Summary
利用小鼠的皮肤及软组织感染模型，以评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和宿主免疫反应的毒性作用。在这里，我们提出了一个皮肤及软组织感染，皮下感染模型。
Abstract
MRSA是一种全球范围内对公众健康构成威胁，现在占一半以上在美国的所有软组织感染MRSA的皮肤及软组织感染。在软组织感染，肌炎，pyomyositis，坏死性筋膜炎已被越来越多的报道在协会与MRSA从社会中产生的。要了解MRSA和宿主免疫导致更严重的感染之间的相互作用，动物模型的可用性是至关重要的，允许主机和细菌因素的研究。几个感染模型已被引入到评估的S.发病在浅表皮肤感染的金黄色葡萄球菌。在这里，我们描述，检查皮肤，皮下和肌肉病理的皮下感染模型。
Protocol
1。准备葡萄球菌感染（感染前两天）
- 接种的MRSA loopful从股市文化血液琼脂（胰酪胨大豆琼脂（TSA））板。
- 检查血琼脂平板上溶血表型（每个殖民地周围明确区）。
- 选择一个殖民地，与其他实验是一致的，具有溶血性表型。
- 接种3毫升托德休伊特肉汤（THB）的殖民地，与适当的抗生素在必要时，在单元皑皑管15毫升。
- 在37 ° C晃动在220转过夜。
2。准备小鼠感染（感染的前一天）
- 根据老鼠的大小，削去一个3 × 4厘米的面积上的小鼠背部的皮毛。
- 剃光〜5毫米3头发卸妆霜（从当地药店购买）。
- 让头发卸妆霜，在皮肤表面孵育约1分钟。
- DDH 2 O湿纸巾
- 用湿纸巾擦去头发卸妆霜。
3。准备MRSA的感染（感染当天）
- 过夜的细菌培养在1:500到1:1000稀释预热泰铢10毫升，50毫升的螺丝帽管。
- 在37℃孵育，用颤抖的在220转， 直到 540到达2.5℃，约2.5小时。
- 10分钟在3225 XG收集离心MRSA在4 ° C。
- 上清液。
- 细菌沉淀重新悬浮在10毫升贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）。
- 重复步骤3和4。
- 在DPBS细菌沉淀重悬在所需浓度。
- 串行稀释的菌悬液从10 1 10 8。
- 板到血琼脂平板稀释的菌悬液。
- 孵育37℃过夜板。
- 观察和记录溶血性表型的接种。
- 计数菌落形成单位（CFU）数盘上。
- 板CFU数为基础计算的接种。
4。皮下的MRSA感染（感染当天，感染后3天）
- 皮下注入100μL，剃光面积的菌悬液。
- 3至5个小时的观察动物注射后，以确保小鼠还活着。
- 每天观察病变的动物的回，并记录病变区，每日需要的时候。应包括病变的观察记录病灶的大小和形态。皮肤和肌肉病变的定量乘以病变的长度和宽度。需要被分解成更小的对称件，每件用同样的方法测量不规则形的病灶。病变的测量，也可以使用电脑辅助组织形态学评估方案（ImageJ; 开源 http://rsb.info.nih.gov/ij/从美国国立卫生研究院提供）2。
- 异氟醚吸入颈椎脱位，感染后第3天牺牲的动物。
- 观察并记录在皮肤上的病变。
- 尼克的皮肤，一双无菌剪刀。
- 关闭仔细剥离皮肤，观察并记录肌肉病变。
- 切除病灶及周边地区约2 - 5毫米。
- 收集脾和肾。
- 均质使用组织匀浆的组织或反复应用到离心管中含有的组织和100μL的DPBS，从1 mL注射器柱塞。
- 以每管加入900μL的DPBS。
- 涡5分钟的样品。
- 串行稀释与DPBS 10 1至10月6日暂停。
- 在临屋板的稀释悬浮板。
5。代表性的成果：
- 后立即皮下注射，将观察到的气泡在皮肤表面感染时做正确（图1A）。在皮肤表面观察到，如果没有气泡注射过深，这可能会影响感染的结果（病灶的大小，CFU）的。
- 需要连续稀释的菌悬液的CFU需要血琼脂平板上，每个实验研究。这一步将产生重要的信息：1）接种是否有同质化的表型; 2）感染的确切可行的含菌量。
- 可能被评定在不同时间点后感染病灶和细菌生存。在这里，我们审查了感染，感染后第3天。分析病灶大小在皮肤表面（图1b：1X 10 9;图1D：1 × 10 7 CFU）和肌肉表面（图1C：1X 10月9日 7 CFU）。病灶面积等于长度（毫米）x宽（mm）可用于评估组织损伤（图2 A和B）来衡量。这一结果可能有助于确定一个给定的致病因子引起的组织损伤的程度。此外，病灶切除，并在DPBS匀浆，并镀以定量的CFU（图2C），这表明，在感染部位的细菌的可行性。
图1。皮肤和肌肉病变。CD1小鼠皮下接种于一个MRSA（LAC）的侧翼。照片拍摄时间为0，感染后第3天。 （一）时间后感染（PI），（二） - （G）的第3天PI，B，D和F：皮损，C，E和G：肌肉病变，B和C：1X 10月9日 CFU感染; D和E：1 × 10 7 CFU感染; F和G：模拟。
图2。在感染部位，感染后第3天，皮肤和感染MRSA（LAC）的CD1小鼠肌肉病变皮肤病灶的大小和活菌计数。 （一）皮肤病灶的大小。 （二）肌肉病变的大小。 （c）总组织的CFU。 H：1 × 10 9 CFU接种，L：1 × 10 7 CFU接种。 *：P <0.05，Mann - Whitney检验。
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Discussion
- 小鼠的皮肤及软组织感染模型是一个强大的工具，在体内的病原体毒力评估。 s 的致病性皮肤及软组织感染的金黄色葡萄球菌可能会有所不同，取决于一些参数。这些措施包括：接种量，细菌的生长阶段，接种的深入，对小鼠的年龄，和小鼠的遗传背景 7 ，8。研究毒力的功能，使用这种模式时，关键是这些参数控制，以确保结果将是一致的。我们已经研究了几株小鼠，包括SKH1（无毛小鼠），C57BL / 6，BALB / C，和CD1 MRSA皮肤感染。感染的结果因不同菌株7，与其他报告，鼠标的遗传构成是一个重要的决定因素的MRSA感染的 1严重程度一致。在这个实验中，我们利用CD1小鼠，小鼠品系，因为这已被证明是非常适合用于研究的 S. 金黄色葡萄球菌的毒力因子5和小于其他菌株昂贵。
- 为了确保实验的结果是一致的的，感染回升的殖民地，必须检查其溶血表型的每次实验前。绵羊血琼脂培养基上的β-溶血性表型（殖民地周围明确区）反映的α-毒素的表达的S.金黄色葡萄球菌分离。这一步是必不可少的，因为自发突变A S.葡萄球菌全球监管机构已报告发生，导致抑郁症的α毒素表达 6号金黄色葡萄球菌缺乏α-毒素的表达表现出毒性较弱的表型相比，4等基因表达α-毒素株。
- 剃须后关闭的小鼠背部的皮毛，申请剃光面积约5毫米大小的头发卸妆霜（从当地药店购买） 。这一步将保持头发的5至7天回小鼠自由。头发卸妆霜的几种类型的工作，但是，它是重要的选择之一，导致对皮肤有刺激性的最低金额。我们建议用婴儿油头发卸妆霜。
- 注射细菌悬液时，气泡会遵守在皮肤表面（图2A）。当注射过深（没有大疱观察），可能会暂停接种到肌肉，这会影响感染的结果，因为错误的感染部位，病变和皮下组织CFU复苏，鼠标会有所不同。
- 此外病灶的大小和CFU计数，取决于变量也可进行检查，以评估的毒力。这些措施包括细菌的传播，血清细胞因子水平，感染部位的细胞因子和趋化因子水平，PMN的招聘，和组织学3，6 。
- 对于组织学和免疫组织化学分析，可能是受感染的组织切除，并在10％福尔马林固定过夜。 5毫米的健康组织发出的病灶切除受感染的组织，2 - 当需要切病变。这将确保没有深厚的病理组织被省略。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由宝来惠康事业奖和国家卫生部授予AI074832研究院庚寅刘的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Sheep Blood Agar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
References
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