Summary
ITC é uma ferramenta poderosa para estudar a ligação de um ligante para seu hospedeiro. Em sistemas complexos no entanto, vários modelos podem ajustar os dados igualmente bem. O método descrito aqui fornece um meio para elucidar o modelo de encadernação adequada para sistemas complexos e extrair os parâmetros termodinâmicos correspondentes.
Abstract
Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é comumente usada para determinar os parâmetros termodinâmicos associados com a ligação de um ligante para uma macromolécula host. ITC tem algumas vantagens sobre abordagens comuns espectroscópicas para o estudo de host / ligante interações. Por exemplo, o calor liberado ou absorvido quando os dois componentes interagem é medido diretamente e não requer qualquer repórteres exógena. Assim, a entalpia de ligação ea constante de associação (Ka) são obtidos diretamente a partir de dados ITC, e pode ser usado para calcular a contribuição entrópica. Além disso, a forma da isoterma é dependente do c-valor e do modelo mecanicista envolvidos. O c-valor é definido como n = c [P] TKA, onde [P] t é a concentração de proteína, e n é o número de sites de ligação do ligando dentro do hospedeiro. Em muitos casos, vários sítios de ligação para um ligante dadas não são equivalentes e ITC permite a caracterização dos parâmetros termodinâmicos de ligação para cada site individual vinculativo. Este, porém, exige que o modelo correto de ligação ser usado. Essa escolha pode ser problemático se os diferentes modelos podem caber os mesmos dados experimentais. Nós temos mostrado previamente que este problema pode ser contornado através da realização de experimentos em vários c-valores. As isotermas múltiplos obtidos em diferentes valores de c estão aptos simultaneamente a modelos distintos. O modelo correto é o próximo identificados com base na bondade de ajuste em todo o conjunto de dados variável c-inteiro. Este processo é aplicado aqui para o aminoglicosídeo resistência causando aminoglicosídeo enzima N-6'-acetiltransferase-Ii (AAC (6 ')-II). Embora nossa metodologia é aplicável a qualquer sistema, a necessidade dessa estratégia é melhor demonstrada com um sistema de macromolécula-ligante mostrando allostery ou cooperatividade, e quando diferentes modelos de ligação fornecer cabe essencialmente idênticos aos mesmos dados. Ao nosso conhecimento, não existem tais sistemas disponíveis comercialmente. AAC (6 ')-II, é um homo-dímero contendo dois sítios ativos, mostrando cooperatividade entre as duas subunidades. Contudo, os dados obtidos ITC em um único c valor pode ser apto igualmente bem a pelo menos dois modelos diferentes de um modelo de dois conjuntos-de-sites independentes e um dois-site seqüencial modelo (cooperativa). Através da variação da c-valor, como explicado acima, estabeleceu-se que o modelo correto de ligação para AAC (6 ')-II é um dois-site modelo seqüencial de ligação. Aqui, descrevemos os passos que devem ser tomados ao realizar experimentos ITC para obter conjuntos de dados adequados para a variável-c análises.
Protocol
1. Preparar soluções estoque
- Purificar a macromolécula de interesse. (Neste caso, aminoglicosídeo N-6'-acetiltransferase-Ii (AAC6'-II), é isolada como relatado em outros lugares. 13)
- Prepare 4 litros de solução de diálise. (Neste caso foi utilizado 25 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, 238,3 MW g / mol), contendo 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 292,2 MW), no pH 7,5).
- Diálise a proteína A AAC amostra (6 ')-II (5 mL a 400 mM) utilizados devem ser dialisada em tampão de diálise (3 x 1.3 L). A solução de diálise final é mantida para lavar a máquina e para diluir amostras.
- Filtrar a solução de diálise final através de um filtro de celulose 0,45 mM, e armazenados a 4 ° C. Será referido como "tampão de corrida"
- Solução de proteína de filtro através de um filtro de seringa 0,2 m que tenha sido lavado cuidadosamente com tampão de corrida. Medir a concentração final da proteína através de um ensaio padrão (Bradford, Lowry, etc) ou absorbância UV. Loja da proteína para maximizar a estabilidade a longo prazo. (No caso da AAC (6 ')-Ii, isto significa que o armazenamento a 4 ° C. AAC (6')-Ii não mantém atividade após congelamento e descongelamento).
- Prepare 200μL de 25 mM solução estoque de acetil coenzima A (AcCoA, o ligante, MW 809,57) dissolvendo 4,0 mg na execução de buffer. Congelar a -78 ° C até que esteja pronto para uso.
- Todas as proteínas e as amostras de ligante devem ser originários da mesma ação de soluções, para minimizar amostra aleatória com o modelo flutuações na concentração. Um fator de correção único para a concentração de proteína em toda a variável c dataset é ajustado na análise. 10
2. Preparação de amostras ITC
- Diluir a solução de enzima a um c-valor de 64 com um volume final de 2 mL. (No caso da AAC (6 ')-Ii, isto corresponde a 192 mM).
- Descongelar rapidamente o ligante solução-mãe (AcCoA) em água gelada.
- Prepare 0,5 mL de uma solução AcCoA 10 vezes mais concentrada, em seguida, o número de sítios de ligação na proteína, neste caso 4 mM, diluindo-se 80 mL da solução estoque em 420 mL AcCoA de tampão de corrida. Transferir para um tubo de enchimento da pipeta. Retornar rapidamente a solução estoque AcCoA a -78 ° C.
- Degas proteína e soluções sob vácuo por 5 min a uma temperatura de 1 ° C abaixo da temperatura desejada em execução (19 ° C).
3. Configurando a seringa 14
- Inserir a seringa de injeção através de titular seringa até a braçadeira seringa pré-montada é na mesma altura que o titular.
- Alimentar o clamp seringa, o segundo sobre a seringa de injeção até que esteja firmemente pressionado contra a parte inferior do titular seringa. Aperte levemente o grampo com o previsto "Drive Bola 0,050 Hex Point.
- Coloque titular seringa no suporte da pipeta.
- Deslize suavemente o injector pipeta dentro da seringa de injeção. Verifique se a ponta do êmbolo é alimentado diretamente para o buraco da seringa. Depois de completamente inserido, o anel de travamento de rosca do titular da seringa no injector da pipeta.
4. Carregando a célula de amostra 14
- Lavar célula de amostra com um mínimo de 50 mL de tampão de corrida, e remover qualquer líquido restante usando uma longa agulha 2,5 ml seringa de vidro.
- Lentamente desenhar um mínimo de 1,8 ml de solução de proteína na amostra limpa e seca seringa ml de longa agulha 2.5. Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas.
- Cuidadosamente inserir a agulha em célula de amostra e gentilmente tocar o fundo da célula. Levantar a ponta ligeiramente (~ 1 mm) e gentilmente injetar AAC (6 ')-solução Ii dentro da célula até o excesso de líquido é visível acima da parte superior da célula de amostra.
- Lentamente levantar a agulha cerca de 1 cm, garantindo permanece líquido no overflow. Rapidamente retirar e injetar uma pequena quantidade de solução (~ 0,25 ml) para remover quaisquer bolhas de presos na cela da amostra.
- Remover todos estouro solução. Isto é conseguido, deslizando suavemente a agulha ao lado de transbordamento para dentro da célula da amostra. A ponta da seringa vai bater uma borda, esta é a altura desejo para a solução em execução. Retire todo o líquido que fica acima desta linha.
5. Carregando seringa de injeção e iniciar executar 14
- Conecte a seringa de plástico do tubo de carga no porto de preenchimento.
- Ponta inferior êmbolo para a parte superior da porta de preenchimento.
- Coloque a solução AcCoA no tubo de enchimento da pipeta na parte inferior do titular da pipeta. A seringa não deve tocar o fundo do tubo de enchimento.
- Tirar lentamente a solução para a seringa até que uma pequena quantidade entra no tubo da seringa carregamento.
- Feche a porta encher, diminuindo a ponta do êmbolo e clique no botão Fechar porta Fill. Purga e recarga, clicando no botão Limpar-> Refill, 3 vezes para remover quaisquer bolhas de ar que pode ter ficado preso durante o carregamento.
- Remova o tubo de enchimento do detentor pipeta e limpe a ponta da seringa.
- Tome pipeta montagem e seringa suavemente menor para dentro da célula da amostra. Prossiga lentamente como a seringa pode facilmente dobrar, por isso muito cuidado é necessário. Garantir a seringa está completamente inserido, pressionando para baixo na base de anel externo.
- Definir a temperatura desejada em execução (neste caso 20 ° C), e selecione uma potência de referência que é ligeiramente maior do que a vazão máxima de injeção de calor esperado (neste caso 20μcal/sec).
- O programa de injeção de volumes desejados e atrasos. (Neste caso, 28 injeções foram empregados. A primeira injeção teve um volume de 2 mL com um atraso s 60. Todas as injeções subseqüentes tiveram volumes de 10 mL com 330 atrasos s).
6. Executa subseqüentes
- Em todas as execuções subseqüentes repita os passos 2-5, enquanto diminui AAC (6 ')-II e concentrações AcCoA por um fator de 2,4,8,16 e 32.
7. Análise de Dados
- Use um procedimento de ajuste, que globalmente se encaixa todas as isotermas de um único conjunto de parâmetros de ligação, como descrito anteriormente 10.
8. Resultados representante
Dados representativos são mostrados na Figura 1. As formas das isotermas deve variar com a concentração. Transições mais nítidas são esperados para maior c-valores (ou seja, com elevado teor proteico e as concentrações de ligante) (Figura 2).
No caso da AAC (6 ')-II, o modelo de dois-site seqüencial dá um melhor ajuste do que um descrevendo dois conjuntos de idênticas, sites independentes, com estequiometrias ajustável.
Figura 1. Isotermas produzido pela titulação de AcCoA (3,86 mM) na AAC (6 ')-II (192 mm). A) trace ITC Raw. B) Os valores integrado utilizado para determinar os parâmetros de ligação (quadrados) com um encaixe 2 sites seqüencial (-).
Isotermas figura 2. ITC para AcCoA titulada em AAC (6 ')-II em concentrações variadas. Os dados experimentais (círculos abertos) estavam aptos para um modelo de 2 sets-de-sites independentes (magenta tracejada) e um modelo 2-site seqüencial (azul sólidos). O modelo 2-site sequentional claramente dá acordo de melhor no geral. As concentrações utilizadas foram A) 6 mM, 0,25 mM, B) 12 mM, 0,25 mM, C) 24 mM, 0,5 mM, D) 48 mM, 1,0 mM, E) 96 mM, 1,9 mM, e F) 196 mM, 3,86 mM, para AAC (6 ')-II e AcCoA respectivamente.
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Discussion
Esta parte analítica da variável c montagem foi descrito anteriormente em detalhe 10. Aqui relatamos os aspectos práticos da coleta variável c conjuntos de dados adequados para esta abordagem. É essencial que todas as proteínas e as amostras de ligante são desenhados a partir das soluções estoque mesmo. Portanto, é importante que a solução estoque suficiente é preparado inicialmente para completar toda a série de experimentos. Isso garante que o rácio de AAC (6 ')-II e AcCoA é constante entre todos os experimentos, e reduz a flutuações aleatórias na concentração com base numa amostra para amostra.
Neste caso, muito cuidado deve ser tomado no manuseio do ligante. AcCoA é quimicamente instável em solução por isso é essencial que a solução permanece líquido por períodos muito curtos de tempo. Uma vez que a quantidade adequada é alíquotas da solução estoque, o estoque deve ser imediatamente recongelados. Se isso não for feito, então o AcCoA pode degradar ao longo do tempo e as concentrações não será correta em corridas mais tarde. Uma vez alíquotas, amostras AcCoA deve ser utilizado imediatamente. No caso de proteínas que são instáveis, as precauções semelhantes serão necessários.
Este procedimento pode ser facilmente modificado para estudar outros sistemas complexos. 10 As concentrações utilizadas devem ser adaptados para as constantes de ligação do sistema específico. Uma vasta gama de valores c entre cerca de 1 mil e 8,10 é exigido em todo o conjunto de dados.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), Nacional de Ciência e Engenharia Research Council (NSERC), e um treinamento CIHR bolsa de estudo (para LF). Agradecemos ao Prof Gerard D. Wright (McMaster University, Canadá) para a AAC (6)-Ii expressão plasmídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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