Summary
ITC는 호스트에 리간드의 바인딩을 연구를위한 강력한 도구입니다. 복잡한 시스템에서 그러나, 몇 가지 모델은 동일하게 데이터를 맞을 수 있습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 복잡한 시스템에 적합한 바인딩 모델을 명료하게하다와 해당 열역학적 파라미터를 추출하는 수단을 제공합니다.
Abstract
등온 적정의 열량 (ITC)는 일반적으로 호스트 macromolecule에 리간드의 바인딩과 관련된 열역학적 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다. ITC는 호스트 / 리간드 상호 작용을 공부에 대한 일반적인 spectroscopic 방법을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 공개 또는 두 구성 요소가 상호 작용할 때 흡수 열을 직접 측정 및 외인성 기자가 필요하지 않습니다. 따라서 바인딩 엔탈피 및 협회 상수 (카)가 직접 ITC 데이터에서 얻은되며, entropic 기여를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 등온선의 모양이 C - 가치와 관련된 기계론의 모델에 따라 달라집니다. C - 값으로 정의 C = N [P] tKa 어디로 [P] t는 단백질 농도이며, 여기서 n은 호스트 내에서 리간드 바인딩 사이트의 번호입니다. 대부분의 경우, 특정 리간드에 대해 여러 개의 바인딩 사이트가 아닌 동등하고 ITC는 개별 바인딩 사이트에 대한 열역학적 바인딩 매개 변수의 특성을 허용합니다. 이것은 그러나 올바른 바인딩 모델을 사용해야합니다. 다른 모델은 동일한 실험 데이터를 끼워 넣을 수있는 선택이 문제가 될 수 있습니다. 우리는 이전에이 문제가 C - 값 몇 가지의 실험을 수행하여 피할 수 것으로 나타났습니다. C - 값이 다른에서 얻은 여러 등온선은 별도의 모델을 동시에 맞게됩니다. 올바른 모델은 다음 전체 변수 - C의 데이터 세트에 걸쳐 적합의 장점을 기반으로 식별됩니다. 이 과정은 aminoglycoside 내성 유발 효소 aminoglycoside N - 6' - acetyltransferase - II (AAC (6 ') - II) 여기에 적용됩니다. 우리의 방법론은 어떤 시스템에 적용할 수 있지만,이 전략의 필요성은 더 allostery 또는 cooperativity를 보여주는 macromolecule - 리간드 시스템 시연, 그리고 다른 바인딩 모델은 동일한 데이터에 본질적으로 동일한 맞는를 제공하면됩니다. 우리의 지식, 상용 그런 시스템은 없습니다. AAC (6 ') - II는 두 subunits 사이 cooperativity을 보여주는이 활성화된 사이트를 포함하는 호모 - 이합체입니다. 그러나 C - 값이 하나에서 얻은 ITC 데이터는 적어도 두 가지 모델이 두 세트 - 오브 - 사이트 독립적인 모델과 두 사이트를 연속 (협동) 모델 똑같이 잘 맞지 수 있습니다. 위의 설명과 같이 C - 가치를 변화를 통해, 그것은 AAC에 대한 올바른 바인딩 모델 (6 ') - II는 두 사이트를 순차적으로 결합 모델입니다 설립되었습니다. 여기에, 우리는 ITC의 실험을 수행할 때 가변 C 분석에 적합한 데이터 세트를 얻기 위해 이동해야하는 단계를 설명합니다.
Protocol
1. 재고 솔루션을 준비
- 관심 macromolecule 정화. (다른보고로이 경우에는 aminoglycoside N - 6' - acetyltransferase - II는 (AAC6' - II), 격리됩니다. 13)
- 투석 버퍼의 4리터를 준비합니다. (이 경우에는 우리는 25 MM 4 사용 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, MW 238.3 g / 몰), 2 MM ethylenediaminetetraacetic 초산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), MW 292.2)를 포함, 산도 7.5에서.)
- AAC (6 ') - II 샘플 (400 μm의에서 5 ML)을 사용 투석 버퍼 (3 X 1.3 L)에 dialyzed해야 단백질 Dialyze. 최종 투석 솔루션은 기계를 씻어하고 샘플을 희석하기 위해 보관됩니다.
- 0.45 μm의의 셀룰로오스 필터를 통해 최종 투석 솔루션을 필터, 4 ° C.에 저장된 '실행 버퍼'로 불리는 것입니다
- 실행 버퍼 철저히 씻어서되었습니다 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 단백질 솔루션입니다. 표준 검정 (브래드 포드, 로리, 등) 또는 UV 흡광도를 사용하여 단백질의 최종 농도를 측정합니다. 장기 안정성을 극대화하기 위해 단백질을 저장합니다. (AAC (6의 경우) - II 동결 융해 후 활동을 유지하지 않습니다 ') - II,이 4 저장 ° C. AAC (6 의미')합니다.
- 버퍼를 실행에 4.0 MG를 용해하여 아세틸 보조 효소의 25 MM 주식 솔루션 (AcCoA, 리간드, MW 809.57)의 200μL를 준비합니다. -78 ° C에서 프리즈 사용할 때까지.
- 모든 단백질과 리간드 샘플 농도 무작위 표본 - 투 - 샘플 변동을 최소화하기 위해, 동일한 주식 솔루션에서 발생한해야합니다. 전체 변수 - C 세트에 걸쳐 단백질 농도에 대해 하나의 보정 계수는 분석 조정됩니다. 10
2. 준비 ITC 샘플
- 2 ML의 최종 볼륨 64 C - 값으로 효소 솔루션을 희석. (AAC (6 ') - II의 경우에는이 192 μm의에 해당합니다.)
- 빨리 얼음물에 리간드 (AcCoA) 재고 솔루션을 녹여.
- 0.5 AcCoA 솔루션의 ML보다 10 배 농축 후이 경우에 단백질의 바인딩 사이트의 수를, 버퍼를 실행 420 μL에 AcCoA 주식 솔루션의 80 μL를 diluting을 4 MM. 준비 피펫 작성 튜브로 전송합니다. 신속 -78 ° C.에 AcCoA 주식 솔루션을 반환
- 온도 1 5 분 데가스 단백질과 진공에 따라 솔루션 ° C 원하는 실행 온도 이하 (19 ° C).
3. 주사기 14 설정
- 미리 장착된 주사기 클램프는 홀더와 같은 높이가 될 때까지 주사기 홀더를 통해 사출 주사기를 삽입합니다.
- 그것이 단단히 주사기 홀더의 하단에 반대 누를 때까지 주입 주사기를 통해 두 번째로 주사기 클램프 피드. 부드럽게 제공된 0.050 "공 포인트 16 진수 드라이브와 클램프를 조입니다.
- 피펫 홀더에 주사기 홀더 플레이스.
- 부드럽게 분사 주사기로 피펫 주입기를 슬라이드. 플런저 팁이 주사기의 구멍에 직접 공급되어 있는지 확인하십시오. 일단 완전히 삽입, 피펫 주입기에 주사기 홀더의 고정 칼라를 나사.
4. 샘플 셀 14 로딩
- 버퍼를 실행하는 50 ML 최소 샘플 세포를 세척하고, 오랜 needled 2.5 ML 유리 주사기를 사용하여 남아있는 액체를 제거합니다.
- 천천히 청결하고 건조하게 오래 needled 2.5 ML 주사기로 단백질 샘플 솔루션의 1.8 ML 최소 그려. 모든 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
- 조심스럽게 샘플 세포에 바늘을 삽입하고 부드럽게 세포의 땅에 닿으면. 약간 팁을 올려 (~ 1mm)과 초과 액체 샘플 세포의 맨 위에 표시됩니다 때까지 부드럽게 셀에 AAC (6 ') - II 솔루션을 주입.
- 오버플로의 액체 유지를 확보하면서 천천히 1cm에 대해 바늘을 올립니다. 신속하게 철회 및 샘플 세포에 갇혀있는 거품을 제거하는 솔루션의 소량 (~ 0.25 ML)를 주입.
- 모든 솔루션 오버플로우를 제거합니다. 이것은 부드럽게 샘플 셀로 오버플로우의 측면을 따라 바늘을 슬라이딩에 의해 이루어진다. 주사기 팁이 난간에 타격을 줄 것으로 예상된다, 이것은 실행 솔루션을위한 욕망의 높이입니다. 이 라인 위에 앉아 모든 액체를 제거합니다.
5. 주사 주사기를 로딩하고 실행 14 시작
- 입력 포트에 플라스틱 튜브 로딩 주사기를 연결합니다.
- 입력 포트의 상단에 낮은 플런저 팁.
- 피펫 홀더의 하단에있는 피펫 작성 튜브 AcCoA 솔루션을 놓습니다. 주사기 팁은 충전 튜브의 아래쪽을 만지지 않습니다.
- 작은 금액은 로딩 주사기의 튜브를 입력하기 전까지 천천히 주사기에 솔루션을 그립니다.
- 닫기 채우기 포트 버튼 플런저 팁을 클릭을 낮추는 방법으로 채우기 포트를 닫습니다. 모든 기포를 제거하기 위해 정리 -> 리필 버튼을 3 번 클릭하여 정화 및 리필은 로딩하는 동안 갇혀있다가 수.
- 피펫 홀더에서 작성 튜브를 제거하고 부드럽게 주사기 팁 닦으십시오.
- 샘플 셀로 피펫 조립 및 부드럽게 낮은 주사기를 가져가라. 주사기 쉽게 구부 수 서서히 진행, 훌륭한 치료가 필요하는 것입니다. 주사기가 완전히 옷깃을 잠금의 기반 아래로 눌러 삽입되었는지 확인하십시오.
- 원하는 실행 온도를 (이 경우 20 ° C에서) 설정하고 (이 경우 20μcal/sec)를 예상되는 최대 사출 열 흐름보다 약간 큰 참조 전원을 선택합니다.
- 원하는 분사 볼륨 및 지연 프로그램. (이 경우에는, 28 주사이 고용되었습니다. 첫 번째 주사는 60의 지연 2 μL의 볼륨을했다. 모든 후속 주사는 330의 지연 10 μL의 볼륨을했다.)
6. 후속 실행
- 모든 후속 실행에 2,4,8,16의 요소에 의해 AAC (6 ') - II 및 AcCoA의 농도를 감소하면서, 단계 2-5를 반복하고, 32.
7. 데이터 분석
- 전세계적으로 바인딩 매개 변수의 하나의 설정 등온선을 모두 맞는 맞는 프로 시저를 사용하여로 이전 10 설명했다.
8. 대표 결과
대표 데이터는 그림 1에 표시됩니다. 등온선의 모양은 농도에 따라 달라질 것입니다. 선명 전환이 높은에 대한 예상되는 C - 값 (즉, 높은 단백질과 리간드의 농도) (그림 2).
AAC (6 ') - II의 경우, 두 사이트 순차 모델 조절 stoichiometries와 동일, 독립 사이트의 두 세트를 설명하는 하나보다 더 잘 맞는를 제공합니다.
그림 1. AAC (6 ') - II (192 μm의)에 AcCoA의 적정 (3.86 ㎜)에 의해 만들어진 등온선. A) 원시 ITC 추적. B) 2 사이트 순서에 맞게 (와 바인딩 매개 변수 (사각형) 결정에 사용되는 통합 값 -).
AcCoA에 대한 그림 2. ITC의 등온선은 다양한 농도에서 AAC (6 ') - II에 titrated. 실험 데이터 (오픈 원가) 2 세트 - 오브 - 사이트 독립적인 모델 (점선 마젠타) 및 2 현장 연속 모델 (고체 파란색)에 맞는. 2 - 사이트 sequentional 모델은 분명히 더 나은 전반적인 계약을 제공합니다. 고용 농도) 6 μm의, 0.25 MM, B) 12 μm의, 0.25 MM, C) 24 μm의 0.5 MM, D) 48 μm의, 1.0 MM, E) 96 μm의, 1.9 MM, 그리고 F) 196 μm의,되었다 각각 AAC (6 ') - II 및 AcCoA에 대한 3.86 MM.
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Discussion
가변 C 피팅이 분석 부분은 이전에 자세하게 설명 10했습니다. 여기 우리는이 접근 방식에 적합한 가변 - C 데이터 세트를 수집 실용적인 측면을보고합니다. 그것은 모든 단백질과 리간드 샘플이 동일한 주식 솔루션에서 도출되는 중요합니다. 따라서 충분한 재고 솔루션 실험 시리즈 전체를 완료하는 데 처음에 준비하는 것이 중요합니다. 이것은 AAC의 비율 (6 ') - II를 보장하고 AcCoA 모든 실험 중 일정 및 샘플 - 투 - 샘플 기준 농도 임의의 변동을 줄일 수 있습니다.
이 경우에는 많은주의가 리간드의 처리에 촬영해야합니다. 그것이 주식 솔루션은 시간이 매우 짧은 기간 동안 액체 상태 것이 중요하므로 AcCoA는 솔루션에서 화학적으로 불안정합니다. 해당 금액이 주식 솔루션에서 aliquoted되면 주가는 즉시 refrozen해야합니다. 이것이 완료되지 않으면 다음 AcCoA은 시간이 지남에 따라 저하 수 있으며 농도는 나중에 실행에 해결되지 않습니다. 일단 aliquoted, AcCoA 샘플은 즉시 사용해야합니다. 불안 단백질의 경우, 유사한주의가 필요합니다.
이 절차는 쉽게 다른 복잡한 시스템을 연구 수정할 수 있습니다. 사용된 10 농도는 특정 시스템의 바인딩 상수 적응해야합니다. 8,10 약 1과 1000 사이의 값을 C의 넓은 범위에 걸쳐 데이터 세트가 필요합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 캐나다 보건 연구소 연구 (CIHR), 국립 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 그리고 CIHR 교육 교부금 장학금 (LF)를 지원했습니다. 우리는 AAC를위한 교수 제라드 D. 라이트 (맥매스터 대학, 캐나다) (6) - II의 표현이 플라스미드 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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