En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Summary

En este vídeo, se demuestra la visualización de la translocación de la PKC en células vivas mediante PKC marcado con fluorescencia.

Abstract

La proteína quinasa C (PKC) son serina treonina cinasas que juegan un papel central en la regulación de una amplia variedad de procesos celulares, tales como el crecimiento celular y el aprendizaje y la memoria. Hay cuatro familias conocidas de las isoformas de PKC en los vertebrados: PKC clásicas (α, βI, βII y γ), el tipo de novela que PKC (ε y η), la novela de tipo II PKC (δ y θ), y PKC atípicas (ζ y ι ). La PKC clásicas son activados por Ca ^{2 +} y diacylclycerol (DAG), mientras que las PKC nuevas son activadas por DAG, pero son Ca ^{2 +-independiente.} Las PKC atípicas son activados por Ca ^{2 +} ni ni DAG. En Aplysia californica, nuestro sistema modelo para estudiar la formación de la memoria, hay tres isoformas específicas del sistema nervioso PKC uno de cada clase principal, a saber, la PKC convencionales APL I, el tipo de novela que PKC Apl II y de la PKC atípicas APL III. PKC son lípido quinasas activadas y por lo tanto la activación de la PKC clásicas y nuevas en respuesta a señales extracelulares con frecuencia se ha correlacionado con translocación de PKC desde el citoplasma a la membrana plasmática. Por lo tanto, la visualización de la translocación de la PKC en tiempo real en células vivas se ha convertido en una herramienta invaluable para dilucidar las vías de transducción de señales que conducen a la activación de la PKC. Por ejemplo, esta técnica ha permitido que nos permite establecer que las diferentes isoformas de PKC trasladar bajo diferentes condiciones de mediar en distintos tipos de plasticidad sináptica y que la serotonina (5-HT) activación de la PKC Apl II requiere la producción de los DAG y ácido fosfatídico (PA) para translocación ^01/02. Es importante destacar que la capacidad de visualizar la misma neurona en repetidas ocasiones nos ha permitido, por ejemplo, para medir la desensibilización de la respuesta de la PKC en exquisito detalle ^3. En este vídeo, que muestran cada paso de la preparación de Sf9 cultivos celulares, cultivos de neuronas sensoriales Aplysia se han descrito en otro artículo de vídeo ^4, expresando PKC marcado con fluorescencia en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia y en vivo de imágenes de la translocación de PKC en respuesta a activadores diferentes utilizando microscopía de barrido láser.

Protocol

1. Preparación y mantenimiento de cultivos celulares en monocapa Sf9

1. Sf9 cultivo celular y el mantenimiento se lleva a cabo en una campana de cultivo de tejidos.
2. Sf9 células derivan de células de Spodoptera frugiperda ovario (Sf21 células) y se pueden comprar en las células congeladas en la gracia de los medios de Invitrogen.
3. Lugar 8 ml de medio de insectos de Grace, complementada (1X), a los cuales el 30% de suero fetal bovino (FBS) se ha añadido en un 75 cm ² frasco de cultivo celular con el cuello inclinado.
4. Descongelar el tubo congelado de células Sf9 rápidamente en un baño de agua 37 ° C moviendo el tubo de ida y vuelta (1-2 minutos).
5. La transferencia de células Sf9 a los 75 cm ² frasco de cultivo celular y la placa de roca suavemente con la mano para distribuir uniformemente las células.
6. Incubar 1-2 horas a 27 ° C hasta que las células se han unido.
7. Quitar medio viejo y reemplazarlo con 10 ml de medio de insectos freshGrace con FBS al 30%.
8. Se incuba a 27 ° C hasta que las células son confluentes.
9. Para mantener cultivos en monocapa, eliminar viejo medio del matraz confluente de células Sf9 y añadir 5 ml de medio de insectos de Grace con 10% de SFB.
10. Golpee ligeramente en el lado del frasco varias veces para separar las células Sf9.
11. Usando una pipeta de 10 ml y pipeta una, una pipeta de los medios arriba y hacia abajo una vez suavemente, pulverización pared frasco mientras pipeteo hacia abajo. Transferencia de las células a un tubo de 15 ml estéril poliestireno.
12. Añadir 2 ml de suspensión celular Sf9 a 8 ml de medio de insectos de Grace con FBS al 10% (dilución 1:5 para mantener el crecimiento en fase logarítmica) en los nuevos 75 cm ² frasco de cultivo celular y la placa de roca suavemente con la mano.
13. Se incuba a 27 ° C hasta que las células son confluentes.

2. Expresión de la PKC marcado con fluorescencia en células Sf9

1. Para vivir de imágenes de experimento, la cultura Sf9 células en 35 mm MatTek cultura del vidrio disheswith inferior una superficie de vidrio de 14 mm y un espesor cubreobjetos de 0,16 a 0,19 mm.
2. PKC etiquetados con proteínas fluorescentes se expresan en células Sf9 con Cellfectin transfección II recomendación siguiente reactivo del fabricante con las modificaciones que se detallan a continuación.
3. Día 1: Antes de recubrimiento de las células, el tratamiento de cada plato con medio MatTek insectos de Grace con FBS al 10% por lo menos durante 30 minutos.
4. Contador de células Sf9 desde el paso 11 (arriba) con un hemocitómetro.
5. Placa de 0,05 x 10 ⁶ células de cada cubreobjetos MatTek en un volumen total de 150 mL. Permiten a las células para conectar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Añadir 2 ml de Grace suplementado con FBS al 10% para cada plato 1 mL a la vez poco a poco para evitar desprendimiento de las células.
7. Se incuba a 27 ° C durante la noche.
8. A partir de ahora, utilice las recomendaciones del fabricante para la transfección de células Sf9 con el ADN del plásmido.
9. Día 2: transfectar células Sf9 con PKC marcado con fluorescencia utilizando Cellfectin reactivo de transfección II. A menudo hemos co-expresados ​​en este sistema PKC etiquetados con aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) y monomérico proteína fluorescente roja (mRFP) (los detalles de la construcción del plásmido se han descrito previamente ^2,5). Expresión de una proteína fluorescente en un momento en los rendimientos de alrededor del 70-80% que expresan las células 72 horas después de la transfección. Co-expresión de dos proteínas fluorescentes disminuye la eficiencia de transfección de alrededor del 30% co-expresión de las células. Cuando se co-expresando EGFP de etiquetado de la PKC y mRFP etiquetados con PKC, use 2 veces más ADN plásmido para la proteína mRFP-etiquetados para la expresión óptima de proteínas.
10. Tocar en vivo de imágenes de 48-72 horas después de la transfección (para la expresión óptima de proteínas, esperar 72 horas).

3. Expresión de la PKC marcado con fluorescencia en las neuronas sensoriales Aplysia

1. Preparación de los cultivos de células neuronales Aplysia ha sido descrito en un artículo de vídeo por Zhao y ^cuatro colegas.
2. PKC etiquetados con proteínas fluorescentes se expresan en las neuronas sensoriales Aplysia mediante el procedimiento de microinyección se detalla a continuación.
3. Prepare una solución de reserva del 1% Fast Green (FCF) en agua destilada, se filtra con una jeringa y un filtro de jeringa de 28 mm (0,20 m). Alícuota y almacenar a -20 ° C.
4. Microinyección de las neuronas sensoriales se pueden realizar en el día 1 o 2 días después de aislar a las neuronas, pero nos encontramos con que dos días de espera permite que la adherencia celular mejor que el cubreobjetos.
5. El día 2, después del aislamiento de las neuronas sensoriales, descongelar una alícuota de Fast Green y el filtro de nuevo con una jeringa y un filtro de jeringa de 28 mm (0,20 m).
6. Prepare una solución de ADN plásmido en agua destilada que contiene 0,5% Fast Green. Las concentraciones de ADN del plásmido de hasta 0,4 mg / l se puede utilizar, pero no se recomienda ir por encima de estos valores.
7. Filtrar el ADN del plásmido / Fast Green solución con una jeringa de 1 mL y un filtro de jeringa de 4 mm (0,20 m).
8. Centrifugar el ADN del plásmido / Fast Green solución a 16.110 xg durante 15 minutos usando un micrófonorocentrifuge.
9. Preparar electrodos fuerte para la microinyección de las neuronas con un extractor de microelectrodos (Sutter Flaming / Brown Micropipeta Puller, modelo P-97). El uso de un filamento de caja, tirar de microelectrodos de vidrio con 1 mm de diámetro exterior de 0,75 mm de diámetro interior y 100 mm de longitud con paredes delgadas capilares de vidrio con un filamento en el interior (World Precision Instruments TW100F-4). Para obtener más información acerca de tirar electrodos microinyección por favor refiérase a libros de cocina Sutter electrodo.
10. Llene cada electrodo con 2 l de ADN de plásmido / Verde solución rápida utilizando microloader punta de la pipeta (eppendorf CA32950-050).
11. La transferencia de la parte inferior de vidrio MatTek plato de cultivo que contienen cultivos Aplysia neuronal a la estación de microinyección.
12. La estación de microinyección consiste en lo siguiente: una de fabricación casera etapa de vidrio grande para sostener las placas de cultivo en una mesa de aislamiento de vibración (vibración cinética de estaciones de trabajo de aislamiento), equipo de música de alcance con iluminación halógena externa, un micromanipulador (Sutter Huxley Micromanipulador tipo de pared que permite el posicionamiento gruesas y ultra fino en los tres ejes), el titular de microelectrodos conectados a una bomba neumática (Instrumentos del Mundo de precisión neumática PV820 Pico-bomba). La entrada de la presión de la bomba neumática está conectada a un tanque de nitrógeno comprimido.
13. Inserte un microelectrodo en el soporte de microelectrodos.
14. Viendo bajo un microscopio estereoscópico, inserte la punta de la micropipeta en el núcleo de la célula.
15. Entregar pulsos cortos de presión de nitrógeno (10 a 100 ms de duración, 20 lb / in ²⁾ hasta que el núcleo se convierte de manera uniforme verde.
16. Se incuban las células durante 4 horas a temperatura ambiente y mantenga a 4 ° C hasta su uso. Para la translocación de PKC óptima, presentación en vivo de imágenes de experimento 20 a 24 horas post-inyección.

4. Visualización de la translocación de PKC en células Sf9 vida y en las neuronas sensoriales Aplysia

1. Para las imágenes, se utiliza un microscopio confocal Zeiss LSM510 invertido con un Axiovert 200.
2. Imagen del protocolo es el mismo para las células Sf9 y de las neuronas sensoriales Aplysia excepción de los siguientes: Sf9 células son imágenes con un objetivo de aceite de inmersión x63 mientras que las neuronas sensoriales Aplysia son imágenes con un objetivo de inmersión en aceite de x40. Sf9 células son expuestas en una cámara de temperatura controlada mantenida a 26-27 ^º C mientras que las neuronas sensoriales Aplysia son expuestas a temperatura ambiente mantiene alrededor de 18-20 ^º C.
3. Nosotros usamos un 30 mW láser de argón (excitación a 488 nm) con la potencia del láser 50% de la PKC imagen etiquetados con la proteína EGFP y un láser de HeNe (excitación a 543nm) para PKC imagen etiquetados con proteínas mRFP. El argón y láser de HeNe líneas se atenúan y el 4% y el 50% de transmisión de salida, respectivamente, antes de la imagen y el agujero se ajusta a uno.
4. Es importante contar con la placa de cultivo estabilizado en el escenario de imágenes y para evitar el movimiento o vibración.
5. Retire 1 ml de medio de cultivo en el plato suavemente con una pipeta de 10 mL dejando un volumen total de ml en el plato.
6. Tomar fotos en la sección central de las células donde se puede ver el núcleo.
7. Establecer una serie de tiempo de 10-20 imágenes confocal de tomar una foto cada 30 segundos.
8. Iniciar la serie de tiempo.
9. Después de dos fotografías se toman (después del punto de tiempo de 30 segundos), agregar 1 ml de la droga (2X concentración) con suavidad gota a gota en la parte superior de las células con una pipeta P1000. El fármaco se añade de forma continua durante unos 30 segundos.
10. Algunos fármacos inducen un desplazamiento rápido que puede ser visible inmediatamente después del tratamiento de drogas siguientes (en el punto de tiempo de 60 segundos), mientras que otras inducen un desplazamiento lento, que está a sólo unos 50-10 óptima del tratamiento (Película 1 y Película 2).
11. Si el medicamento tiene que ser lavado, el uso de 2 x 10 ml pipetas para hacer el lavado, pipetear el tampón de lavado suavemente con una pipeta en un lado del plato y la pipeta hasta los medios de comunicación en el otro lado.
12. Si el lavado ha sido eficaz y si el efecto de la droga es reversible, PKC vuelve al citosol dentro de 30-60 segundos.
13. Guarde la película como un archivo de LSM.
14. Uso de imágenes NIH J software para abrir los archivos de LSM y cuantificar las imágenes pre y post tratamiento de drogas. La cuantificación se ha descrito en otra parte ^1.

Discussion

Hemos descrito una técnica de translocación de PKC imagen marcado con fluorescencia en tiempo real en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia. Sf9 proporcionar un sistema simple a la translocación de PKC imagen desde el cultivo y la transfección de ellos es bastante sencillo. Por el contrario, la microinyección de las neuronas sensoriales Aplysia toma algún tiempo para dominar, hasta unos pocos meses. Dificultades relacionadas con esta técnica son la obstrucción de los electrodos. Filtrado de la solución inyectable y en general ayuda a la centrifugación, pero a veces las burbujas de aire se pueden formar en el electrodo mientras se llenan. Nos encontramos con que el uso de las puntas microloader pipeta para llenar el electrodo en lugar de capilaridad ayuda a minimizar la formación de burbujas de aire. En cuanto a vivir de imágenes, hay dos factores que estar estrechamente controlados durante la sesión de imágenes: la temperatura y el movimiento. Las fluctuaciones de temperatura pueden afectar el traslado y el uso de una cámara de temperatura controlada debe ser considerado. Para evitar el movimiento durante la exposición, una mesa de aislamiento de vibración se puede utilizar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis