Summary
ITCは、そのホストへのリガンドの結合を研究するための強力なツールです。複雑なシステムではしかし、いくつかのモデルも同様にデータをフィットすることがあります。ここで説明する方法は、複雑なシステムのための適切な結合モデルを解明し、対応する熱力学的パラメータを抽出する手段を提供します。
Abstract
等温滴定熱量測定（ITC）は、一般的に、ホスト高分子のリガンドの結合に関連する熱力学的パラメータを決定するために使用されます。 ITCは、ホスト/リガンド相互作用を研究するための一般的な分光学的方法に比べていくつかの利点があります。たとえば、2つのコンポーネントが相互作用するときに放出または吸収された熱が直接測定され、任意の外生的な記者を必要としません。したがって、結合エンタルピーと会合定数（KA）は直接ITCデータから得られる、とエントロピーの寄与を計算するために使用することができます。また、等温線の形状は、c -値と関係する機械的なモデルに依存しています。 C -値は、[P] Tはタンパク質濃度であり、そしてnは、ホスト内のリガンド結合部位の数であり、C = N [P] TKA、として定義されています。多くの場合、特定のリガンドのための複数の結合部位は非等価であり、ITCは、個々の結合部位の熱力学バインディングパラメータの特性評価が可能になります。しかし、これは正しいバインディングモデルを使用する必要があります。異なるモデルで同じ実験データをフィットできる場合は、この選択は、問題となる可能性があります。我々は以前この問題は、c -値のいくつかで実験を行うことにより回避できることが示されている。 C -値は異なるで得られた複数の等温線は、別のモデルを同時にフィットされています。正しいモデルは、次の変数全体の- cデータセット全体の適合度に基づいて識別されます。このプロセスは、アミノグリコシド耐性の原因となる酵素アミノグリコシドN - 6' -アセチルトランスフェラーゼ- II（AAC（6'）- II）にここに適用されます。私たちの方法論は、あらゆるシステムに適用可能であるが、この戦略の必要性が良くアロステリック効果や協同性を示す高分子 - リガンドシステムで実証、および別の結合モデルは、同じデータに本質的に同一のフィットを提供する場合です。私たちの知識に、市販のそのようなシステムはありません。 AAC（6'）- II、二つのサブユニット間の協同性を示す、二つの活性部位を含むホモ二量体である。しかしC -値の単一で得られたITCのデータは、少なくとも2つの異なるモデルが二組 - の部位に依存しないモデルと二サイトシーケンシャル（協同組合）のモデルにも同様にフィットすることができます。上記で説明したように、C -値を変化させることを通じて、それは、AACの正しい結合モデル（6'）- IIは、2つのサイトシーケンシャル結合モデルであることが設立されました。ここで、我々は、ITCの実験を行う際に、変数- cの分析に適したデータセットを得るためにに必要な手順を説明します。
Protocol
1。ストック溶液を準備する
- 興味のある高分子を精製する。 （このケースでは、アミノ配糖体N - 6' -アセチルトランスフェラーゼ- II（AAC6' - II）は、他の場所で報告されたとして単離される。13）
- 透析バッファー4リットルを準備します。 （このケースでは、25mMの4使用 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、MW 238.3グラム/モル）、2 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、MW 292.2）を含む、pH7.5で。）
- タンパク質を透析に使用AAC（6'）- IIのサンプル（400μMで5mL）を透析緩衝液（3 × 1.3 L）中で透析する必要があります。最終的な透析液は、機械を洗浄するとサンプルを希釈するために保持されます。
- 0.45μmのセルロースフィルターを通して最終的な透析液をフィルタリングし、4℃で保存"実行中のバッファ"と呼ぶことにする
- 実行中のバッファで十分にリンスされている0.2μmのシリンジフィルターを通してフィルタータンパク質溶液。標準アッセイ（Bradford、Lowry法、等）またはUV吸光度を用いてタンパク質の最終濃度を測定する。長期的な安定性を最大化するタンパク質を保管してください。 （AAC（6の場合には"）- II、4でこの手段の記憶℃、AAC（6'）- IIは、凍結融解後の活性を保持していません）。
- バッファを実行するには4.0 mgを溶解することによってアセチル補酵素Aの25mMのストック溶液（AcCoA、リガンド、MW 809.57）の200μLを準備します。 -78℃で凍結℃で使用可能な状態になるまで。
- すべての蛋白質とリガンドのサンプルは、濃度のランダムなサンプル間の変動を最小限に抑えるために、同じストック溶液から発信される必要があります。全体の変数に- cデータセット間のタンパク質濃度に対して1つの補正係数は、解析に調整されます。10
2。準備ITCサンプル
- 2 mLの最終容積で64のcの値に酵素溶液を希釈する。 （AAC（6'）- IIの場合には、これは192μMに相当する。）
- すぐに氷水のリガンド（AcCoA）ストック溶液を解凍。
- 10倍以上のAcCoA溶液0.5 mLを準備するバッファを実行して、420μLでAcCoAストック溶液80μLを希釈することにより、この場合は4 mMの、蛋白質にして結合部位の数を濃縮する。ピペット充填チューブに移す。すぐに-78℃にAcCoAのストック溶液を返す
- ドガ温度1で5分間真空下でタンパク質とソリューション℃の希望実行されている温度（19℃）以下。
3。注射器14の設定
- あらかじめ実装されているシリンジクランプをホルダーと同じ高さになるまでシリンジホルダーを介して注射器を挿入します。
- それがしっかりとシリンジホルダーの底部が押し付けられるまで注射器を介して別のシリンジクランプを養う。静かに提供さ0.050"ボールポイント六角ドライブ付きクランプを締めます。
- ピペットホルダーにシリンジホルダーを置きます。
- ゆっくりと注射筒にピペットインジェクターをスライドさせます。プランジャーの先端が注射器の穴に直接供給されていることを確認します。一度完全に挿入、ピペットインジェクタにシリンジホルダーのロッキングカラーをねじ込みます。
4。試料セル14をロード
- バッファを実行しているのを50mLの最小で試料セルを洗浄して、そして長期ニードル2.5 mlのガラス製注射器を使用して、残りの液体を取り除く。
- 徐々に清潔で乾燥した長期ニードル2.5 mlのシリンジへのタンパク質の試料溶液1.8 mlの最小値を引く。任意の気泡を導入しないように注意してください。
- 慎重に試料セルに針を挿入し、ゆっくりと、セルの底部に触れない。少しヒントを上げる（〜1 mm）と過剰の液体が試料セルの最上部より上に見えるようになるまで穏やかに細胞内にAAC（6'）- II溶液を注入する。
- オーバーフローの液体遺跡を確保しつつ、ゆっくりと約1cmの針を上げる。すぐに撤回し、試料セル内の任意の閉じ込められた気泡を除去するために少量の溶液（〜0.25 ml）を注入する。
- すべてのソリューションのオーバーフローを削除します。これは、静かにサンプルセル中にオーバーフローの側面に沿って針をスライドさせることにより達成される。注射器の先端が棚にヒットする、これは実行中のソリューションのための欲求の高さです。この行の上に座っているすべての液体を削除します。
5。注射器のロードと実行14を開始する
- 充填ポートにプラスチック製のチューブローディングシリンジを取り付けます。
- 充填ポートの上部にプランジャーの先端を下げます。
- ピペットホルダーの底部にピペット充填チューブにAcCoAソリューションを置きます。シリンジの先端は、充填チューブの底に触れないでください。
- 少量のローディングシリンジのチューブに入るまで、ゆっくりとシリンジに解決策を描く。
- プランジャーの先端を下げることによって、充填ポートを閉じ、[閉じる充填ポートのボタンをクリックしてください。ローディング中に閉じ込められる可能性のあるすべての気泡を除去するパージ - >リフィルのボタン、3回をクリックしてパージし、詰め替え、。
- ピペットホルダーから充填チューブを外し、ゆっくりとシリンジの先端を拭きます。
- ピペットのアセンブリおよび試料セルに優しく低注射器を取る。ゆっくりとシリンジを簡単に曲げることができるように実行しますので、細心の注意が必要です。注射器が完全に襟のロックの基盤を押し下げて、挿入されていることを確認します。
- 希望する実行中の温度を（この場合20℃で）設定し、予想される最大射出熱流量（この場合の20μcal/secで）よりも若干大きくなりますので、基準電源を選択する。
- 希望の注入量と遅延をプログラムする。 （この場合は、28注射が使用された。最初の注射は60秒遅れで2μLの容積を持っていた。後続のすべての注射は、330秒の遅延と10μLのボリュームを持っていた。）
6。以降の実行
- 2,4,8,16、および32倍にAAC（6'）- IIとAcCoAの濃度を低減しつつ、すべての後続の実行では、手順2〜5を繰り返します。
7。データ解析
- 世界的に前述の10に記載の結合パラメータの単一のセットに等温線のすべてに適合するフィッティングの手順を使用します。
8。代表的な結果
代表的なデータを図1に示されています。等温線の形状は、濃度によって変化する必要があります。シャープな遷移は高いが期待されているC -値（すなわち、より高い蛋白質とリガンドの濃度）（図2）。
AAC（6'）- IIの場合、2サイトシーケンシャルモデルでは、調整可能な化学量論と同一の、独立したサイトの2つのセットを記述するよりも優れたフィット感を与えます。
図1。AACにAcCoA（3.86 mM）の（6'）- II（192μM）の滴定によって生成される等温線。 A）生ITCトレース。 B）2サイトシーケンシャルフィット（との結合パラメータを（正方形）を決定するために使用される統合された値が - ）。
AcCoAについては図2。ITCの等温線は、様々な濃度でAAC（6'）- IIに滴定する。実験データ（白丸）を2セット - の部位に依存しないモデル（破線マゼンタ）と2 - サイトシーケンシャルモデル（ソリッドブルー）に適合させた。 2サイトsequentionalモデルは明らかに良い全体的な合意が得られます。採用濃度は）6μM、0.25 mMの、B）12μM、0.25 mMの、C）24μM、0.5mMの、D）48μM、1.0mMの、E）96μM、1.9 mMの、およびF）196μM、 AAC（6'）- IIとそれぞれAcCoAのための3.86 mMの、。
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Discussion
変数に- cフィッティングのこの分析部分は、以前は詳細10で説明されています。ここでは、このアプローチに適した変数に- cデータセットを収集するの実用的側面を報告する。それはすべての蛋白質とリガンドのサンプルが同じストック溶液から引き出されていることが不可欠です。したがって、十分なストック溶液は実験のシリーズ全体を完了するために最初に用意されていることが重要です。これは、AAC（6'）- IIとAcCoAの比率を確実にすべての実験の中で一定であり、サンプル間の単位で濃度のランダムな変動を低減。
このケースでは、多くのケアはリガンドの取り扱いに注意する必要があります。それは、ストック溶液は、時間の非常に短い期間のための液体のままであることが不可欠であるので、AcCoAは、溶液中で化学的に不安定です。適切な量のストック溶液から分注しされると、株価はすぐに再凍結でなければなりません。これが行われていない場合は、AcCoAは時間の経過とともに低下する可能性がありますし、濃度は、後の実行では正しくありません。一回注し、AcCoAのサンプルは直ちに使用する必要があります。不安定なタンパク質の場合には、同様の注意が必要となります。
この手順は、簡単に他の複雑なシステムを研究するように変更することができます。使用されている10の濃度が特定のシステムの結合定数に適応する必要があります。 8,10約1〜1000のcの値の広い範囲は、データセット全体に必要となります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、カナダのヘルスリサーチの研究所（CIHR）、国立科学と工学研究評議会（NSERC）、およびCIHR訓練助成金（LFへ）によってサポートされていました。私たちは、AACのための教授ジェラルドD.ライト（マクマスター大学、カナダ）（6）- IIの発現は、プラスミド感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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