जरूरत की खपत के प्रतिशत के लिए समर्पित भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- दूसरा इंजेक्शन FCCP है. FCCP (कार्बोनिल साइनाइड पी trifluoromethoxyphenylhydrazone) एक ionophore है कि एक मोबाइल आयन वाहक है. यह एक uncoupling एजेंट है क्योंकि यह mitochondrial के बजाय एटीपी synthase (परिसर वी) के प्रोटॉन चैनल झिल्ली भर में हाइड्रोजन आयनों परिवहन द्वारा एटीपी संश्लेषण को बाधित. Mitochondrial झिल्ली की क्षमता के इस पतन एटीपी पीढ़ी के बिना ऊर्जा और ऑक्सीजन की एक तेजी से खपत की ओर जाता है. इस मामले में, दोनों ओसीआर और ECAR बढ़ाने के लिए, कारण uncoupling के लिए ओसीआर, और ECAR के रूप में कोशिकाओं ग्लाइकोलाइसिस का उपयोग करने के लिए एटीपी उत्पन्न करके उनके ऊर्जा संतुलन बनाए रखने का प्रयास करेंगे.
FCCP इलाज के लिए "अतिरिक्त" कोशिकाओं है कि अधिक से अधिक अनियंत्रित ओसीआर और प्रारंभिक बेसल ओसीआर के बीच मात्रात्मक अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है के श्वसन क्षमता की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रस्तावित किया गया है कि अधिक से अधिक शारीरिक या pathophysiological प्रोत्साहन की शर्तों के तहत भी कुछ स्पेयर सांस की क्षमता के रखरखाव के एक प्रमुख ऊर्जा और / या कोशिकाओं के अस्तित्व को परिभाषित कारक है. कोशिकाओं की क्षमता वृद्धि हुई ऊर्जा की मांग की शर्तों के तहत तनाव का जवाब के एक बड़े भाग में mitochondria की bioenergetic क्षमता से प्रभावित है. यह bioenergetic क्षमता है सेल mitochondria और इलेक्ट्रॉन परिवहन में शामिल एंजाइमों के कार्यात्मक क्षमता सब्सट्रेट देने की क्षमता सहित कई कारकों, के द्वारा रोकते खनन - तीसरे इंजेक्शन में, rotenone, एक परिसर मैं अवरोध करनेवाला, कोशिकाओं को जोड़ा है. यह नीचे mitochondrial श्वसन बंद होगा और दोनों mitochondrial और गैर - mitochondrial श्वसन के लिए योगदान करने के लिए गणना की जा भिन्न सक्षम. ओसीआर में कमी के कारण बिगड़ा mitochondrial समारोह का निरीक्षण, ECAR में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ के रूप में सेल के एक अधिक glycolytic राज्य परिवर्तन के क्रम में अपनी ऊर्जा संतुलन बनाए रखने
Rotenone एक mitochondrial अवरोध करनेवाला है कि Fe-एस केंद्र परिसर में मैं ubiquinone करने के लिए (Coenzyme क्यू) से इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण रोकता है. इस निषेध के परिसर मैं NADH में संभावित ऊर्जा एटीपी के रूप में प्रयोग करने योग्य ऊर्जा में कनवर्ट किया जा रहा से रोकता है.
2. अभिकर्मकों और सामग्री
- Oligomycin, FCCP, और Rotenone समाधान (Seahorse Mito तनाव टेस्ट किट)
- DMEM रनिंग मीडिया (# Seahorse 100965-000)
- DMSO (D8418 सिग्मा)
- आसुत जल (15230-170 Gibco)
- अंशांकन बफर (बायोसाइंस Seahorse)
3. विकास मध्यम
- 500 एमएल DMEM (11965-092 Gibco)
- 10% FBS (SH90070.03 Hyclone)
- 5 एमएल पेन / Strep (15140-122 Gibco)
- 5 एमएल सोडियम पाइरूवेट (S8636 सिग्मा)
- 5 एमएल Glutamax (35050-061 Gibco)
4. प्रोटोकॉल सीडिंग
- कक्ष 10,000 कोशिकाओं के साथ XF96 सेल संस्कृतियों प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं / अच्छी तरह से मध्यम विकास की 100 μL में और 37 में 10% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर रखा.
- कक्ष 1 घंटे के भीतर XF96 सेल संस्कृति की थाली का पालन करना होगा.
- XF96 बोने के बाद 24 घंटे में परख कोशिकाओं.
5. परख खाका तैयार
- परख विज़ार्ड (परिशिष्ट मैं) का उपयोग करना, निम्नलिखित समूह लेआउट के साथ एक टेम्पलेट उत्पन्न:
चित्रा 1 खैर ग्रिड लेआउट स्तंभ और समूह कार्य की पहचान
6. यौगिक तैयार
- निम्नानुसार एक्सएफ DMEM परख मीडिया में निम्नलिखित यौगिकों की तैयारी:
10 उम Oligomycin, 30.0 उम FCCP, 20.0 सुक्ष्ममापी Rotenone,
इन सांद्रता कि जब यौगिकों अच्छी तरह से में इंजेक्ट कर रहे हैं बनाया जाएगा 10X कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करते हैं. काम कर रहे सांद्रता हैं:
1 उम Oligomycin, 3.0 उम FCCP, 2.0 सुक्ष्ममापी Rotenone
7. मीडिया बदलें और सेल तैयार
8. सेंसर कारतूस लोड हो रहा है
- 37 के लिए गर्म यौगिकों ° सी पहले सेंसर कारतूस लोड हो रहा है और सुई लगानेवाला बंदरगाहों में निम्नानुसार यौगिकों लोड:
- 1-4 कॉलम: लोड 16, 18, और ए, बी और सी बंदरगाहों, क्रमशः में एक्सएफ परख मीडिया (DMEM) के 20 μL.
- 5-12 स्तंभ:
पोर्ट में लोड Oligomycin के 16 μL एक
लोड FCCP के बंदरगाहों बी में 18 μL
लोड Rotenone के बंदरगाहों सी में 20 μL
9. प्रोटोकॉल आदेश
| आदेश | समय (मिनट) | बंदरगाह |
| जांचना | ||
| संतुलित करना | ||
| लूप प्रारंभ | 3X | |
| मिश्रण | 3 | |
| रुकिए | 2 | |
| उपाय | 3 | |
| लूप अंत | ||
| इंजेक्षन | एक | |
| लूप प्रारंभ | 2X | |
| मिश्रण | 3 | |
| रुकिए | 2 | |
| उपाय | 3 | |
| इंजेक्षन | बी | |
| लूप प्रारंभ | 2X | |
| मिश्रण | 3 | |
| रुकिए | 2 | |
| उपाय | 3 | |
| इंजेक्षन | सी | |
| लूप प्रारंभ | 2X | |
| मिश्रण | 3 | |
| रुकिए | 2 | |
| उपाय | 3 | |
| अंत |
टेबल 1. प्रोटोकॉल आदेशों
Discussion
इस परख क्लासिक mitochondrial समारोह जांच प्रयोग से ली गई है और अधिक जटिल प्रयोगों सेल चयापचय, mitochondrial समारोह, और समग्र bioenergetics में विभिन्न परिवर्तनों को समझने के उद्देश्य से निर्माण के साथ एक रूपरेखा के रूप में कार्य करता है.
सभी इस प्रयोग में इस्तेमाल यौगिकों एकाग्रता है कि अधिक से अधिक प्रभाव प्रदान करता है के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. यही कारण है, एक अलग अनुमापन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इन मूल्यों का पता लगाना चाहिए. यह FCCP के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, अनुमापन वक्र के रूप में काफी तेज हो जाता है, और बहुत अधिक FCCP वास्तव ओसीआर में प्रतिक्रियाओं कम कर सकते हैं. विशिष्ट पर्वतमाला (अंतिम सांद्रता) परीक्षण करने के लिए होगा:
- 0,1 - 1,0 / स्नातकीय Oligomycin के एमएल
- 0,1 - 5,0 उम FCCP
- 0,1 - 1,0 उम Rotenone
ध्यान दें कि ऊपर प्रत्येक यौगिक (विशेष रूप से FCCP) करने के लिए प्रतिक्रियाओं परख मीडिया संरचना (आधार प्रकार, [ग्लूकोज], [पाइरूवेट] / BSA की उपस्थिति या अनुपस्थिति, आदि) से प्रभावित हो जाएगा. इसके अलावा, अगर एक्सएफ परख मीडिया संरचना बदल गया है, अनुकूलन के लिए फिर से प्रदर्शन किया जा आवश्यकता होगी. उपस्थिति की एकाग्रता और पाइरूवेट FCCP के लिए अधिक से अधिक श्वसन कारण क्षमता प्राप्त करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. बायोसाइंस Seahorse कोशिकाओं लाइनों की एक संख्या में देखा गया है कि पाइरूवेट की चूक कोशिकाओं की क्षमता के लिए ज़्यादा से ज़्यादा FCCP (आधारभूत ऊपर) जवाब abrogates. आमतौर पर, 1-10 मिमी पाइरूवेट की सांद्रता पाइरूवेट के इष्टतम एकाग्रता को समझने के लिए अधिक से अधिक श्वसन प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. नोट करें कि [पाइरूवेट] और [ग्लूकोज] हो "पार titrated" के प्रयोग के लिए इष्टतम मीडिया शर्तों प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है.
इस प्रयोग की विशिष्ट परिणाम के नीचे एक ओसीआर समय और दूसरे दिखा ECAR समय बनाम बनाम दिखा ग्राफ में प्रस्तुत कर रहे हैं:
चित्रा 2. ओसीआर बनाम समय
चित्रा 3. ECAR बनाम समय
यहाँ हम ओसीआर और ECAR में उम्मीद प्रतिक्रियाओं मनाया के रूप में कोशिकाओं को एक के बाद एक परिसर के साथ इलाज कर रहे हैं. Oligomycin के लिए, ओसीआर mitochondrial परिसर में वी. चूंकि कोशिकाओं OXPHOS के माध्यम से एटीपी synthesize करने में असमर्थ हैं, वे ग्लाइकोलाइसिस पर वापस लौटने के लिए एटीपी के लिए उनकी मांग को पूरा एटीपी संश्लेषण अवरुद्ध का एक परिणाम के के रूप में घट जाती है, इस प्रकार हम ECAR में वृद्धि का पालन करें. जैसा कि पहले दिखाया गया है, FCCP एक uncoupling एजेंट के रूप में कार्य करता है. चूंकि कोशिकाओं अब भीतर mitochondrial झिल्ली भर प्रोटॉन रिसाव पर काबू पाने चाहिए, ओसीआर काफी बढ़ जाती है के रूप में और अधिक O2 के अतिरिक्त प्रोटॉन mitochondrial झिल्ली के पार वापस पंप सेवन किया जाता है. अंत में, rotenone mitochondrial परिसर मैं और परिसर III रोकता है, क्रमशः है, जो इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में संघर्ष का कारण बनता है, और इस तरह O2 की खपत काफी कम है.
चित्रा 4 श्वसन पैरामीटर.
श्वसन और ECAR में उम्मीद परिवर्तनों के अलावा, श्वसन मानकों के एक नंबर इस डेटा से प्राप्त किया जा सकता है. यह उपरोक्त आंकड़े में संक्षेप:
यहाँ हम देखते हैं कि हम कोशिकाओं के बेसल श्वसन, O2 एटीपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटॉन ढाल (एच + रिसाव कारण) को बनाए रखने के लिए समर्पित की राशि के उत्पादन के लिए समर्पित की खपत के प्रतिशत के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. इसके अलावा, हम uncoupled श्वसन (कभी कभी के रूप में स्पेयर श्वसन क्षमता संदर्भित) की शर्तों के तहत अधिक से अधिक श्वसन दर प्राप्त है और अंत में, हम mitochondrial प्रक्रियाओं के कारण नहीं O2 की खपत की राशि निर्धारित कर सकते हैं हो सकता है.
अध्ययन का एक तेजी से बढ़ती संख्या इस mitochondrial प्रोफ़ाइल रोजगार कर रहे हैं सेलुलर bioenergetics का आकलन, mitochondrial रोग की पहचान करने और कोशिकाओं की क्षमता की भविष्यवाणी करने के लिए और / या अपमान तनाव का जवाब. और इस प्रयोगात्मक विधि और स्पेयर सांस की क्षमता के विचार के बारे में अधिक जानकारी जानकारी के लिए, कृपया निम्नलिखित 1-8 प्रकाशनों के लिए उल्लेख देख.
Disclosures
बो जेन्सेन, जॉर्ज डब्ल्यू. रोजर्स, और डेविड ए Ferrick प्रति न्यूनतम वू, बायोसाइंस Seahorse, जो इस लेख में विशेष रुप से प्रदर्शित अभिकर्मकों और इंस्ट्रूमेंटेशन उत्पादन के कर्मचारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
