Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation de la translocation de la PKC dans les cellules vivantes en utilisant PKC fluorescence marqués.

Abstract

La protéine kinase C (PKC) sont des sérine thréonine kinases qui jouent un rôle central dans la régulation d'une grande variété de processus cellulaires tels que la croissance cellulaire et de l'apprentissage et la mémoire. Il ya quatre familles connues des isoformes de la PKC chez les vertébrés: PKC classiques (α, ßi, βII et γ), le type de roman que je PKC (ε et η), le roman de type II PKC (δ et θ), et des PKC atypiques (ζ et ι ). La PKC classiques sont activés par le Ca ^{2 +} et diacylclycerol (DAG), tandis que le roman de PKC sont activées par le DAG, mais sont Ca ^{2 +-indépendante.} La PKC atypiques sont activés par Ca ^{2 +} ni, ni DAG. En Aplysia californica, notre système modèle pour étudier la formation de la mémoire, il ya trois système nerveux spécifiques isoformes de PKC un de chaque grande catégorie, à savoir le traditionnel PKC Apl I, le type de roman que je PKC Apl II et l'atypique PKC Apl III. PKC sont des lipides kinases activées et donc l'activation des PKC classiques et novatrices en réponse aux signaux extracellulaires a été fréquemment corrélée à la translocation de la PKC cytoplasme vers la membrane plasmique. Ainsi, en visualisant la translocation de la PKC dans le temps réel dans des cellules vivantes est devenu un outil précieux pour élucider les voies de transduction du signal qui conduisent à l'activation de PKC. Par exemple, cette technique a permis d'établir que différentes isoformes de la PKC translocation dans des conditions différentes de médiation types distincts de la plasticité synaptique et que la sérotonine (5HT) activation de la PKC Apl II nécessite la production de deux DAG et l'acide phosphatidique (PA) pour translocation ^1-2. Fait important, la capacité de visualiser le même neurone a à plusieurs reprises nous a permis, par exemple, pour mesurer la désensibilisation de la réponse de la PKC dans le détail exquis ^3. Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de cellules Sf9, des cultures de neurones sensoriels aplysie ont été décrites dans un autre article ⁴ vidéo, en exprimant PKC fluorescence marqués dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie et en direct de la translocation de la PKC imagerie en réponse à activateurs différents en utilisant le laser-microscopie à balayage.

Protocol

1. Préparation et entretien des cultures monocouche cellulaire Sf9

1. Sf9 culture cellulaire et de la maintenance est effectuée sous une hotte de culture de tissus.
2. Les cellules Sf9 sont dérivées de cellules de Spodoptera frugiperda l'ovaire (cellules Sf21) et peut être acheté comme cellules congelées dans les médias Grace chez Invitrogen.
3. Placer 8 ml de milieu d'insectes de Grace, complétées (1X), à laquelle 30% de sérum bovin fœtal (FBS) a été ajoutée dans un flacon de ⁷⁵ cm2 de culture cellulaire avec un col incliné.
4. Décongelez le tube congelé des cellules Sf9 rapidement dans un bain à 37 ° C eau en déplaçant le tube avant et en arrière (environ 1-2 minutes).
5. Transfert des cellules Sf9 aux 75 cm ² flacon de culture cellulaire et la plaque de pierre doucement par la main pour distribuer les cellules uniformément.
6. Incuber 1-2 heures à 27 ° C jusqu'à ce que les cellules ont attaché.
7. Retirer ancien milieu et la remplacer par 10 ml de milieu d'insectes freshGrace avec 30% de FBS.
8. Incuber à 27 ° C jusqu'à ce que les cellules sont confluentes.
9. Pour maintenir les cultures en monocouche, retirez ancien milieu du ballon confluentes de cellules Sf9 et ajouter 5 ml de milieu de Grace insectes avec 10% de FBS.
10. Frapper légèrement sur le côté du flacon à plusieurs reprises de se détacher des cellules Sf9.
11. En utilisant une pipette de 10 ml et une pipette, une pipette les médias de haut en bas une fois de douceur, la pulvérisation murale flacon lors du pipetage vers le bas. Transférer les cellules à un tube de 15 ml stériles en polystyrène.
12. Ajouter 2 mL de suspension cellulaire Sf9 à 8 ml de milieu de Grace insectes avec du FBS à 10% (dilution 1:05 de maintenir la phase de croissance logarithmique) dans de nouvelles de 75 cm ² flacon de culture cellulaire et la plaque de pierre doucement par la main.
13. Incuber à 27 ° C jusqu'à ce que les cellules sont confluentes.

2. Expression des PKC par fluorescence Taggé dans des cellules Sf9

1. Pour vivre l'expérience d'imagerie, la culture des cellules Sf9 en 35 mm MatTek disheswith à fond de verre de la culture d'une surface de verre de 14 mm et une épaisseur de lamelle de 0,16 à 0,19 mm.
2. PKC taggés avec des protéines fluorescentes sont exprimés dans des cellules Sf9 en utilisant Cellfectin recommandation II réactif de transfection suivants du constructeur avec les modifications détaillées ci-dessous.
3. Jour 1: Avant de plaquer les cellules, traitent chaque plat avec un milieu de MatTek insectes de Grace avec du FBS à 10% pendant au moins 30 minutes.
4. Comptez cellules Sf9 de l'étape 11 (ci-dessus) en utilisant un hématimètre.
5. Plate 0,05 x 10 ⁶ cellules sur chaque lamelle de verre de MatTek dans un volume total de 150 pi. Laisser les cellules se fixer pendant 30 minutes à température ambiante.
6. Ajouter 2 mL de Grace complété avec 10% de FBS à chaque plat une mL à la fois lentement pour éviter de détacher les cellules.
7. Incuber à 27 ° C pendant la nuit.
8. De ce point, utilisez les recommandations du fabricant pour la transfection de cellules Sf9 avec l'ADN plasmidique.
9. Jour 2: Transfecter cellules Sf9 avec PKC fluorescence marqués en utilisant le réactif de transfection Cellfectin II. Nous avons souvent co-exprimées dans ce système PKC tagués avec améliorée Green Fluorescent Protein (eGFP) et monomères protéine fluorescente rouge (RDRF) (détails pour la construction du plasmide ont été décrits précédemment ^2,5). Expression d'une protéine fluorescente à un moment rendements d'environ 70-80% de cellules exprimant 72 heures post-transfection. La co-expression de deux protéines fluorescentes diminue l'efficacité de transfection à environ 30% de co-expression de cellules. Lorsque co-exprimant eGFP-taggés PKC et RDRF marqués à la PKC, utiliser plus d'ADN plasmidique 2x pour la protéine RDRF-marqués pour l'expression protéique optimal.
10. Jouez en live-imagerie 48-72 heures post-transfection (pour l'expression protéique optimal, attendez 72 heures).

3. Expression des PKC par fluorescence Tagged dans les neurones sensoriels aplysie

1. Préparation des cultures de cellules neuronales aplysie a été décrit dans un article de la vidéo par Zhao et ⁴ collègues.
2. PKC taggés avec des protéines fluorescentes sont exprimés dans les neurones sensoriels aplysie en utilisant la procédure détaillée ci-dessous la microinjection.
3. Préparer une solution stock de 1% Fast Green (FCF) dans l'eau distillée, filtrer à l'aide d'une seringue et une seringue de 28 mm de filtre (0,20 m). Aliquoter et conserver à -20 ° C.
4. Microinjection des neurones sensoriels peuvent être effectuées le jour 1 ou 2 jours après avoir isolé les neurones, mais nous constatons que deux jours d'attente permet de mieux l'adhérence cellulaire à la lamelle.
5. Le jour 2, après l'isolement des neurones sensoriels, décongeler une aliquote de vert rapide et filtrer à nouveau en utilisant une seringue et un 28 mm filtre seringue (0,20 m).
6. Préparer une solution d'ADN plasmidique dans l'eau distillée contenant 0,5% de vert rapide. Les concentrations d'ADN plasmidique aussi élevées que 0,4 ug / uL peut être utilisé mais il est recommandé de ne pas aller au-dessus de ces valeurs.
7. Filtre de l'ADN plasmidique / Fast solution verte en utilisant une seringue de 1 mL et de 4 mm filtre seringue (0,20 m).
8. Centrifuger l'ADN plasmidique / Fast solution verte à 16110 xg pendant 15 minutes à l'aide d'un microrocentrifuge.
9. Préparer électrodes forte pour la microinjection de neurones aide d'un extracteur de microélectrodes (Sutter Flaming / Brown Micropipette Puller, modèle P-97). En utilisant un filament de la boîte, tirez microélectrodes en verre avec 1 mm de diamètre extérieur, 0,75 mm de diamètre intérieur et 100 mm de longueur à l'aide à paroi mince de verre capillaires avec un filament à l'intérieur (World Precision Instruments TW100F-4). Pour plus d'informations sur des électrodes en tirant microinjection s'il vous plaît se référer à l'électrode livre Sutter.
10. Remplissez chaque électrode avec 2 pi d'ADN plasmidique / Fast solution verte en utilisant microloader pointe de la pipette (Eppendorf CA32950-050).
11. Transfert du verre plat en bas de MatTek culture contenant des cultures de neurones aplysie à la station de microinjection.
12. La station de microinjection compose des éléments suivants: une maison étape de grand verre de tenir les boîtes de culture sur une table anti-vibrations (Kinetic Systems poste de travail anti-vibrations), une stéréo-portée avec éclairage halogène externe, un micromanipulateur (Sutter Huxley Micromanipulateur type mur qui permet un positionnement à la fois grossier et ultra-fines dans les trois axes), un porte-microélectrode reliée à une pompe pneumatique (instruments de précision mondiale PV820 pneumatique Pico-pompe). L'entrée de pression de la pompe pneumatique est relié à un réservoir d'azote comprimé.
13. Insérer une microélectrode dans le support de microélectrodes.
14. Voir sous un stéréomicroscope, insérez la pointe de la micropipette dans le noyau cellulaire.
15. Délivrer des impulsions de pression courte de l'azote (10 à 100 ms en durée, 20 lb / po ²⁾ jusqu'à ce que le noyau devient uniformément vert.
16. Incuber les cellules pendant 4 heures à température ambiante et de garder à 4 ° C jusqu'à utilisation. Pour la translocation de PKC optimale, en live-imagerie expérience de 20 à 24 heures après l'injection.

4. Visualisation de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 vie et dans les neurones sensoriels aplysie

1. Pour l'imagerie, nous utilisons un microscope inversé Zeiss LSM510 confocale avec une 200 Axiovert.
2. Imagerie protocole est le même pour les cellules Sf9 et pour les neurones sensoriels aplysie, sauf pour les éléments suivants: les cellules Sf9 sont imagés avec un objectif x63 huile d'immersion alors neurones sensoriels aplysie sont imagés avec un objectif x40 immersion dans l'huile. Les cellules Sf9 sont imagés dans une chambre à température contrôlée maintenu à 26-27 ^° C alors que les neurones sensoriels aplysie sont imagés à la température ambiante maintenue environ 18-20 ^° C.
3. Nous utilisons un laser Argon 30 mW (excitation à 488nm) avec une sortie laser de 50% à l'image de PKC tagués avec protéine EGFP et un laser HeNe (excitation à 543nm) de la PKC Tagged Image avec des protéines RDRF. L'argon et lignes laser HeNe sont atténués à 4% et de sortie de transmission de 50% respectivement avant l'imagerie et le sténopé est ajusté à un.
4. Il est important d'avoir stabilisé la boîte de culture sur la scène d'imagerie et d'éviter tout mouvement ou vibration.
5. Retirer 1 ml de milieux de culture de l'antenne doucement à l'aide d'une pipette 10 ml en laissant 1 ml de volume total dans le plat.
6. Prenez des photos dans la section du milieu des cellules où le noyau peut être vu.
7. Mettre en place une série de temps de 10-20 images confocales de prendre une photo toutes les 30 secondes.
8. Démarrer la série chronologique.
9. Après deux photos sont prises (après le point de temps de 30 secondes), ajouter 1 mL de la drogue (2X la concentration) doucement goutte à goutte au-dessus des cellules à l'aide d'une pipette P1000. Le médicament est ajouté en continu pendant environ 30 secondes.
10. Certains médicaments induisent une translocation rapide qui peut être visible immédiatement un traitement médicamenteux (à la fois le point 60 secondes) tandis que d'autres induisent une translocation lente qui est seulement 5-10 minutes optimale post-traitement (Film 1 et Film 2).
11. Si le médicament doit être emportés, utiliser 2 x 10 ml pipettes pour faire la lessive, le pipetage du tampon de lavage doucement avec une pipette sur un côté du plat et de pipetage jusqu'à les médias de l'autre côté.
12. Si le lavage a été efficace et si l'effet de la drogue est réversible, la PKC retourne vers le cytosol dans les 30-60 secondes.
13. Enregistrer le film en tant que fichier RMLL.
14. Utilisez NIH Image J logiciel pour ouvrir les fichiers LSM et de quantifier les images pré et post traitement médicamenteux. La quantification a été décrit ailleurs ^1.

Discussion

Nous avons décrit une technique pour la translocation des PKC l'image par fluorescence marqués en temps réel dans des cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie. Les cellules Sf9 de fournir un système simple à l'image de translocation de PKC, depuis la culture et de les transfecter est assez simple. En revanche, la micro-injection de neurones sensoriels aplysie prend un certain temps à maîtriser, jusqu'à quelques mois. Difficultés liées à cette technique comprennent colmatage de l'électrode. Filtrage de la solution injectable et la centrifugation permet en général, mais parfois, des bulles d'air peuvent se former dans l'électrode tout en le remplissant. Nous constatons que l'aide de la pipette microloader conseils pour remplir l'électrode au lieu de capillarité permet de minimiser la formation de bulles d'air. Concernant vivons-imagerie, deux facteurs doivent être étroitement contrôlées pendant la session d'imagerie: la température et le mouvement. Les fluctuations de température pourrait affecter la translocation et l'utilisation d'une chambre à température contrôlée devrait être envisagée. Pour éviter tout mouvement lors de l'imagerie, une table anti-vibrations peuvent être utilisés.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis