Summary
Murine त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण मॉडल Methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus aureus (MRSA) और मेजबान immunological प्रतिक्रिया की डाह समारोह का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है. यहाँ, हम त्वचा और कोमल ऊतकों के संक्रमण के लिए एक चमड़े के नीचे संक्रमण मॉडल प्रस्तुत किया.
Abstract
MRSA सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक विश्वव्यापी खतरा है, और MRSA के त्वचा और नरम ऊतक संक्रमण अब अधिक संयुक्त राज्य अमेरिका में सभी नरम ऊतक संक्रमण की तुलना में आधे के लिए खाते. नरम ऊतक संक्रमण के अलावा, myositis, pyomyositis, और नेक्रोटाइज़िंग fasciitis के तेजी से किया गया है MRSA के समुदाय से उत्पन्न होने वाली के साथ सहयोग में रिपोर्ट. MRSA और अधिक गंभीर संक्रमण के लिए प्रमुख मेजबान उन्मुक्ति के बीच परस्पर क्रिया को समझने के लिए, पशु मॉडल की उपलब्धता महत्वपूर्ण है, मेजबान और बैक्टीरियल कारकों के अध्ययन की अनुमति है. कई संक्रमण मॉडल एस के रोगजनन का आकलन पेश किया गया है सतही त्वचा संक्रमण के दौरान aureus. यहाँ, हम एक चमड़े के नीचे संक्रमण मॉडल है कि त्वचा, चमड़े के नीचे, और मांसपेशियों विकृतियों की जाँच का वर्णन करता है.
Protocol
1. संक्रमण के लिए MRSA (दो संक्रमण के लिए पहले दिन) की तैयारी
- MRSA के एक शेयर संस्कृति से रक्त (Trypticase सोया अग्रवाल (TSA)) अगर प्लेट loopful टीका लगाना.
- रक्त अगर प्लेट पर hemolysis phenotype (प्रत्येक कॉलोनी के चारों ओर एक स्पष्ट क्षेत्र) की जाँच करें.
- एक बस्ती है कि एक रक्तलायी phenotype है कि अन्य प्रयोगों के साथ संगत है उठाओ.
- 3 एमएल टोड हेविट शोरबा बात (THB) में कॉलोनी, विनियोजित एंटीबायोटिक जब आवश्यक के साथ एक 15 एमएल ट्यूब तस्वीर छाया में, टीका लगाना.
- 37 में सेते डिग्री सेल्सियस 220 rpm पर झटकों के साथ रातोंरात.
2. संक्रमण के लिए चूहे की तैयारी (एक संक्रमण करने के लिए पहले दिन)
- चूहों के आकार पर निर्भर करता है, एक 3 x 4 सेमी क्षेत्र बंद चूहों की पीठ पर फर दाढ़ी.
- मुंडा क्षेत्र ~ 5 मिमी 3 बाल हटानेवाला क्रीम (एक स्थानीय दवा की दुकान से खरीदा) लागू.
- बाल हटानेवाला क्रीम त्वचा की सतह पर लगभग 1 मिनट के लिए सेते हैं अनुमति दें.
- DDH 2 ओ के साथ गीले कागज तौलिये
- गीला कागज तौलिया के साथ बंद बाल हटानेवाला क्रीम साफ कर लें.
3. संक्रमण के लिए MRSA तैयारी (संक्रमण के दिवस पर)
- 1:500 पर 1:1000 करने के लिए एक 50 एमएल ट्यूब पेंच से छाया में पूर्व गर्म THB 10 एमएल के साथ रातोंरात जीवाणु संस्कृति पतला.
- 220 rpm पर मिलाते हुए, जब तक 540 एक 2.5 तक पहुँचता है के साथ डिग्री सेल्सियस लगभग 2.5 घंटे के लिए 37 सेते हैं.
- Centrifugation द्वारा MRSA 4 बजे 10 मिनट के लिए 3225 XG में लीजिए डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 10 एमएल Dulbecco फॉस्फेट में बैक्टीरिया गोली Resuspend खारा (DPBS) buffered.
- चरण 3 और 4 दोहराएँ.
- एक वांछित एकाग्रता में DPBS में बैक्टीरिया गोली Resuspend.
- Serially 8 10 1 10 से जीवाणु निलंबन पतला.
- रक्त अगर प्लेटों पर पतला जीवाणु निलंबन प्लेट.
- 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
- निरीक्षण और inocula के रक्तलायी phenotype रिकॉर्ड.
- थाली पर इकाइयों के गठन कॉलोनी (CFU) की संख्या की गणना.
- Inocula थाली पर CFU संख्या पर आधारित गणना.
4. चमड़े के नीचे MRSA के संक्रमण (संक्रमण के दिन और 3 दिन के बाद संक्रमण पर)
- मुंडा क्षेत्र में subcutaneously 100 μL जीवाणु निलंबन इंजेक्षन.
- इंजेक्शन के बाद यकीन है कि चूहों को जीवित कर रहे बनाने के लिए 3 से 5 घंटे के लिए पशुओं का निरीक्षण.
- पशुओं की पीठ पर घाव दैनिक निरीक्षण और घाव क्षेत्र दैनिक रिकॉर्ड जब यह आवश्यक है. घाव अवलोकन घाव आकार और आकृति विज्ञान की रिकॉर्डिंग को शामिल करना चाहिए. दोनों त्वचा और मांसपेशियों घावों और घाव की लंबाई और चौड़ाई गुणा करके quantitated हैं. अनियमित - आकार घावों के लिए नीचे और छोटे सममित टुकड़ों में टूट हो सकता है, और प्रत्येक टुकड़ा एक ही विधि द्वारा मापा की जरूरत है. , घाव माप भी एक कंप्यूटर सहायता histomorphometric मूल्यांकन (NIH से उपलब्ध खुले स्रोत ImageJ कार्यक्रम का उपयोग कर सकते हैं http://rsb.info.nih.gov/ij/ 2).
- 3 दिन के बाद संक्रमण पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद isoflurane की साँस लेना द्वारा पशुओं का बलिदान.
- निरीक्षण और त्वचा पर घाव रिकॉर्ड.
- निक बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा.
- त्वचा पील बंद ध्यान से और निरीक्षण और मांसपेशियों पर घाव रिकॉर्ड.
- आबकारी घाव और लगभग 2 - आसपास के क्षेत्र के 5 मिमी.
- प्लीहा और गुर्दे लीजिए.
- एक ऊतक homogenizer का उपयोग ऊतकों homogenize या 1 एमएल एक microfuge ऊतक और DPBS के 100 μL युक्त ट्यूब के लिए सिरिंज से एक सवार के दोहराया आवेदन द्वारा.
- प्रत्येक ट्यूब DPBS के 900 μL जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए नमूने भंवर.
- 6 10 10 1 DPBS साथ serially निलंबन पतला.
- प्लेट था प्लेटों पर पतला निलंबन.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
- प्रत्येक उपचर्म इंजेक्शन के तुरंत बाद, एक छाला त्वचा की सतह पर मनाया जा जब संक्रमण सही ढंग से किया है (चित्रा 1 ए). यदि कोई छाला त्वचा की सतह पर मनाया जाता है, इंजेक्शन भी गहरी हो, और हो सकता है इस संक्रमण के परिणाम (घाव आकार, CFU) को प्रभावित कर सकता है.
- जीवाणु निलंबन serially पतला हो की जरूरत है और CFU रक्त अगर प्लेटों पर एक प्रयोग के लिए जांच की जानी चाहिए. यह कदम महत्वपूर्ण जानकारी निकलेगा: 1) क्या inocula सजातीय phenotype है;) 2 सटीक संक्रमण के लिए व्यवहार्य बैक्टीरियल गिनती.
- घावों और बैक्टीरियल अस्तित्व के विभिन्न समय के बाद संक्रमण बिंदुओं पर मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ, हम 3 दिन के बाद संक्रमण पर संक्रमण की जांच की. घाव आकार त्वचा की सतह (9 10 1x चित्रा 1D: चित्रा 1B 1 x 10 7 CFU) पर विश्लेषण कर रहे हैं और मांसपेशियों की सतह (चित्रा 1C पर: 1x 10 9 7). घाव क्षेत्र लंबाई के बराबर होती है (मिमी) x चौड़ाई (मिमी) ऊतकों को नुकसान (2 Figs. और बी) का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है है. इस परिणाम में मदद मिल सकती है ऊतक दिया विषैलापन कारक की वजह से नुकसान की सीमा निर्धारित है. इसके अतिरिक्त, घावों excised हैं और DPBS में homogenized और CFU (चित्रा 2C) संख्या है, जो संक्रमण साइट पर बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का संकेत quantitate चढ़ाया.
चित्रा 1. त्वचा और मांसपेशियों घावों. CD1 चूहों MRSA (एलएसी) के साथ एक पार्श्व पर उपचर्म inoculated थे. चित्र समय 0 और 3 दिन के बाद संक्रमण पर ले जाया गया. (ए) समय 0 के बाद संक्रमण (बगुलाभगत), (ख) - (G) दिवस अनुकरणीय 3, बी, डी और एफ: त्वचा के घावों, सी, ई, और जी: मांसपेशी घावों, बी और सी: 1x 9 10 CFU संक्रमित, डी और ई 10 1x 7 संक्रमित CFU, एफ और जी: नकली.
चित्रा 2. त्वचा घाव आकार और व्यवहार्य बैक्टीरिया संक्रमण साइट पर दिन 3 के बाद संक्रमण त्वचा और MRSA (एलएसी) पर मांसपेशियों CD1 चूहों संक्रमित घावों पर गिनती. (ए) त्वचा घाव आकार. (बी) बलवान घाव आकार. (सी) कुल ऊतक CFU. एच, एल 1 x 10 7 CFU inocula: 1 x 10 9 CFU inocula:. *: <0.05 पी, मान - व्हिटनी परीक्षण.
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Discussion
- murine त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण मॉडल पर एक रोगज़नक़ के vivo डाह मूल्यांकन में लिए एक शक्तिशाली उपकरण है . एस की pathogenicity त्वचा और कोमल ऊतकों के संक्रमण में aureus मानकों की एक संख्या पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं. ये inoculum आकार, बैक्टीरियल वृद्धि चरण, टीका की गहराई, चूहों की उम्र, और माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि 7, 8 शामिल हैं. जब डाह इस मॉडल का उपयोग करते हुए समारोह की जांच, यह इन मापदंडों के लिए नियंत्रित करने के लिए सुनिश्चित करें कि परिणामों के अनुरूप हो जाएगा महत्वपूर्ण है. हम चूहों के SKH1 (गंजा चूहों), C57BL 6 / BALB / ग, और CD1 सहित कई उपभेदों में त्वचा की MRSA संक्रमण का अध्ययन किया है. संक्रमण परिणाम अलग उपभेदों 7, अन्य रिपोर्ट है कि माउस के आनुवंशिक मेकअप MRSA के एक संक्रमण की गंभीरता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है के साथ संगत में बदलती हैं. इस प्रयोग में, हम CD1 चूहों का उपयोग क्योंकि यह माउस तनाव एस के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होना दिखाया गया है aureus डाह 5 कारकों और अन्य उपभेदों से कम खर्चीला है.
- सुनिश्चित करें कि प्रयोगों के परिणामों के अनुरूप हैं, संक्रमण के लिए उठाया कॉलोनी अपनी hemolysis phenotype के लिए जाँच की जानी चाहिए एक प्रयोग करने से पहले. भेड़ रक्त अगर पर बीटा रक्तलायी phenotype (कॉलोनी के चारों ओर एक स्पष्ट क्षेत्र) α विष की अभिव्यक्ति को दर्शाता है एस द्वारा aureus अलग. यह कदम जरूरी है क्योंकि एक एस की सहज उत्परिवर्तन aureus वैश्विक नियामक के लिए होते हैं की सूचना दी है, जिसके परिणामस्वरूप उदास α विष 6 अभिव्यक्ति में एस . α-विष अभिव्यक्ति की कमी aureus isogenic कि 4 व्यक्त α-विष उपभेदों की तुलना में एक कम विषमय phenotype दर्शाती है.
- चूहों के पीछे से फर हजामत बनाने के बाद, मुंडा क्षेत्र के लिए लगभग 5 मिमी 3 आकार बाल हटानेवाला क्रीम (स्थानीय दवा की दुकान से खरीद) लागू होते हैं. इस कदम बालों से 5 से 7 दिनों के लिए मुक्त चूहों के पीछे रखना होगा. बाल हटानेवाला क्रीम के कई प्रकार के काम करेंगे, तथापि, यह एक है कि त्वचा जलन के कम से कम राशि लाती है चुन महत्वपूर्ण है. हम बच्चे के तेल के साथ बाल हटानेवाला क्रीम की सलाह देते हैं.
- जब जीवाणु निलंबन इंजेक्शन, एक छाला त्वचा की सतह पर (चित्रा 2A) मनाया जाएगा. जब एक इंजेक्शन भी गहरी (नहीं छाला मनाया) है, निलंबन की मांसपेशी में inoculated किया जा सकता है, जो गलत संक्रमण साइट की वजह से संक्रमण के परिणाम को प्रभावित करेगा, और घाव और उपचर्म ऊतक से CFU वसूली है कि माउस के लिए अलग अलग हो जाएगा.
- घाव आकार और CFU गिनती के अलावा, आश्रित चर भी डाह का आकलन करने के लिए जांच किया जा सकता है. ये जीवाणु प्रसार, सीरम cytokine स्तर, संक्रमण साइट cytokine और केमोकाइन स्तर, PMN भर्ती, और ऊतक विज्ञान 3, 6 शामिल हैं.
- ऊतक विज्ञान और immunochemistry विश्लेषण के लिए, संक्रमित ऊतक और excised हो सकता है तय रात 10 formalin% में. जब संक्रमित ऊतकों, 2 excising - 5 मिमी स्वस्थ ऊतकों को घाव लग घाव के साथ कटौती की जरूरत है. यह विश्वास दिलाता हूँ कि कोई गहरी वैकृत ऊतकों लोप कर रहे हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक Burroughs-वेलकम कैरियर पुरस्कार और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान AI074832 के GY लियू संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Sheep Blood Agar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
References
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