Summary
המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.
Abstract
Calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי (ITC) משמש בדרך כלל כדי לקבוע פרמטרים תרמודינמיים הקשורים מחייב של ליגנד כדי מקרומולקולה המארח. המרכז לטניס בישראל יש כמה יתרונות על פני הגישות ספקטרוסקופיות משותף לחקר המארח / אינטראקציות ליגנד. לדוגמה, החום שוחררו או נספג כאשר שני המרכיבים אינטראקציה נמדדת ישירות ואינו דורש כל הכתבים אקסוגניים. לפיכך אנתלפיה מחייב את העמותה קבוע (קה) מתקבלים נתונים ישירות מן המרכז לטניס בישראל, והוא יכול לשמש כדי לחשב את התרומה entropic. יתר על כן, את הצורה של האיזותרמה תלויה ערך-c לבין מודל מכניסטית מעורב. C-ערך מוגדר c = n [טז] tKa, שם [טז] לא הוא ריכוז חלבון, n הוא מספר אתרי קשירה ליגנד בתוך הפונדקאי. במקרים רבים, אתרי הקישור מרובים עבור ליגנד מסוים הם לא שוות ערך המרכז לטניס בישראל מאפשר אפיון של פרמטרים תרמודינמיים מחייב עבור כל אתר קשירה יחיד. אולם זה דורש כי המודל מחייב נכונה לשמש. בחירה זו יכולה להיות בעייתית אם דגמים שונים יכולים להתאים את נתוני הניסוי אותו. הראינו בעבר כי בעיה זו ניתן לעקוף על ידי ביצוע ניסויים בכמה c-ערכים. איזותרמות מספר המתקבל שונה c-ערכים ראויים בו זמנית מודלים נפרדים. המודל הנכון הוא זיהה הבא מבוסס על בטוב להתאים לרוחב במערך את המשתנה-c כולו. תהליך זה מיושם כאן כדי aminoglycoside התנגדות גורמי aminoglycoside האנזים N-6'-acetyltransferase-II (AAC (6 ')-II). אף על פי המתודולוגיה שלנו הוא ישים לכל מערכת, הצורך של אסטרטגיה זו באה לידי ביטוי טוב יותר עם מערכת מקרומולקולה-ליגנד המראה allostery או cooperativity, וכאשר מודלים שונים מחייב לספק מתאים זהה במהותו אל אותם נתונים. למיטב ידיעתנו, אין מערכות כאלה זמינים מסחרית. AAC (6 ')-II, הוא הומו-דימר המכיל שני אתרים פעילים, מראה cooperativity בין שתי יחידות משנה. עם זאת נתוני המרכז לטניס בישראל להשיג בחנות אחת c-ערך יכול להיות מתאים באותה מידה לפחות שני דגמים שונים מודל עצמאי של שני סטים של אתרי וכן שני רציפים באתר (שיתופית) מודל. באמצעות שינוי c-ערך כפי שהוסבר לעיל, נקבע כי המודל הנכון עבור מחייב AAC (6 ')-II הוא מודל דו אתר הקישור רציפים. בזאת, אנו מתארים את הצעדים שיש לנקוט בעת ביצוע ניסויים המרכז לטניס בישראל על מנת לקבל ערכות נתונים מתאים משתנה ג ומנתחת.
Protocol
1. הכנת פתרונות מניות
- לטהר את מקרומולקולה של עניין. (במקרה זה, aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-II (AAC6'-II), מבודד כפי שדווח במקום אחר. 13)
- הכן 4 ליטרים של חיץ דיאליזה. (במקרה זה השתמשנו 25 מ"מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, MW 238.3 g / mol), המכיל חומצה 2 mM ethylenediaminetetraacetic (EDTA, MW 292.2), ב-pH 7.5).
- Dialyze החלבון המדגם (6 ') II-AAC (5 מ"ל ב 400 מיקרומטר) המשמש חייב להיות dialyzed במאגר דיאליזה (3 x 1.3 ל'). הפתרון הסופי דיאליזה נשמר לשטוף את המכונה לדלל דגימות.
- סנן הפתרון הסופי דיאליזה דרך מסנן תאית 0.45 מיקרומטר, ומאוחסנים ב 4 ° C. יהיה המכונה "חיץ ריצה"
- חלבון פתרון סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק אשר כבר השטיפה עם חיץ פועל. מדדו את הריכוז הסופי של החלבון באמצעות assay סטנדרטי (ברדפורד, לאורי, וכו ') או ספיגת UV. אחסן את החלבון על מנת למקסם את יציבות לטווח ארוך. (במקרה של AAC (6 ')-II, משמעות הדבר היא אחסון ב 4 ° C. AAC (6')-II אינו שומר פעילות לאחר מקפיא הפשרה).
- הכן 200μL של פתרון 25 מ"מ מניות של אצטיל קואנזים A (AcCoA, ליגנד, MW 809.57) על ידי המסת 4.0 מ"ג פועל חיץ. להקפיא ב -78 ° C עד מוכן לשימוש.
- כל חלבון דגימות ליגנד חייב מקורן הפתרונות מניות זהה, כדי למזער מדגם אקראי ל-מדגם התנודות בריכוז. גורם תיקון יחיד עבור ריכוז החלבון על פני כולו משתנה ג במערך מותאם בניתוח. 10
2. המרכז לטניס בישראל דגימות הכנת
- לדלל את התמיסה אנזים לערך-c של 64 עם נפח סופי של 2 מ"ל. (במקרה של AAC (6 ')-II, הדבר מקביל ל 192 מיקרומטר).
- במהירות ההפשרה (AcCoA) ליגנד מניות פתרון במי קרח.
- הכן 0.5 מ"ל של פתרון AcCoA 10 פעמים יותר מרוכז ואז את מספר אתרי הקישור על החלבון, במקרה זה 4 מ"מ, על ידי דילול של 80 μL פתרון המניות AcCoA ב 420 μL של הפעלת המאגר. העברת לתוך צינור טפטפת מילוי. לחזור במהירות את הפתרון מניות AcCoA ל -78 ° C.
- דגה החלבון ופתרונות תחת ואקום עבור 5 דקות בטמפרטורה של 1 ° C מתחת לטמפרטורת הריצה הרצוי (19 ° C).
3. הגדרת את המזרק 14
- הכנס את המזרק הזרקה באמצעות מזרק בעל עד מהדק מזרק מראש רכוב הוא באותו גובה כמו בעל.
- להאכיל את מהדק המזרק השני על המזרק להזרקת עד נלחץ בנחישות נגד בתחתית מחזיק את המזרק. בעדינות להדק את מהדק עם סיפק 0.050 "דרייב פוינט Ball Hex.
- המקום מחזיק מזרק לתוך מחזיק פיפטה.
- החלק בעדינות את פיפטה מזרק לתוך מזרק את הזריקה. ודא את קצה הבוכנה מוזן ישירות לתוך החור של המזרק. לאחר מוכנס באופן מלא, לדפוק את הצווארון נעילה של בעל מזרק לתוך מזרק פיפטה.
4. טוען התא מדגם 14
- לשטוף תא דגימה עם מינימום של 50 מ"ל של ריצה חיץ, ולהסיר כל נוזל הנותרים באמצעות ארוכי מחט מזרק זכוכית 2.5 מ"ל.
- לאט לאט למשוך מינימום של 1.8 מ"ל של תמיסת חלבון מדגם לתוך מזרק נקי ויבש 2.5 ארוכי מחט מ"ל. היזהר שלא להציג את כל הבועות.
- בזהירות להכניס מחט בתא מדגם ולגעת בעדינות את החלק התחתון של התא. הרם מעט קצה (~ 1 מ"מ) בעדינות להזריק AAC (6 ')-II פתרון לתוך התא עד נוזל עודף גלוי מעל החלק העליון של התא המדגם.
- לאט לאט להעלות את המחט על 1 ס"מ תוך הבטחת נשאר נוזלי הצפת. מהר לסגת להזריק כמות קטנה של פתרון (~ 0.25 מ"ל) כדי להסיר כל הבועות לכוד בתא המדגם.
- הסר את כל העודפים פתרון. זו מושגת על ידי מחליק בעדינות את המחט בצד של גלישה אל תוך התא המדגם. קצה המזרק יפגע אדן, זהו גובה השאיפה לפתרון פועל. הסר את כל נוזל אשר יושב מעל קו זה.
5. טוען מזרק זריקה וייזום לרוץ 14
- צרף את מזרק פלסטיק טעינת צינור ליציאת למלא.
- הבוכנה בקצה התחתון לחלק העליון של הנמל למלא.
- מניחים את הפתרון AcCoA בצינור טפטפת מילוי בחלק התחתון של בעל פיפטה. קצה המזרק לא צריך לגעת בתחתית צינור המילוי.
- לאט לאט למשוך את הפתרון לתוך המזרק עד כמות קטנה נכנס הצינור של מזרק הטעינה.
- סגור את יציאת למלא על ידי הפחתת קצה הבוכנה ולחץ על כפתור נמל סגור את מילוי. טהר ולמלא, על ידי לחיצה על כפתור הטיהור-> דיו, 3 פעמים כדי להסיר בועות אוויר שאולי להילכד במהלך הטעינה.
- הסר את צינור מילוי מבעל פיפטה ו לנגב בעדינות את קצה המזרק.
- קח הרכבה פיפטה ו מזרק בעדינות נמוך לתוך התא המדגם. המשך לאט כמו המזרק יכול בקלות לכופף, ולכן יש צורך בזהירות רבה. ודא את המזרק מוכנס כהלכה על ידי לחיצה על הבסיס של נעילה צווארון.
- קביעת הטמפרטורה הרצויה פועל (במקרה זה 20 ° C), ובחר כוח התייחסות כי הוא מעט גדול יותר זרימת החום המרבי הזרקת הצפוי (ב 20μcal/sec במקרה זה).
- תוכנית הזרקת כמויות הרצוי ועיכובים. (במקרה זה, 28 זריקות הועסקו. הזריקה הראשונה בהיקף של 2 μL עם עיכוב של 60. זריקות כל הבאים היו כרכים של μL 10 עם עיכובים של 330.)
6. לאחר הפעלת
- בסך הכל מפעילה הבאים לחזור על שלבים 2-5, תוך הפחתת AAC (6 ') ו-II ריכוזי AcCoA בפקטור של 2,4,8,16, ו 32.
7. ניתוח נתונים
- השתמש הליך ראוי אשר מתאים לכל גלובלי של איזותרמות כדי להגדיר אחד הפרמטרים מחייב, כפי שתואר לעיל 10.
8. נציג תוצאות
נציג נתונים מוצגים באיור 1. הצורות של איזותרמות אמור להשתנות עם ריכוז. מעברים חדים צפויים יותר עבור c-ערכים (כלומר חלבון גבוהה ריכוזי ליגנד) (איור 2).
במקרה של AAC (6 ')-II, הדגם שני רציפים האתר נותן בכושר טוב יותר מאשר אחד מתאר שתי מערכות, אתרי זהות עצמאית עם stoichiometries מתכווננת.
באיור 1. איזותרמות המיוצר על ידי טיטרציה של AcCoA (3.86 mM) לתוך AAC (6 ')-II (192 מיקרומטר). א) זכר גלם המרכז לטניס בישראל. ב) ערכים משולבים המשמשים לקביעת פרמטרים מחייבים (ריבועים) עם בהתקף 2-אתר רציפים (-).
2. איור איזותרמות המרכז לטניס בישראל עבור AcCoA טיטרציה לתוך AAC (6 ')-II בריכוזים שונים. נתוני הניסוי (עיגולים פתוח) היו לנכון מודל עצמאי 2 סטים של אתרי (מג'נטה מקווקו) לבין מודל 2-אתר רציפים (כחול מוצק). מודל 2-אתר sequentional בבירור נותן הסכמה כללית טובה יותר. הריכוזים היו מועסקים) 6 מיקרומטר, 0.25 מ"מ, B) 12 מיקרומטר, 0.25 מ"מ, ג) 24 מיקרומטר, 0.5 מ"מ, ד) 48 מיקרומטר, 1.0 מ"מ, E) 96 מיקרומטר, 1.9 מ"מ, ו-F) 196 מיקרומטר, 3.86 מ"מ, עבור AAC (6 ') ו-II AcCoA בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חלק זה של הניתוח משתנה-c הולם תוארה בעבר בהרחבה 10. כאן אנו מדווחים על ההיבטים המעשיים של איסוף משתנה ג מערכי נתונים מתאים לגישה זו. זה חיוני כי כל חלבון דגימות ליגנד לקוחים הפתרונות מניות זהה. לכן חשוב כי המניה מספקת פתרון מוכן בתחילה כדי להשלים את הסדרה כולה של ניסויים. זה מבטיח את היחס של AAC (6 ') ו-II AcCoA הוא קבוע בין כל הניסויים, ומפחיתה תנודות אקראיות בריכוז על בסיס מדגם-to-מדגם.
במקרה זה, הטיפול חייב להילקח הרבה בטיפול של ליגנד. AcCoA אינו יציב מבחינה כימית בפתרון כל כך חיוני כי הפתרון המניה נשאר נוזלי למשך פרקי זמן קצרים מאוד. לאחר הכמות המתאימה היא aliquoted מפתרון המניות, המניה חייבת להיות מיידית refrozen. אם זה לא נעשה, אז AcCoA עלול לבזות לאורך זמן ריכוזים לא יהיה נכון רץ מאוחר יותר. לאחר aliquoted, דגימות AcCoA יש להשתמש מיד. במקרה של חלבונים, כי הם לא יציבים, אמצעי זהירות דומה יהיה צורך.
הליך זה ניתן לשנות בקלות ללמוד מערכות מורכבות אחרות. 10 ריכוזי בשימוש צריך להיות מותאם הקבועים מחייב של מערכת ספציפית. מגוון רחב של ערכי c בין 1 ו - 1000 על 8,10 נדרש על בסיס הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הקנדי מחקר (CIHR), הלאומית למדע וההנדסה מועצת המחקר (NSERC), וכן להעניק הכשרה CIHR מלגה (אל LF). אנו מודים פרופ 'ג'רארד ד רייט (אוניברסיטת מקמאסטר, קנדה) עבור AAC (6) II-פלסמיד ביטוי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. ksana, J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. ITC Data Analysis in Origin. , 7 edn, MicroCal. (2004).
