Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)

Summary

Pele murina e modelo de infecção dos tecidos moles é utilizado para avaliar a função de virulência de Staphylococcus aureus resistente (MRSA) e as respostas imunológico do hospedeiro. Aqui, apresentamos um modelo de infecção subcutânea por infecção da pele e tecidos moles.

Abstract

MRSA é uma ameaça mundial à saúde pública, e MRSA pele e tecidos moles, infecções hoje respondem por mais da metade de todos os tecidos moles infecções nos Estados Unidos. Entre tecidos moles infecções, miosite, piomiosite, e fasceíte necrotizante tem sido cada vez mais relatada em associação com MRSA provenientes da comunidade. Para entender a interação entre MRSA e imunidade do hospedeiro levando a uma maior infecção grave, a disponibilidade de modelos animais é fundamental, permitindo o estudo do hospedeiro e os fatores bacterianos. Modelos de infecção vários foram introduzidas para avaliar a patogênese da S. aureus durante a infecção de pele superficial. Aqui, descrevemos um modelo de infecção subcutânea que examina a pele, subcutâneo e patologias músculo.

Protocol

1. Preparando o MRSA de Infecção (dois dias antes da infecção)

1. Inocular uma loopful de MRSA de uma cultura de ações a um agar sangue (Trypticase Soy Agar (TSA)) prato.
2. Verificar o fenótipo hemólise (uma zona clara em torno de cada colônia) na placa de ágar sangue.
3. Escolha uma colônia que tem um fenótipo hemolítico que é consistente com outros experimentos.
4. Inocular a colônia em 3 mL Todd Hewitt Broth (THB), com o antibiótico apropriado quando necessário, em um tubo de 15 mL snap-tampado.
5. Incubar a 37 ° C durante a noite com agitação a 220 rpm.

2. Preparando o Ratos de Infecção (um dia antes da infecção)

1. Dependendo do tamanho dos ratos, raspar os pêlos fora de uma área de 3 cm x 4 na parte traseira de ratos.
2. Aplicar ~ 5 mm ³ creme removedor de pêlos (comprado de uma loja de droga local) para a área depilada.
3. Permitir que o creme removedor de pêlos para incubar na superfície da pele por cerca de 1 min.
4. Toalhas de papel molhado com DDH ₂ O.
5. Limpe o creme removedor de pêlos com a toalha de papel molhado.

3. Preparando o MRSA de Infecção (no Dia da infecção)

1. Diluir a cultura bacteriana durante a noite em 1:500 para 1:1000 com 10 mL de pré-aquecido THB, em um tubo de 50 mL com tampa de rosca.
2. Incubar a 37 ° C por aproximadamente 2,5 horas com agitação de 220 ​​rpm, até A ₅₄₀ chega a 2,5.
3. Coletar MRSA por centrifugação a 3225 xg por 10 min a 4 ° C.
4. Desprezar o sobrenadante.
5. Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 mL de fosfato salina tamponada Dulbecco (DPBS).
6. Repita os passos 3 e 4.
7. Ressuspender o pellet bacteriano em DPBS na concentração desejada.
8. Serialmente diluir a suspensão bacteriana de ¹⁰ janeiro - 10 agosto.
9. Placa bacteriana diluída a suspensão em placas de agar sangue.
10. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
11. Observar e registrar o fenótipo hemolítico do inóculo.
12. Contar as Unidades Formadoras de Colônias (UFC) número da placa.
13. Calcular o inóculos com base no número de UFC na placa.

4. Infecção subcutânea de MRSA (no Dia da infecção e 3 dias pós-infecção)

1. Injetar por via subcutânea 100 mL de suspensão bacteriana na área raspada.
2. Observar os animais de 3 a 5 horas após a injecção para se certificar de que os ratos estão vivos.
3. Observe a lesão nas costas dos animais diariamente e registrar a área de lesão ao dia, quando ela é necessária. Observação lesão deve incluir a gravação do tamanho da lesão e morfologia. A pele e as lesões musculares são quantificada pela multiplicação do comprimento e largura da lesão. Lesões de formato irregular precisa ser dividido em pequenos pedaços simétricos, e cada peça medida pelo mesmo método. Medições lesão também pode utilizar um assistida por computador programa de avaliação histomorfométrica (ImageJ; open-source disponível a partir do NIH em http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ^2.
4. Sacrifício dos animais no dia 3 pós-infecção por inalação de isoflurano seguido por deslocamento cervical.
5. Observar e registar a lesão na pele.
6. Nick a pele com uma tesoura esterilizada.
7. Descasque a pele fora cuidadosamente e observar e registar a lesão no músculo.
8. A lesão de consumo e cerca de 2-5 mm da área circundante.
9. Coletar baço e rins.
10. Homogeneizar os tecidos utilizando um homogeneizador de tecido ou pela aplicação repetida de um êmbolo de uma seringa de 1 mL para um tubo de microcentrífuga contendo o tecido e 100 mL de DPBS.
11. Adicionar 900 mL de DPBS a cada tubo.
12. Vortex as amostras por 5 min.
13. Serialmente diluir a suspensão com DPBS ¹⁰ janeiro - 10 junho.
14. Placa de suspensões diluídas em placas THA.

5. Resultados representativos:

1. Imediatamente após cada injecção subcutânea, uma bolha será observada na superfície da pele quando a infecção é feito corretamente (Figura 1A). Se nenhuma bolha é observada na superfície da pele, a injeção pode ser muito profunda, e isso pode afetar o resultado da infecção (o tamanho da lesão, CFU).
2. A suspensão bacteriana precisa ser diluída em série e do UFC precisam ser examinadas em placas de ágar sangue para cada experimento. Esta etapa irá fornecer informações importantes: 1) se o inóculo têm fenótipo homogêneo; 2) a contagem de bactérias viáveis ​​exata para a infecção.
3. As lesões e sobrevivência bacteriana pode ser avaliada em vários pontos do tempo pós-infecção. Aqui, nós examinamos a infecção no 3 º dia pós-infecção. Os tamanhos são analisados ​​lesão na superfície da pele (Figura 1B: 1x 10 ^9; Figura 1D: 1 x 10 ⁷ UFC) e na superfície do músculo (Figura 1C: 1x 10 ⁹ 7 UFC). A área de lesão é igual ao comprimento (mm) x largura (mm) podem ser medidos para avaliar o dano tecidual (Figuras 2 A e B). Este resultado pode ajudar a determinar a extensão do dano tecidual causado por um fator de virulência dado. Além disso, as lesões são retirados e homogeneizados em DPBS, e banhado para quantificar o número de CFU (Figura 2C), que indica a viabilidade da bactéria no local da infecção.

Figura 1. A pele e as lesões musculares. CD1 camundongos foram inoculados por via subcutânea em um flanco com MRSA (LAC). Fotos foram tiradas em 0 hora e dia 3 pós-infecção. (A) Tempo 0 pós-infecção (pi), (B) - (G) 3 º dia pi; B, D. e F: lesões de pele; C, E e G: lesões musculares, B e C: 1x 10 ⁹ CFU infectados; D e E: 1x 10 ⁷ UFC infectados; F e G: mock.

Figura 2. Tamanho da lesão de pele e bactérias viáveis ​​contar no local da infecção no 3 º dia pós-infecção de pele. E lesões musculares em MRSA (LAC) CD1 infectados camundongos. (A) tamanho da lesão de pele. (B) tamanho da lesão muscular. (C) CFU tecido Total. H: 1 x 10 ⁹ UFC inóculos; L: 1 x 10 ⁷ UFC inóculos. *: P <0,05, Mann-Whitney.

Discussion

1. A pele de camundongos e modelo de infecção dos tecidos moles é uma ferramenta poderosa na avaliação de virulência in vivo de um patógeno. A patogenicidade de S. aureus na pele macia e infecção dos tecidos podem variar, dependendo de uma série de parâmetros. Estes incluem o tamanho do inóculo, fase de crescimento bacteriano, a profundidade de inoculação, idade dos camundongos, e os antecedentes do mouse genética ^{7, 8.} Ao examinar a função de virulência usando este modelo, é fundamental para controlar esses parâmetros para garantir que os resultados serão consistentes. Estudamos MRSA infecção da pele em várias linhagens de camundongos, incluindo SKH1 (camundongos sem pêlo), C57BL / 6, BALB / c, e CD1. Resultados infecção variam em diferentes linhagens ^7, de acordo com outros relatórios que a composição genética do rato é um importante determinante da gravidade da infecção por MRSA ^1. Neste experimento, utilizamos camundongos CD1, porque esta estirpe do mouse tem se mostrado adequado para estudos de S. fatores de virulência aureus ⁵ e é menos caro do que outras linhagens.
2. Para garantir que os resultados dos experimentos são consistentes, a colônia escolhido para a infecção deve ser verificada pelo seu fenótipo hemólise antes de cada experimento. O fenótipo β-hemolítica em ágar sangue de carneiro (a zona clara em torno da colônia) reflete a expressão de α-toxina pelo S. aureus isolado. Este passo é essencial porque a mutação espontânea de um S. aureus regulador global tem sido relatada a ocorrência, resultando na expressão da toxina α-deprimidos ^6. S. aureus falta α-toxina expressão apresenta um fenótipo menos virulentos em comparação com linhagens isogênicas que ⁴ expressar α-toxina.
3. Após a depilação a pele ao largo das costas de camundongos, aplicar cerca de 5 mm de creme removedor de ³ tamanho do cabelo (compra da loja de droga local) para a área depilada. Esta etapa irá manter as costas de ratos sem pêlos para 5 a 7 dias. Vários tipos de creme removedor de pêlos vai funcionar, no entanto, é importante escolher um que induz a menor quantidade de irritação da pele. Recomendamos cremes removedor de pêlos com óleo de bebê.
4. Ao injetar a suspensão bacteriana, uma bolha será observada na superfície da pele (Figura 2A). Quando uma injeção é muito profundo (sem bolha observado), a suspensão pode ser inoculado no músculo, o que afetará o resultado da infecção por causa do local da infecção errado, e lesão e recuperação CFU partir do tecido subcutâneo de rato que vai ser diferente.
5. Além do tamanho da lesão e contagem de CFU, variáveis ​​dependentes também podem ser examinados para avaliar a virulência. Estes incluem bactérias divulgação, os níveis de citocinas séricas, citocinas e níveis de infecção de sítio quimiocina, recrutamento PMN, e histologia ^{3, 6.}
6. Para histologia e análise imunoquímica, tecido infectado pode ser excisadas e fixadas em formalina a 10% durante a noite. Quando excisão do tecido infectado, 2-5 milímetros de tecido saudável soando a lesão precisa ser cortado com a lesão. Isto irá assegurar que não tecidos profundos patológicos são omitidos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
THB	VWR international	95025-314
DPBS	Invitrogen	21-031-CV
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
27G1/2 needle	BD Biosciences	305109
Sheep Blood Agar (TSA)	VWR international	90004-328