Summary
आईटीसी अपने मेजबान के लिए एक ligand के बंधन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. जटिल प्रणालियों में, तथापि, कई मॉडल डेटा को समान रूप से अच्छी तरह से फिट हो सकती है. विधि यहाँ वर्णित करने के लिए एक जटिल प्रणालियों के लिए उपयुक्त बाध्यकारी मॉडल को स्पष्ट और इसी thermodynamic मापदंडों निकालने का मतलब प्रदान करता है.
Protocol
1. शेयर समाधान की तैयारी
- शुद्ध ब्याज की macromolecule. (इस मामले में, एन 6'-acetyltransferase-II (AAC6'-II) aminoglycoside, कहीं और रिपोर्ट के रूप में अलग है 13 .)
- डायलिसिस बफर के 4 लीटर तैयार. (इस मामले में हम 25 4 मिमी इस्तेमाल किया - (2 hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES, 238.3 मेगावाट छ / mol), 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, 292.2 मेगावाट) युक्त 7.5 पीएच पर.)
- प्रोटीन है AAC नमूना (6 ')-II (400 सुक्ष्ममापी पर 5 एमएल) का इस्तेमाल किया डायलिसिस बफर (3 x 1.3 एल) में dialyzed होना चाहिए Dialyze. अंतिम डायलिसिस समाधान के लिए मशीन कुल्ला और नमूने पतला करने के लिए रखा जाता है.
- 0.45 सुक्ष्ममापी सेलूलोज़ फिल्टर के माध्यम से अंतिम डायलिसिस समाधान फ़िल्टर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 'चल रहा है बफर' के रूप में संदर्भित किया जाएगा
- 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर है जो चल रहा है बफर के साथ किया गया है अच्छी तरह से rinsed के माध्यम से फ़िल्टर प्रोटीन समाधान. प्रोटीन का उपयोग एक मानक परख (ब्रैडफोर्ड, Lowry, आदि) या यूवी absorbance के अंतिम एकाग्रता उपाय. दीर्घकालिक स्थिरता को अधिकतम करने के लिए प्रोटीन स्टोर. ((6 AAC के मामले में)-II ठंड और विगलन के बाद बनाए रखने नहीं करता है गतिविधि ')-II, यह 4 बजे भंडारण डिग्री सेल्सियस (6 AAC का मतलब है').
- बफर चलाने में 4.0 मिलीग्राम भंग करके एसिटाइल coenzyme एक के 25 मिमी शेयर समाधान (AcCoA, ligand, 809.57 मेगावाट) के 200μL तैयार करें. -78 पर रुक डिग्री सेल्सियस तक का उपयोग करने के लिए तैयार है.
- सभी प्रोटीन और ligand के नमूने ही शेयर समाधान से उत्पन्न एकाग्रता में यादृच्छिक नमूना नमूना उतार - चढ़ाव कम से कम करना चाहिए. पूरे चर ग डाटासेट भर में प्रोटीन एकाग्रता के लिए एक एकल सुधार कारक विश्लेषण में समायोजित किया जाता है 10.
2. तैयारी आईटीसी नमूने
- एंजाइम 2 एमएल अंतिम मात्रा के साथ 64 की ग मूल्य का हल पतला. ((6 'AAC)-II के मामले में, यह 192 सुक्ष्ममापी से मेल खाती है है.)
- जल्दी ligand (AcCoA) बर्फ के पानी में शेयर समाधान पिघलना.
- एक AcCoA समाधान के 0.5 एमएल 10 गुना अधिक ध्यान केंद्रित किया तो प्रोटीन पर बाध्यकारी साइटों की संख्या, इस मामले में चल रहा है बफर के 420 μL में AcCoA स्टॉक समाधान की 80 μL गिराए द्वारा 4 मिमी,. तैयार एक विंदुक भरने ट्यूब में स्थानांतरण. जल्दी -78 सी. सेंटीग्रेड AcCoA शेयर समाधान वापसी
- देगास और एक 1 तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रोटीन के तहत निर्वात समाधान डिग्री सेल्सियस वांछित चल रहे तापमान के नीचे (19 डिग्री सेल्सियस).
3. 14 सिरिंज की स्थापना
- सिरिंज धारक इंजेक्शन सिरिंज के माध्यम से सम्मिलित करना जब तक पूर्व घुड़सवार सिरिंज दबाना धारक के रूप में एक ही ऊंचाई पर है.
- इंजेक्शन सिरिंज के दूसरे ओवर सिरिंज दबाना फ़ीड जब तक यह सिरिंज धारक के नीचे के खिलाफ मजबूती से दबाया जाता है. धीरे दबाना कस प्रदान .050 "बॉल प्वाइंट हेक्स ड्राइव के साथ.
- विंदुक धारक प्लेस में सिरिंज धारक.
- धीरे इंजेक्शन सिरिंज में पिपेट इंजेक्टर स्लाइड. सुनिश्चित करें सवार टिप सीधे सिरिंज के छेद में खिलाया है. एक बार पूरी तरह से डाला, पिपेट सुई लगानेवाला में सिरिंज धारक के कॉलर ताला लगा पेंच.
4. नमूना सेल 14 लोड हो रहा है
- चल बफर के 50 एमएल की एक न्यूनतम के साथ नमूना सेल धो, और एक लंबे needled 2.5 मिलीलीटर गिलास सिरिंज का उपयोग करके किसी भी शेष तरल निकालने.
- धीरे धीरे साफ और सूखी लंबी needled 2.5 मिलीलीटर सिरिंज में प्रोटीन नमूना समाधान के 1.8 मिलीलीटर की एक न्यूनतम आकर्षित. किसी भी बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहो.
- ध्यान से नमूना सेल में सुई डालने और धीरे सेल के नीचे स्पर्श. टिप थोड़ा उठाएँ (~ 1 मिमी) और सेल में धीरे AAC (6) समाधान-II इंजेक्षन जब तक अतिरिक्त तरल नमूना सेल के ऊपर से ऊपर दिखाई देता है.
- धीरे धीरे 1 सेमी के बारे में सुई बढ़ा जबकि अतिप्रवाह में तरल बनी हुई है सुनिश्चित करने. जल्दी वापस लेने और समाधान की एक छोटी राशि (~ 0.25 मिलीलीटर) नमूना सेल में किसी भी फंस बुलबुले को दूर इंजेक्षन.
- सभी समाधान अतिप्रवाह निकालें. यह अतिप्रवाह के पक्ष के साथ धीरे नमूना सेल में सुई फिसलने द्वारा हासिल की है. सिरिंज टिप एक हद मारा जाएगा, यह चल रहा है समाधान के लिए इच्छा ऊंचाई है. सभी तरल है जो इस लाइन के ऊपर बैठता निकालें.
5. इंजेक्शन सिरिंज लोड हो रहा है और 14 रन की शुरुआत
- भरण पोर्ट में प्लास्टिक ट्यूब लोड हो रहा है सिरिंज संलग्न.
- लोअर सवार भरने के बंदरगाह के शीर्ष करने के लिए टिप.
- विंदुक भरने ट्यूब में पिपेट धारक के तल पर AcCoA समाधान रखें. सिरिंज टिप भरने ट्यूब के नीचे स्पर्श नहीं करना चाहिए.
- धीरे धीरे सिरिंज में समाधान आकर्षित जब तक एक छोटी राशि लोड हो रहा है सिरिंज के ट्यूब में प्रवेश करती है.
- बंद भरें पोर्ट बटन पर सवार टिप और क्लिक कम से भरने के बंदरगाह को बंद करें. पर्ज और पर्ज -> फिर से भरना बटन पर क्लिक करके, 3 बार के लिए किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करके फिर से भरना है कि लोड करने के दौरान फंसे हो सकते हैं.
- विंदुक धारक से भरने ट्यूब निकालें और धीरे सिरिंज टिप पोंछ.
- विंदुक और नमूना सेल में धीरे कम सिरिंज विधानसभा लो. के रूप में सिरिंज आसानी से मोड़ कर सकते हैं धीरे - धीरे आगे बढ़ें, तो महान देखभाल की जरूरत है. सुनिश्चित करें सिरिंज पूरी तरह से कॉलर ताला लगा के आधार पर नीचे का उपयोग करके सम्मिलित किया जाता है.
- वांछित चल रहे तापमान (इस मामले 20 डिग्री सेल्सियस में) सेट, और एक संदर्भ शक्ति है कि अधिकतम इंजेक्शन गर्मी प्रवाह की उम्मीद (इस मामले 20μcal/sec में) की तुलना में थोड़ा अधिक है का चयन करें.
- वांछित इंजेक्शन की मात्रा और देरी कार्यक्रम. (इस मामले में, 28 इंजेक्शन कार्यरत थे पहले इंजेक्शन के एक 60 एस देरी से 2 μL की एक मात्रा था. सभी बाद इंजेक्शन एस 330 की देरी के साथ 10 μL की मात्रा था.)
6. इसके बाद रन
- बाद के सभी रन में 2-5 चरणों को दोहराएँ, जबकि 2,4,8,16 का एक कारक द्वारा (6) AAC-II और AcCoA सांद्रता कम, और 32.
7. डेटा विश्लेषण
- एक उपयुक्त प्रक्रिया का उपयोग करें जो दुनिया भर में बाध्यकारी पैरामीटर का एक सेट करने के लिए isotherms के सभी फिट बैठता है, के रूप में 10 पहले से वर्णित है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिनिधि डेटा चित्र 1 में दिखाया जाता है. isotherms के आकार एकाग्रता के साथ अलग अलग होना चाहिए. तेज संक्रमण उच्च के लिए उम्मीद कर रहे हैं (यानी उच्च प्रोटीन और ligand सांद्रता ग) मान (चित्रा 2).
(6) AAC-II के मामले में दो साइट अनुक्रमिक मॉडल एक समायोज्य stoichiometries के साथ समान, स्वतंत्र साइटों के दो सेट का वर्णन करने की तुलना में एक बेहतर फिट देता है.
चित्रा 1 (6) AAC-II (192 सुक्ष्ममापी) में AcCoA के अनुमापन (3.86 मिमी) द्वारा उत्पादित isotherms. एक) कच्चे आईटीसी ट्रेस. बी) एकीकृत 2 साइट अनुक्रमिक फिट (के साथ बाध्यकारी पैरामीटर (चौकों) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया मानों -).
चित्रा 2. AcCoA के लिए आईटीसी isotherms अलग सांद्रता में (6) AAC-II में titrated. प्रयोगात्मक डेटा (खुला हलकों) 2 - सेट की साइटों स्वतंत्र मॉडल (धराशायी मैजंटा) और एक 2 साइट अनुक्रमिक मॉडल (ठोस नीला) के लिए फिट थे. 2 साइट sequentional मॉडल स्पष्ट रूप से बेहतर समग्र समझौते देता है. कार्यरत सांद्रता एक थे) 6 सुक्ष्ममापी, 0.25 मिमी, बी) 12 सुक्ष्ममापी, 0.25 मिमी, सी) 24 सुक्ष्ममापी, 0.5 मिमी, डी) 48 सुक्ष्ममापी, 1.0 मिमी, ई) 96 सुक्ष्ममापी, 1.9 मिमी, और एफ) 196 सुक्ष्ममापी, (6) AAC-II और AcCoA क्रमशः के लिए 3.86 मिमी,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
चर ग फिटिंग के इस विश्लेषणात्मक भाग पहले 10 में विस्तार से वर्णित किया गया है. यहाँ हम इस दृष्टिकोण के लिए चर ग उपयुक्त डेटासेट इकट्ठा करने के व्यावहारिक पहलुओं की रिपोर्ट. यह आवश्यक है कि सभी प्रोटीन और ligand के नमूने ही शेयर समाधान से तैयार कर रहे हैं. इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त स्टॉक समाधान शुरू प्रयोगों की पूरी श्रृंखला को पूरा तैयार है. यह AAC के अनुपात (6 ')-II और यह सुनिश्चित करता है AcCoA सभी प्रयोगों के बीच स्थिर है, और एक नमूना नमूना के आधार पर एकाग्रता में यादृच्छिक उतार चढ़ाव कम कर देता है है.
इस मामले में, बहुत देखभाल ligand की हैंडलिंग में लिया जाना चाहिए. AcCoA रासायनिक समाधान में अस्थिर है, इसलिए यह आवश्यक है कि शेयर समाधान समय के बहुत ही कम अवधि के लिए तरल रहता है. एक बार जब उचित मात्रा में शेयर समाधान से aliquoted है, शेयर तुरंत refrozen होना चाहिए. अगर ऐसा नहीं किया है, तो AcCoA समय पर नीचा और सांद्रता बाद के रन में सही नहीं हो जाएगा हो सकता है. Aliquoted एक बार, AcCoA नमूने तुरंत इस्तेमाल किया जा चाहिए. अस्थिर कर रहे हैं कि प्रोटीन के मामले में, इसी तरह की सावधानी जरूरी होगा.
यह प्रक्रिया को आसानी से अन्य जटिल प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए संशोधित कर सकते हैं 10 इस्तेमाल किया सांद्रता विशिष्ट प्रणाली के बंधन स्थिरांकों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.. के बारे में 1 और 1000 8,10 के बीच एक ग मूल्यों की एक विस्तृत रेंज डाटासेट भर में आवश्यक है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR), राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), और एक CIHR प्रशिक्षण अनुदान छात्रवृत्ति (वामो के लिए) द्वारा समर्थित किया गया. हम प्रो AAC के लिए जेरार्ड डी. राइट (McMaster विश्वविद्यालय, कनाडा) (6)-II अभिव्यक्ति प्लाज्मिड धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. ksana, J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. ITC Data Analysis in Origin. , 7 edn, MicroCal. (2004).
