Summary
細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP -結合型呼吸、プロトンの漏れ、及び予備容量：生成されたミトコンドリアのプロファイルは、1つの実験で測定することができるミトコンドリア機能の4つのパラメータを提供します。
Abstract
細胞代謝を測定し、ミトコンドリアの機能障害を理解する能力は、肥満のミトコンドリアの機能の役割を理解する上で自分の研究を進めるために世界中の科学者、糖尿病、老化、癌、心血管機能と安全性の毒性を有効にしている。
細胞の代謝は、酸素、グルコース、脂肪酸、およびグルタミン、および酵素的に制御された酸化および還元反応の一連を通して、その後のエネルギー変換などの基質の取り込み、のプロセスです。このような細胞外環境への乳酸やCO 2などのATPの生産、熱や化学副産物のリリースでは、これらの細胞内の生化学反応の結果。
酸素消費速度 - - またはOCR細胞の生理的状態、およびそれらのセルの状態の変化に貴重な洞察力は、細胞、ミトコンドリア呼吸の指標で消費される酸素の割合を測定することによって得ることができる。細胞はまた、解糖、すなわちを通じてATPを生成する：酸素の乳酸、独立へのグルコースの変換。培養ウェル内で、乳酸は、プロトンの主要な源である。またはECAR - 培地の酸性化は、細胞外酸性化速度を提供する原因となる細胞を周囲の細胞外培地中に放出陽子、を介して間接的に生成された乳酸を測定する。
この実験では、C2C12筋芽細胞は、タツノオトシゴの細胞培養プレートの所定の密度で播種する。基礎酸素消費量（OCR）と細胞外酸性化（ECAR）のレートは、ベースラインの速度を確立するために測定されます。その後、細胞を代謝的に細胞の生体エネルギープロファイルをシフトする別の化合物（連続）の三添加によって摂動されています。
このアッセイは、ミトコンドリア評価するために古典的な実験から導出され、ミトコンドリアの生理学的および病態生理学的機能の両方を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築するために、ストレスおよび/または侮辱に応答する細胞の能力を予測することでフレームワークとして機能します。
Protocol
この実験では、C2C12筋芽細胞は、タツノオトシゴの細胞培養プレートの所定の密度で播種する。基礎酸素消費量（OCR）と細胞外酸性化（ECAR）のレートは、ベースラインの速度を確立するために測定されます。
1。細胞のインジェクション
細胞は、代謝細胞の生体エネルギープロファイルを移すの異なる化合物の三の追加（連続で）によって摂動されています。一つのグループはコントロール"化合物"として追加されたメディアを実行すると、コントロールとして機能します。
- 最初の注射は、オリゴマイシンです。オリゴマイシンは、F Oの部分はATP合成酵素（複合体V）のプロトンチャネルを遮断することによってATP合成を阻害する。ミトコンドリアの研究では、それは状態3（リン酸化）呼吸を防ぐために使用されます。細胞と、それはATPの合成とミトコンドリア内膜を横切る自然のプロトンリークを克服するために必要な酸素消費量の割合に専念O2消費量の割合を区別するために使用することができます。
- 目の注射はFCCPです。 FCCP（カルボニルシアニド- P - trifluoromethoxyphenylhydrazone）は、モバイルイオンキャリアであるイオノフォアである。それはミトコンドリア膜の代わりに、ATP合成酵素（複合体V）のプロトンチャネルを介して水素イオンを輸送することによってATP合成を中断させるためには、脱共役剤である。ミトコンドリア膜電位のこの崩壊は、ATPの生成なしにエネルギーと酸素の急速な消費につながる。この場合、OCRおよびECARの両方がATPを生成する解糖を使用して、エネルギーバランスを維持するために細胞の試みとして、脱共役によるOCR、およびECARが増加します。
FCCPの治療は、最大限の制御されていないOCRと初期基底OCRとの間の量的な差として定義されているセルの"スペア"呼吸器の容量を計算するために使用することができます。それも、最大限の生理学的または病態生理学的刺激の条件の下でいくつかの予備呼吸容量のメンテナンスは、活力と/または細胞の生存を定義する主要な因子であることが提案されている。増大するエネルギー需要の条件の下でストレスに応答する細胞の能力は、ミトコンドリアの生体エネルギー容量の影響を受けた大部分になります。この生体エネルギー容量は、ミトコンドリアへの基質を提供する細胞の能力と電子輸送に関与する酵素の機能的能力など、いくつかの要因によって決定される - 3回目の注射では、ロテノン、コンプレックスI阻害剤は、細胞に添加される。これは、ミトコンドリアの呼吸をシャットダウンして計算される呼吸に寄与するミトコンドリアと非ミトコンドリア分画の両方を有効にします。細胞はそのエネルギーのバランスを維持するために、より多くの糖の状態に移ると一つはECARの併用増加に伴って、障害ミトコンドリア機能のためにOCRの減少が観察される
ロテノンは、私はユビキノン（コエンザイムQ）にコンプレックス中のFe - Sセンターからの電子の移動を妨げるミトコンドリア阻害剤です。コンプレックスのこの阻害は、私はATPの形で利用可能なエネルギーに変換されるからNADHのポテンシャルエネルギーを防ぎます。
2。試薬および材料
- オリゴマイシン、FCCP、およびロテノンソリューション（タツノオトシゴ水戸ストレステストキット）
- DMEMを実行しているメディア（タツノオトシゴ＃100965〜000）
- DMSO（Sigma社製D8418）
- 蒸留水（ギブコ15230〜170）
- キャリブレーションバッファ（タツノオトシゴバイオサイエンス）
3。成長中
- 500 mLのDMEM（ギブコ11965〜092）
- 10％FBS（Hyclone SH90070.03）
- 5mLのペン/連鎖球菌（ギブコ15140〜122）
- 5mLのピルビン酸ナトリウム（シグマS8636）
- 5mLのグルタミン（ギブコ35050〜061）
4。播種プロトコル
- 細胞/ウェルの増殖培地100μLで10,000個の細胞でXF96細胞培養プレートに播種し、10％CO 2で℃のインキュベーター37に配置されます。
- 細胞は1時間以内XF96細胞培養プレートに付着される。
- 播種後XF96 24時間でアッセイ細胞。
5。アッセイのテンプレートの準備
- アッセイウィザード（付録I）を使用して、次のグループのレイアウトとテンプレートを生成します。
図1。列とグループの割り当てを識別するもグリッドレイアウト
6。化合物の準備
- 次のように、XF DMEMアッセイメディアの次の化合物を準備します。
10μMのオリゴマイシン、30.0μMのFCCP、20.0μMのロテノン、
これらの濃度は、化合物が井戸に注入されるときに行われる10倍の希釈を表しています。使用濃度は以下のとおりです。
1μMのオリゴマイシン、3.0μMのFCCP、2.0μMのロテノン
7。メディアの変化と細胞調製
8。センサーカートリッジのロード
- 37〜暖かい化合° Cの前のセンサーカートリッジをロードし、次のようにインジェクタのポートに化合物をロードする。
- 列1-4：それぞれポートA、B、C、に負荷16、18、およびXFアッセイ培地（DMEM）の20μL。
- 列5-12：
ポートにオリゴマイシンの16μLをロードする
ポートBにFCCPの18μLをロードする
ポートCにロテノンの20μLをロードする
9。プロトコルコマンド
| コマンド | 時間（分） | ポートは |
| 調整する | ||
| 平衡化 | ||
| ループスタート | 3X | |
| ミックス | 3 | |
| 待つ | 2 | |
| 測定 | 3 | |
| ループエンド | ||
| 注入する | A | |
| ループスタート | 2X | |
| ミックス | 3 | |
| 待つ | 2 | |
| 測定 | 3 | |
| 注入する | B | |
| ループスタート | 2X | |
| ミックス | 3 | |
| 待つ | 2 | |
| 測定 | 3 | |
| 注入する | C | |
| ループスタート | 2X | |
| ミックス | 3 | |
| 待つ | 2 | |
| 測定 | 3 | |
| エンド |
表1。プロトコルコマンド
Discussion
このアッセイは、ミトコンドリアの機能を調べるために古典的な実験から導出され、細胞の代謝、ミトコンドリアの機能、および全体的な生体エネルギーの様々な変化を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築することでフレームワークとして機能します。
この実験で使用されるすべての化合物は、最大限の効果を提供する濃度のために最適化する必要があります。つまり、1つは、これらの値を確認するために別々の滴定の実験を実行する必要があります。滴定曲線は非常にシャープになる傾向がある、とあまりにも多くのFCCPは、実際にOCRでの応答を減少させることができるので、これは、FCCPは特に重要です。テストする典型的な範囲は、（最終濃度）のようになります。
- 0.1 - オリゴマイシンの1.0 ug / mlと
- 0.1から5.0μMのFCCP
- 0.1から1.0のUMロテノン
上記の各化合物（特にFCCP）への応答をアッセイ培地組成物（基本型、[グルコース]、[ピルビン酸] BSAの、存在/非存在、など）によって影響されることに注意してください。 XFのアッセイ培地組成が変更された場合、さらに、最適化を再実行する必要があります。プレゼンスとピルビン酸の濃度は、FCCPによる最大呼吸の能力を得ることに特に重要です。バイオサイエンスタツノオトシゴは、ピルビン酸の不作為は、FCCPに（ベースラインの上）に最大限に対応する細胞の能力をabrogatesているセルの行数で観察している。通常は、1〜10 mMのピルビン酸の濃度は、最大呼吸を得るためにピルビン酸の至適濃度を理解するためにテストする必要があります。なお、[ピルビン酸]と[グルコース]実験のための最適培地条件を得るために"クロス滴定"になる必要がある。
この実験の典型的な結果は、OCR対時間と、別表示ECAR対時間を示すグラフで、以下に提示されています：
図2。OCR対時間
図3。ECAR対時間
セルが連続する各化合物で処理されるためここでは、OCRとECARで期待される応答を観察した。オリゴマイシンの場合は、OCRは、細胞がOXPHOSを経由してATPを合成することができないので、彼らはATPに対する需要を満たすために解糖に戻すミトコンドリア複合体VでブロックしてATP合成の結果として減少し、従って我々はECARの増加を観察。前述のように、FCCPは、脱共役剤として作用する。細胞は現在、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンリークを克服する必要があるため、より多くの酸素がミトコンドリア膜を渡って過剰なプロトンをポンプするために消費されると、OCRが大幅に増加します。最後に、ロテノンは、それぞれ、ミトコンドリア複合体Iと複合体IIIを阻害するには、電子伝達系で停止する電子の流れを引き起こすため、O2の消費量が大幅に削減されます。
図4の呼吸パラメータ
呼吸とECARで予想される変化を超えて、呼吸器のパラメータの数はこのデータから得ることができる。これは、上図にまとめられています。
ここで我々は細胞の基底呼吸、ATPの生産と同様にプロトン勾配を（H +リークが原因で）維持に費やさ金額に捧げられた酸素消費量のパーセントについての情報を取得する可能性があることを参照してください。さらに、我々は非連動呼吸（時々予備の呼吸器の容量と呼ばれる）の条件下で最大呼吸速度を取得することができると最終的に、我々は、ミトコンドリアのプロセスによるものでは酸素消費量を決定することができます。
研究の急増は、細胞の生体エネルギーを評価するミトコンドリアの機能障害を特定し、ストレス及び/または侮辱に応答する細胞の能力を予測するために、このミトコンドリアのプロファイルを採用しています。この実験的な方法と予備の呼吸容量の考え方についての詳細情報および詳細については、以下の資料1-8を参照して参照してください。
Disclosures
ボージェンセン、ジョージW.ロジャース、およびDavid A. Ferrick毎分呉は、この記事で紹介試薬や計測機器を生産するバイオサイエンスタツノオトシゴ、の従業員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
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- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
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- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
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