Summary
चिपकने वाला micropatterns है कि सेलुलर वास्तुकला सामान्य दवा के प्रभाव का पता लगाने में संवेदनशीलता में वृद्धि, सुधार reproducibility और स्वचालित छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण सरल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह की तकनीक दवा / siRNA स्क्रीनिंग assays, पारंपरिक सेल संस्कृति का समर्थन करता है पर प्रदर्शन किया और फलस्वरूप अत्यधिक परिवर्तनशीलता सेल के लिए सेल से पीड़ित लाभ होगा.
Abstract
तिथि करने के लिए, सबसे HCA अध्ययन (उच्च सामग्री विश्लेषण) पक्षपाती सेल ऊतक संस्कृति में एक समरूप सब्सट्रेट सूक्ष्म प्लेटें इलाज पर हो लाइनों के साथ किया जाता है. इन शर्तों के तहत, कक्षों फैला है और सेल आकार, आकृति विज्ञान और व्यवहार में निहित परिवर्तनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप सभी दिशाओं में विभाजित है. कुल जनसंख्या के उच्च विचरण सेल के लिए सेल HCA की सफलता, विशेष रूप से नशीली दवाओं के विकास के लिए बाधा उत्पन्न करती. micropatterns की क्षमता को आकार और हर व्यक्ति सेल के आंतरिक polarity के सामान्य इस महत्वपूर्ण 1-2 टोंटी को हल करने के लिए एक जबरदस्त अवसर प्रदान करता है .
का उपयोग करने के लिए और micropatterning प्रौद्योगिकी के उपयोग की सुविधा के लिए, CYTOO micropatterns उपयोग करने के लिए तैयार की एक श्रृंखला, coverslip और microwell प्रारूपों में उपलब्ध विकसित की है. इस वीडियो लेख में, हम CYTOOchip micropatterns, नशीली दवाओं के उपचार, निर्धारण, और धुंधला स्वचालित अधिग्रहण के लिए स्वचालित इमेज प्रोसेसिंग और अंतिम डेटा विश्लेषण पर सेल बोने से सभी प्रक्रियाओं की विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस उदाहरण के साथ, हम वर्णन कैसे micropatterns सेल आधारित assays की सुविधा कर सकते हैं. सेल cytoskeleton के बदलाव समरूप substrates पर सभ्य कोशिकाओं में यों मुश्किल हैं, लेकिन हर कोशिका में कोशिका आसंजन संपर्कों का व्यवस्थित स्थिति के कारण actin meshwork की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संगठन में micropatterns परिणामों पर संवर्धन कोशिकाओं. Intracellular वास्तुकला के इस तरह के सामान्यीकरण actin cytoskeleton पर भी छोटे प्रभाव की मात्रा का ठहराव के रूप में blebbistatin, बातचीत actin-मायोसिन का एक अवरोध करनेवाला का उपयोग प्रोटोकॉल के इन सेट में प्रदर्शन की अनुमति देता है.
Protocol
1. सेल और Micropatterns पर तैयार सीडिंग
- प्लेस एक 6 अच्छी तरह से थाली के 2 स्वतंत्र कुओं में 2 CYTOOchips सुनिश्चित करना है कि आप CYTOOchip के निचले सही कोने में "CYTOO" पढ़ें. Micropatterns Cy3 या Cy5 रंगों के साथ fluorescently लेबल किया जा सकता है. इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया CYTOOChips Cy3 fluorescently micropatterns है लेबल.
चेतावनी: अंधेरे में चिप्स रखें. - Trypsinization द्वारा HELA कोशिकाओं (~ 80% मिला हुआ) ले लीजिए. एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें कि कोशिकाओं को ठीक trypsin उपचार द्वारा बिखरे हैं. 300g में 4 मिनट के लिए कोशिकाओं को ले लीजिए और अपकेंद्रित्र, फिर धीरे कक्ष गोली का resuspend. कोशिकाओं की गणना और पूरा DMEM/F12 संस्कृति मीडिया में 15,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए पतला.
- अच्छी तरह से एक CYTOOchip युक्त प्रत्येक में 4 एमएल (60,000 कोशिकाओं) बग़ैर.
चेतावनी: थाली थोड़ा के रूप में संभव के रूप में में स्थानांतरित किया जाना चाहिए मध्यम में किसी भी घूर्णन आंदोलनों उत्प्रेरण के रूप में इस केंद्र में कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करते हैं जाएगा से बचने के. - चलो हुड के नीचे 10 मिनट के लिए कोशिकाओं तलछट तो उन्हें सेल इनक्यूबेटर करने के लिए कदम. 10-20 मिनट के बाद, कक्षों micropatterns का पालन शुरू कर देंगे. 10 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के अंतर्गत नियमित रूप से जाँच करें.
- जैसे ही कोशिकाओं के रूप में संलग्न है, सेल मध्यम परिवर्तन और धीरे coverslip सतह फ्लश निम्न कार्यविधि का उपयोग करें:
- प्लेट फ्लैट रखते हुए, धीरे से अच्छी तरह से की ओर से एक विंदुक के साथ मध्यम aspirate.
चेतावनी: चिप सूखे से बाहर कभी, इस का मतलब है सभी तरल aspirate कभी नहीं लेकिन पर्याप्त छोड़ने के लिए हर समय CYTOOchip कवर . - 4 एमएल पीबीएस जोड़ें और फिर चिप के केंद्र में पहली बार शुरू तो अच्छी तरह से किनारे करने के लिए आगे बढ़ aspirate. बंद पीबीएस Aspirate के रूप में हवा के लिए चिप उजागर के बिना वर्णित. 3-4 बार दोहराएँ.
- अस्थायी कोशिकाओं के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें:
- यदि अस्थायी कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में रहते हैं, कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराने.
- यदि आप बहुत कुछ कोशिकाओं को देखते हैं, बंद पीबीएस के भाग aspirate और यह 2 एमएल ताजा माध्यम के साथ की जगह. Aspirate और दो बार ताजा माध्यम के 4 एमएल जोड़ने.
- 37 पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस डिग्री सेल्सियस तीन घंटे की एक न्यूनतम के लिए 5% सीओ 2 के साथ कोशिकाओं के प्रसार पूर्ण को प्राप्त करने के लिए अनुमति देने के लिए.
नोट: 10-30 (2000-6500)% micropatterns एक एकल या एकाधिक कोशिकाओं द्वारा कब्जा हो जाएगा के बीच इस पद्धति का उपयोग करके .
चेतावनी: जरूरत के लिए कोशिकाओं धोने कदम है और पूर्ण micropatterns पर कोशिकाओं के प्रसार प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए विशिष्ट हो जाएगा के लिए आवश्यक समय से पहले पालन करने के लिए समय.
2. Blebbistatin उपचार
- 100% DMSO में blebbistatin भंग करने के लिए 17 मिमी के एक शेयर समाधान प्राप्त है. शेयर 100% DMSO के साथ 5 मिमी आगे समाधान पतला. संस्कृति के माध्यम में एक अंतिम कमजोर पड़ने 0.1% DMSO में 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
- नियंत्रण स्थिति के लिए, केवल 0.1% DMSO युक्त माध्यम से 4 एमएल तैयार करते हैं.
- कोशिकाओं पर मीडिया Aspirate और यह 4 एमएल इलाज और नियंत्रण शर्तों के लिए तैयार मध्यम के साथ की जगह.
- 37 में 1hr लिए सेते कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस
3. सेल फिक्सेशन और actin के धुंधला
- सेल निर्धारण के लिए समाधान की तैयारी
Cytoskeleton बफर (सीबी) और 5% पीएफए की तैयारी के लिए अभिकर्मक अनुभाग देखें. सीबी actin filaments और सूक्ष्मनलिकाएं के प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए विशेष रूप से सिफारिश की है.- 1xCB - sucrose की तैयारी: सीबी की 2 एमएल sucrose के 1 ग्राम जोड़ने.
Sucrose के शामिल आंतरिक सेल संरचनाओं के संरक्षण में मदद करता है. - 4% पीएफए - सीबी - sucrose तैयार: गर्म पीएफए 5% के 4 एमएल 1xCB sucrose के एक एमएल जोड़ें.
चेतावनी: यह समाधान 4 डिग्री सेल्सियस कुछ दिनों के लिए ही रखा जा सकता है.
- 1xCB - sucrose की तैयारी: सीबी की 2 एमएल sucrose के 1 ग्राम जोड़ने.
- पीएफए निर्धारण
- CYTOO लोगो और यह जगह पर 6 अच्छी तरह से 4% पीएफए - सीबी - sucrose के समाधान के 2 एमएल युक्त थाली के एक कुएं में CYTOOchip (धोने के बिना) लेने संदंश का प्रयोग करें
- आरटी पर 10 मिनट सेते
- पीएफए - सीबी - sucrose निकालें और पीबीएस के साथ एक बार धोने
- 10 मिनट के लिए 100 मिमी एनएच 4 सीएल के 2 एमएल के साथ एक दूसरे धोने क्रम में अवशिष्ट पीएफए crosslinking गतिविधि बुझाने
नोट: पीएफए तय स्लाइड 4 में कई दिनों ° सी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए organelle धुंधला से पहले के लिए पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है है.
- Triton एक्स 100 के साथ कोशिका झिल्ली के Permeabilization
डिटर्जेंट के साथ कोशिकाओं के Permeabilization एंटीबॉडी या अन्य जांच कोशिका झिल्ली घुसना करने की अनुमति देता है और cytoskeleton प्रोटीन की साइटोसोलिक पूल है कि अन्यथा cytoskeletal पॉलिमर उनके स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए यह मुश्किल बनाने के विपरीत कम कर सकते हैं की कुछ समाप्त.- राष्ट्रीय राजमार्ग 4 सीएल निकालें और 2 एमएल जोड़ें / अच्छी तरह से 0.1% ट्राइटन आरटी पर 3 मिनट के लिए एक्स 100 सीबी
- 2 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धो
- Actin धुंधला
प्रतिदीप्त phalloidin जो देशी actin को बांधता ही actin filamen दाग प्रयोग किया जाता हैटीएस.- 1.5% BSA साथ FITC संयुग्मित पीबीएस में 1:2000 पतला phalloidin की 2 एमएल जोड़ें
- आरटी पर सेते 1 घंटे
- 2 एमएल पीबीएस के साथ एक बार धो
- नाभिक धुंधला
- Hoechst की 2 एमएल जोड़ें (पीबीएस में 1μg / एमएल के साथ दाग)
- आरटी पर 3 मिनट सेते
- 2 एमएल पीबीएस के साथ 2 बार धो
- स्लाइड के बढ़ते
- Mowiol के 25-30 μL या किसी भी अन्य समाधान के बढ़ते उपयोग एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर CYTOO लोगो और माउंट CYTOOchip पर CYTOOchips उठाओ.
4. माइक्रोस्कोप सेटअप और स्वचालित छवि अधिग्रहण
कई इमेजिंग सॉफ्टवेयर संकुल है कि तेजी से स्वचालित छवि के अधिग्रहण और प्रदर्शन के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण मौजूद हैं. इस उदाहरण Metamorph इमेजिंग सॉफ्टवेयर और स्वत: अधिग्रहण Nikon ग्रहण तिवारी एक सीसीडी हमामात्सू कैमरा और एक Intensilight पारा फाइबर प्रकाशक के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर प्रदर्शन कर रहे हैं का उपयोग करता है. छवियाँ 20x बढ़ाई तीन DAPI (नाभिक), Cy 3 (micropatterns) और FITC Phalloidin (actin) इसी तरंगदैर्य में प्राप्त कर लिया हैं. micropatterns की संख्या क्षेत्र प्रति कल्पना कैमरा और उद्देश्य सेटअप के आधार पर अलग अलग होंगे. CYTOO micropatterns बहुत अधिग्रहण की सुविधा चिप भर में एक दूसरे (100 या 130 सुक्ष्ममापी) से परिभाषित अंतराल पर तैनात हैं.
- 20x बढ़ाई चुनें
- ओपन बहुआयामी (मेनू पट्टी में: Apps / बहुआयामी अधिग्रहण) अधिग्रहण और प्रयोग के विभिन्न मानकों सेट:
- तरंग दैर्ध्य की संख्या: 3
- वेवलेंथ प्रकार: DAPI, FITC, Cy3
- पहले कक्षों की एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करके प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए जोखिम समय सेट करें
- Autofocus प्रत्येक तरंग दैर्ध्य पर प्रदर्शन किया जा सकता है है
- का चयन करें जहाँ डेटा को बचाने के के लिए
- Cy3 तरंगदैर्ध्य और कैमरे की स्थिति का चयन करें इतना है कि 12 micropatterns कल्पना और कैमरा क्षेत्र (4 स्तंभों और पैटर्न के 3 पंक्तियों) में केंद्रित हैं.
- एक बहुआयामी अधिग्रहण चलाने पत्रिका बनाएँ. एक पत्रिका बनाने के लिए प्रक्रिया चित्रा 1 में वर्णित है.
- ओपन स्कैन मंच समारोह (मेनू पट्टी में: डिवाइसेज / स्टेज / स्कैन स्टेज). 24 छवियों 20x बढ़ाई प्रत्येक युक्त 12 micropatterns प्राप्त करने के लिए, -400 एक्स कदम आकार और 300 सुक्ष्ममापी वाई कदम आकार सुक्ष्ममापी साथ 6 स्तंभों और 4 पंक्तियाँ दर्ज करें. सेट जर्नल में निष्पादित करने के लिए, पत्रिका MDA.JNL अपलोड करें. फिर स्कैन प्रेस करने के लिए तीन तरंगदैर्य में पूरे ब्लॉक के स्वचालित अधिग्रहण शुरू.
नोट: एक्स और वाई कदम आकार यहाँ संकेत एक कैमरा क्षेत्र में मौजूद micropatterns की संख्या के अनुसार अलग अलग होंगे. अपने मंच पर निर्भर करता है स्थापित है, एक्स और / या वाई दिशा में सही दिशा में आंदोलन के लिए नकारात्मक मूल्यों की आवश्यकता हो सकती है.
5. स्वचालित इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण
कई इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल मौजूद हैं. प्रक्रियाओं रूपरेखा इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण कदम 2 कस्टम बनाया खुला स्रोत प्रोग्राम ImageJ के लिए लिखा मैक्रोज़ द्वारा प्रदर्शन के नीचे वर्णित है. पहली मैक्रो CellRef एक संदर्भ सेल, दूसरा कर्ण उपायों कोशिका झिल्ली की कठोरता पतन / बनाता है. दोनों के माध्यम से अनुरोध पर उपलब्ध हैं www.cytoo.com .
- सभी तीन (मैक्रो CellRef) micropatterns पर केन्द्रित चैनलों के लिए छवि ढेर बनाएँ.
Micropatterns के प्रयोग सेल क्लस्टरिंग और clumping से बचा जाता है, बहुत सरल बनाने स्वचालित इमेज प्रोसेसिंग में पहला कदम है जो स्थानीयकरण और व्यक्ति की कोशिकाओं के विभाजन है. fluorescently लेबल micropattern छवियों को परिभाषित करने के लिए और micropatterns पर केंद्रित क्षेत्रों को परिसीमित करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन क्षेत्रों में तो अन्य चैनलों में अधिग्रहीत छवियों पर transposed हैं और फसली. अनुरूप फसली छवियाँ तो प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए ढेर में इकट्ठा कर रहे हैं. एक आरजीबी के ढेर भी तीन चैनलों (चित्रा 2) के मर्ज से बनाया है. - एकल कक्ष चयन फिल्टर (मैक्रो CellRef) लागू
जैसा कि ऊपर संकेत, micropatterns के 10-30% (2000-6500) एक एकल कक्ष या एकाधिक कक्षों के द्वारा कब्जा कर रहे हैं, जबकि शेष micropatterns खाली हैं. छवियाँ है कि सिर्फ एक एकल कोशिका से कब्जा micropatterns दिखाने का चयन करने के लिए, मैक्रो छवि प्रति नाभिक की संख्या का पता लगाता है और सभी ढेर (RGB और विभिन्न तरंगदैर्य) उन युक्त एक से अधिक नाभिक या कोई नाभिक (चित्रा 3) से समाप्त. - गैर normalized और कोशिकाओं है कि पूरी तरह से micropattern भर नहीं फैला रहे हैं सेल क्षेत्र कट ऑफ का उपयोग कर फ़िल्टर (मैक्रो CellRef) को हटा दें
कोशिकाओं है कि नाभिक फिल्टर से बच होता है, एक और actin के लिए FITC चैनल का उपयोग कर फ़िल्टर विभाजन हटाने के लिए लागू किया जाता है. सेल क्षेत्र की गणना है और एक निश्चित कट ऑफ (2 बार के बारे में सेल interphase सेल क्षेत्र की तुलना में कम क्षेत्रों) नीचे उन सभी के ढेर से हटा रहे हैं. सेल लिफाफा क्षेत्र पैटर्न के आकार से निर्धारित किया जाता है. - सेल छवियों संरेखित (मैक्रो CellRef)
पिछले चरणों से, छवियों एकल micropat युक्तterned कोशिकाओं चयन किया गया था. हालांकि इन छवियों micropatterns पर केंद्रित कर रहे हैं, वे सब पूरी तरह से एक दूसरे से गठबंधन कभी नहीं कर रहे हैं. इमेज प्रोसेसिंग, एक ImageJ प्लगइन (MultiStackReg) समाप्त करने के लिए सभी एकत्र की छवियों और सभी चैनलों micropattern स्थिति के आधार पर फिर से संगठित करने के लिए लागू किया जाता है. यह कदम व्यक्तिगत छवियों कि अब एकल कक्ष विश्लेषण या एक संदर्भ सेल (चित्रा 4) के सृजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता गठबंधन के ढेर उत्पन्न - बिल्डिंग एक संदर्भ सेल (मैक्रो CellRef)
Micropatterns पर बढ़ते कोशिकाओं का मतलब है कि सभी कोशिकाओं के समान आकार है. यह सामान्य एक सटीक और कई सेल छवियों के संरेखण उपरिशायी परमिट. पूरे ढेर पर प्रत्येक छवि में संकेत संक्षेप एक कल्पना और एक "औसत दवा प्रभाव" को मापने की अनुमति देता है. अंतिम समग्र छवि या संदर्भ सेल प्रतिनिधित्व और छवि विश्लेषण के लिए एक अनूठा और उपयोगी उपकरण है और केवल micropatterned कोशिकाओं (चित्रा 4) के साथ प्राप्त किया जा सकता है. ImageJ में, संदर्भ सेल फ़िल्टर और गठबंधन छवियों के एक ढेर से एक प्रक्षेपण बनाकर निर्माण किया है (छवि> ढेर> Z-परियोजना). कई प्रक्षेपण विधियों औसत या अधिकतम तीव्रता के रूप में लागू किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर एक औसत प्रक्षेपण चुना है जो छवि ढेर के मुख्य outliers समाप्त. परिणामों की जांच की सुविधा के लिए, एक LUT (पोशाक टेबल्स देखो) एक आवृत्ति रंग कोडित नक्शे में monocolor छवि परिवर्तित लागू किया जाता है. - मापने और हित के मानकों (मैक्रो कर्ण बढ़ाता)
इस वीडियो लेख में, एल micropatterns क्योंकि फार्म एक एकल प्रमुख तनाव फाइबर में actin cytoskeleton का आयोजन किया जाता है. इस तरह में actin पर प्रकाश डाला, blebbistatin cytoskeleton पर प्रभाव कई मायनों में निर्धारित किया जा सकता है: actin तनाव फाइबर की वक्रता में परिवर्तन, तनाव फाइबर की तीव्रता, लंबाई या मोटाई धुंधला हो जाना, actin filaments के morphometric सुविधाओं में परिवर्तन या मापने कक्ष आकार आदि इन मानकों या तो व्यक्तिगत सेल छवियों पर या अंतिम संदर्भ सेल पर ही मापा जा सकता है.
यहाँ, 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin के प्रभाव ढह कोशिकाओं का उपयोग कर एक दूसरे ImageJ कर्ण नाम मैक्रो (चित्रा 7) की संख्या की गणना के द्वारा विशेषता थी. संक्षेप में, एल micropattern की छवियों thresholded सेल त्रिकोण आकार के एक सैद्धांतिक कर्ण को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है. अगला, actin दाग छवियों के thresholding क्रम में अनुमानित वास्तविक सेल आकार के लिए किया जाता है. सेल त्रिकोण और वास्तविक अवतल कोशिका झिल्ली के सैद्धांतिक कर्ण के बीच के क्षेत्र को मापा जाता है तो. जब सेल ढह चुका है, सैद्धांतिक कर्ण के नीचे एक क्षेत्र प्रकट होता है. ढह कोशिकाओं का प्रतिशत नियंत्रण की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है और शर्तों के इलाज.
6. प्रतिनिधि परिणाम
क्या कोशिकाओं के उदाहरण micropatterns पर की तरह तुरंत देखना चाहिए और महत्वपूर्ण धोने 1.6-1.8 में वर्णित चरणों के बाद कई घंटे, चित्रा 5 में दिखाया गया है. CYTOOchips पर 15 मिनट के बाद, गोल HELA कोशिकाओं बराबर दूरी का संकेत है कि वे fibronectin micropatterns (चित्रा 5a) का पालन किया है पर मनाया जाता है. आसंजन पूरा हो गया है जब कोशिकाओं संस्कृति पोत की कोमल मिलाते बावजूद स्थिर रहते हैं. एकाधिक कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया micropatterns की संख्या को कम करने के लिए, चिप्स तो पीबीएस के साथ प्लावित कर रहे हैं cytophobic क्षेत्रों पर तैर कोशिकाओं को हटाने. कई घंटे के बाद, कोशिकाओं है कि पूरी तरह से micropatterns अधिक फैला रहे हैं चित्रा 5b में दिखाया उन लोगों की तरह दिखेगा.
ठेठ एकल कक्ष blebbistatin निर्धारण, और actin और नाभिक धुंधला के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद प्राप्त छवियों चित्रा 6 में प्रस्तुत कर रहे हैं. एकाधिक छवियों और छवि प्रसंस्करण ImageJ CellRef मैक्रो का उपयोग कर के स्वचालित अधिग्रहण के बाद, एक आवृत्ति रंग कोडित नक्शे उत्पन्न होता है कि actin की तीव्रता सभी सेल छवियों (6c और 6f चित्रा) पर औसत दर्शाया गया है. nontreated और इलाज शर्तों के लिए संदर्भ सेल की तुलना अध्ययन के तहत phenotype के आसान अवलोकन के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता से पता चलता है और सेलुलर दवा प्रभाव की खोज के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
7 चित्रा में एक blebbistatin की कोशिकाओं पर प्रभाव के संभावित विश्लेषण का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. ढह कोशिकाओं की संख्या (एक रिक्त क्षेत्र के साथ सैद्धांतिक कर्ण के तहत मौजूदा ie. कोशिकाओं) 50 नियंत्रण कक्षों में पता चला और 50 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin के साथ इलाज के रूप में ImageJ कर्ण मैक्रो द्वारा पता लगाया कोशिकाओं दिखाया गया है. blebbistatin इलाज आबादी में ढह कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि तनाव फाइबर और इसलिए कक्ष के भीतर actinomyosin सिकुड़ा बलों के blebbistatin निषेध के कारण झिल्ली पर तनाव की छूट को दर्शाता है.
चित्रा 1 Metamorph के साथ एक नई पत्रिका बनाने की प्रक्रिया .
संख्या2. स्वत: छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया के फ्लो चार्ट .
चित्रा 3 एकल कक्षों के बाहर छनन.
चित्रा 4 संदर्भ सेल का निर्माण .
चित्रा 5 सेल बोने. ए) HELA कोशिकाओं निस्तब्धता कदम (4x बढ़ाई) के बाद micropatterns का पालन बी) HELA कोशिकाओं के बाद पूर्ण एल micropatterns (10x बढ़ाई) पर फैल.
चित्रा 6 नियंत्रण और दवा इलाज शर्तों में nonpatterned और micropatterned कोशिकाओं की तुलना. 3 घंटे के लिए HELA कोशिकाओं वरीयता प्राप्त थे और 1 घंटे के लिए 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin (कम पैनल) या अनुपचारित छोड़ दिया (पैनल के ऊपरी) के साथ इलाज किया. नियंत्रण nonpatterned कोशिकाओं (एक), actin एकाधिक फाइबर जो 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin (घ) के साथ इलाज पर imperceptibly जुदा assembles में है. एल micropatterns पर, नियंत्रण कक्ष में एक त्रिकोणीय आकार (ख) को अपनाने और एल के 2 apices nonpatterned कोशिकाओं (घ) के मुकाबले के बीच एक प्रमुख actin फाइबर (तनाव फाइबर) विकसित करने के लिए, blebbistatin एल micropatterned पर एक प्रमुख प्ररूपी परिवर्तन लाती है कोशिकाओं (ई). दवा के प्रभाव और नियंत्रण और इलाज शर्तों की तुलना के प्रत्यक्ष दृश्य संदर्भ सेल 20 कोशिकाओं से निर्मित प्रस्तुति के साथ तेजी से कल्पना कर सकते हैं. व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए इसी प्रकार, एक स्पष्ट और तीव्र तनाव फाइबर नियंत्रण संदर्भ सेल (ग) पर मौजूद है, जबकि blebbistatin कोशिकाओं के पतन और प्रमुख तनाव फाइबर गायब हो जाता है (च) का इलाज किया.
7 चित्रा मैक्रो Hypothenuse का उपयोग कोशिकाओं पर blebbistatin के प्रभाव के एक विश्लेषण के उदाहरण. जबकि नियंत्रण कक्ष के 25% ढह गया, इस 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin इलाज कोशिकाओं को दर्शाती कमजोर actinomyosin सिकुड़ा नेटवर्क (n = 50 कोशिकाओं) में 75% से 3 गुना वृद्धि हुई है.
Discussion
Micropattern के विकल्प
जबकि 5 सुक्ष्ममापी blebbistatin के प्रभाव को मानक संस्कृति का समर्थन करता है पर मुश्किल detectable हैं, कुशल मात्रा का ठहराव micropatterns है कि एक एकल प्रमुख तनाव फाइबर में actin ध्यान केंद्रित पर संभव है. यह सेल पर blebbistatin प्रभाव की सटीक मात्रा का ठहराव सहायता actin cytoskeleton के दृश्य को बढ़ाता है. micropattern आकार का चुनाव परख की डिजाइन में महत्वपूर्ण है और प्ररूपी अध्ययन में डाला जा बदलने के लिए अनुसार बनाया गया.
निष्कर्ष
Micropatterns विशेष रूप से कम मात्रा में और दवा के प्रभाव के दृश्य और मात्रा का ठहराव की सुविधा. सेल आधारित assays के लिए चिपकने वाला micropatterns के साथ समरूप planar substrates के प्रतिस्थापन सटीकता, संवेदनशीलता और डेटा का उत्पादन और गुणवत्ता में सुधार. परिणाम में, कम कोशिकाओं को विश्लेषण के लिए की जरूरत है क्रम में करने के लिए मजबूत सांख्यिकीय परिणामों 3 प्राप्त करने के . चिपकने वाला micropatterns कार्यात्मक अध्ययन में सुधार और कम दवा सांद्रता में प्ररूपी परिवर्तन की खोज के क्रम में विषाक्त या अप्रत्यक्ष रूप से दवा प्रभाव उत्प्रेरण से बचने के लिए एक वास्तविक अवसर प्रदान करते हैं. यदि पर्याप्त स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों का उपयोग किया जाता है, micropatterns जीन / दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में सुधार के लिए दवा कंपनियों की मांग को पूरा कर सकते हैं. है कि विश्लेषण और बढ़ाता सेलुलर घटना के लिए micropatterns शोषण किया है हाल के प्रकाशनों में से कुछ अतिरिक्त उदाहरण 3-13 नीचे उद्धृत कर रहे हैं.
Disclosures
ऐनी Béghin छोड़कर सभी लेखकों CYTOO एसए, जो अभिकर्मकों और इंस्ट्रूमेंटेशन इस अनुच्छेद में फ़ीचर्ड के उत्पादन के कर्मचारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CYTOOchips 20x20 L-M-FN | CYTOO | 10-114 | CYTOOchips are available for adsorption of the protein of your choice |
| PBS 1x | GIBCO, by Life Technologies | 14040-091 | |
| Counting chamber (Kova slide) | Prolabo | 71287.01 | |
| DMEM/F-12 + Glutamax-I | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| FBS (f tal bovine serum) | PAA Laboratories | 31331-028 | |
| Penicillin & Streptomycin | PAA Laboratories | A15-101 | |
| 6 wells-plate | Dutscher | 353046 | |
| centrifuge | Fisher Scientific | M65838 | |
| Microscope | Nikon Instruments | ||
| Cytoskeleton Buffer 1X (CB) | Sigma-Aldrich | MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 | 10 mM MES pH 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| PFA 32 % | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PFA 5% | Mix 10 mL of PFA 32% with 54 mL of CB 1.185X | ||
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| PBS tablets | GIBCO, by Life Technologies | 18912-014 | |
| Bovin serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7806 | |
| Phallodin-FITC | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| H–scht | Invitrogen | H3570 | |
| Blebbistatin | Euromedex | BN0640 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| NH4Cl 0.1M | Sigma-Aldrich | M11209 | |
| Epifluorescent microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD Camera | TBC | TBC | |
| ImageJ Software |  http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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