Summary
ITC is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de binding van een ligand aan zijn gastheer. In complexe systemen kan echter verschillende modellen passen bij de gegevens even goed. De hier beschreven methode is een middel om de passende bindende model voor complexe systemen te helderen en pak de bijbehorende thermodynamische parameters.
Abstract
Isotherme titratie calorimetrie (ITC) wordt vaak gebruikt om de thermodynamische parameters die geassocieerd worden met de binding van een ligand aan een gastheer macromolecuul te bepalen. ITC heeft een aantal voordelen ten opzichte van gemeenschappelijke spectroscopische methoden voor het bestuderen van gastheer / ligand interacties. Bijvoorbeeld, is de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd als de twee componenten communiceren direct gemeten en vereist geen exogene verslaggevers. Dus de binding enthalpie en de vereniging constant (Ka) zijn rechtstreeks verkregen uit ITC data, en kan gebruikt worden om de entropische bijdrage te berekenen. Bovendien is de vorm van de isotherm is afhankelijk van de c-waarde en de betrokken mechanistische model. De c-waarde wordt gedefinieerd als c = n [P] TKA, waar [P] t is de eiwitconcentratie, en n is het aantal ligandbinding sites binnen de gastheer. In veel gevallen, meerdere bindingsplaatsen voor een bepaalde ligand zijn niet gelijkwaardig zijn en ITC maakt de karakterisering van de thermodynamische binding parameters voor elke individuele bindingsplaats. Dit vereist echter dat de juiste binding model worden gebruikt. Deze keuze kan problematisch zijn als verschillende modellen kan passen dezelfde experimentele data. We hebben eerder aangetoond dat dit probleem kan worden omzeild door het uitvoeren van experimenten op verschillende c-waarden. De meervoudige isothermen verkregen bij verschillende c-waarden tegelijkertijd fit te scheiden modellen. Het juiste model is naast geïdentificeerd op basis van de goodness of fit over de gehele variabele-c dataset. Dit proces wordt hier toegepast op het aminoglycoside weerstand veroorzakende enzym aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-II (AAC (6 ')-II). Hoewel onze methodiek is toepasbaar op elk systeem, is de noodzaak van deze strategie beter aangetoond met een macromolecuul-ligand met aanduiding van de allosterie of coöperativiteit, en wanneer verschillende bindende modellen bieden in wezen identiek past op dezelfde gegevens. Voor zover wij weten, zijn er geen dergelijke systemen commercieel beschikbaar. AAC (6 ')-II is een homo-dimeer met twee actieve sites, waarin coöperativiteit tussen de twee subeenheden. Maar ITC gegevens verkregen op een c-waarde kan even goed geschikt zijn om ten minste twee verschillende modellen een twee-sets-van-sites onafhankelijke model en een twee-site sequentiële (coöperatieve) model. Door het variëren van de c-waarde zoals hierboven uiteengezet, werd vastgesteld dat de juiste binding model voor AAC (6 ')-II is een twee-site sequentiële bindend model. Hierin beschrijven we de stappen die moeten worden genomen bij het uitvoeren van ICT-experimenten in om datasets die geschikt zijn voor een variabele-c-analyses te verkrijgen.
Protocol
1. Voorbereiden stockoplossingen
- Zuiveren het macromolecuul van belang. (In dit geval wordt aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-II (AAC6'-II), geïsoleerd zoals elders gemeld. 13)
- Bereid 4 liter dialyse buffer. (In dit geval gebruikten we 25 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, MW 238,3 g / mol), met 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, MW 292.2), bij pH 7,5.)
- Dialyze het eiwit De AAC (6 ')-Ii monster (5 ml op 400 uM) gebruikt moeten worden gedialyseerd bij dialyse buffer (3 x 1,3 L). De uiteindelijke dialyse oplossing is gehouden om de machine te spoelen en om monsters te verdunnen.
- Filter de uiteindelijke dialyse oplossing door een 0,45 pm cellulose filter, en opgeslagen bij 4 ° C. Zullen worden aangeduid als 'running buffer'
- Filter eiwitoplossing door een 0,2 um spuitfilter die grondig gespoeld met stromend buffer. Meet de uiteindelijke concentratie van het eiwit met behulp van een standaard test (Bradford, Lowry, enz.) of UV-absorptie. Sla de eiwitten op lange termijn stabiliteit te maximaliseren. (In het geval van AAC (6 ')-Ii, betekent dit dat opslag bij 4 ° C. AAC (6')-Ii geen activiteit behouden na het invriezen en ontdooien).
- Bereid 200μL van 25 mM voorraad oplossing van acetyl co-enzym A (AcCoA, het ligand, MW 809,57) door het oplossen van 4,0 mg in rijklare buffer. Bevriezen bij -78 ° C tot klaar voor gebruik.
- Alle eiwit en ligand monsters moet afkomstig zijn uit dezelfde stam oplossingen, naar willekeurige sample-to-sample schommelingen in de concentratie te minimaliseren. Een correctiefactor voor de eiwitconcentratie in de gehele variabele-c dataset wordt aangepast in de analyse. 10
2. Voorbereiden ITC monsters
- Verdun het enzym oplossing voor een c-waarde van 64 met een uiteindelijk volume van 2 ml. (In het geval van AAC (6 ')-Ii, komt dit overeen met 192 uM).
- Snel dooi het ligand (AcCoA) stock oplossing in ijswater.
- Bereid 0,5 ml van een oplossing AcCoA 10 keer meer geconcentreerd dan het aantal bindingsplaatsen op het eiwit, in dit geval 4 mM, door verdunning van 80 pi van de AcCoA voorraadoplossing in 420 ul van het runnen van buffer. Over in een pipet vulslang. Snel terug de AcCoA stamoplossing tot -78 ° C.
- Degas het eiwit en oplossingen onder vacuüm gedurende 5 minuten bij een temperatuur van 1 ° C onder de gewenste bedrijfstemperatuur (19 ° C).
3. Het opzetten van de spuit 14
- Steek de injectiespuit via spuithouder totdat de vooraf gemonteerde spuitklem is op dezelfde hoogte als de houder.
- Voer de tweede spuit klem over de injectiespuit totdat het stevig tegen de onderkant van de spuit houder. Voorzichtig draai de klem met de meegeleverde 0.050 "Ball Point Hex Drive.
- Plaats spuithouder in de pipet houder.
- Schuif de pipet injector in de injectiespuit. Zorg ervoor dat de zuiger tip is direct ingevoerd in het gat van de spuit. Eenmaal volledig ingestoken is, schroeft u de vergrendeling kraag van de spuit houder in de pipet injector.
4. Het laden van het monster cel 14
- Was monster cel met een minimum van 50 ml buffer draaien, en verwijder eventueel resterende vloeistof met behulp van een lange naalden 2,5 ml glazen spuit.
- Langzaam trekken een minimum van 1,8 ml van het eiwit-monster oplossing in de schone en droge lange naalden 2,5 ml spuit. Wees voorzichtig dat er geen luchtbellen te introduceren.
- Steek de naald in de steekproef cel en zachtjes de bodem van de cel. Iets te verhogen tip (~ 1 mm) en voorzichtig AAC (6 ')-II-oplossing te injecteren in de cel totdat overtollige vloeistof zichtbaar is boven de bovenkant van het monster cel.
- Langzaam trekken de naald ongeveer 1 cm en tegelijkertijd vloeistof blijft in de overloop. Snel trekken en injecteren een kleine hoeveelheid van de oplossing (~ 0,25 ml) om opgesloten luchtbellen te verwijderen in de steekproef cel.
- Verwijder alle oplossing overflow. Dit wordt bereikt door voorzichtig schuiven de naald langs de kant van de overloop in het monster cel. De spuit zal raken een richel, dit is het verlangen hoogte voor de lopende oplossing. Verwijder alle vloeistof die zit boven deze lijn.
5. Laad-injectie spuit en het initiëren run 14
- Bevestig de plastic buis geladen spuit in te vullen poort.
- Lagere zuiger tip naar de top van de vulling haven.
- Plaats de AcCoA oplossing in de pipet vulslang aan de onderkant van de pipet houder. De spuit mag niet in aanraking van de bodem van de vulslang.
- Langzaam trekken de oplossing in de spuit totdat er een klein bedrag komt de buis van de laad-spuit.
- Sluit de vulopening door het verlagen van de zuiger tip en klik op de Close Fill knop Poort. Purge en vullen, door te klikken op de Purge-> Refill knop, drie keer om eventuele luchtbellen te verwijderen die mogelijk zijn komen te zitten tijdens het laden.
- Verwijder de vulslang van de pipet houder en veeg de spuit.
- Neem de pipet montage en spuit voorzichtig zakken in het monster cel. Ga langzaam de spuit kan gemakkelijk buigen, zo veel zorg nodig is. Zorg ervoor dat de spuit is volledig ingevoegd door naar beneden te drukken op basis van sluitmoer.
- Stel de gewenste bedrijfstemperatuur (in dit geval 20 ° C), en selecteer een referentie-macht die is iets groter dan de maximale injectie warmtestroom naar verwachting (in dit geval 20μcal/sec).
- Programmeer de gewenste injectie volumes en vertragingen. (In dit geval werden 28 injecties toegepast. De eerste injectie had een volume van 2 pl met een 60 s vertraging. Alle volgende injecties had volumes van 10 pi met 330 en vertragingen.)
6. Latere Runs
- In alle daaropvolgende runs herhaalt u de stappen 2-5, terwijl het verlagen van AAC (6 ')-Ii en AcCoA concentraties met een factor van 2,4,8,16, en 32.
7. Data Analysis
- Gebruik een passende procedure die wereldwijd alle van de isothermen past op een enkele set van bindende parameters, zoals eerder is beschreven 10.
8. Representatieve resultaten
Representatieve gegevens worden weergegeven in Figuur 1. De vormen van de isothermen moet variëren met de concentratie. Scherpere overgangen worden verwacht voor hogere c-waarden (dwz hogere eiwit en ligand concentraties) (figuur 2).
In het geval van AAC (6 ')-II, de twee-site sequentiële model geeft een betere pasvorm dan een beschrijving van twee sets van identieke, onafhankelijke sites met verstelbare stoichiometrie.
Figuur 1. Isothermen geproduceerd door titratie van AcCoA (3,86 mm) in AAC (6 ')-II (192 uM). A) Raw ITC te traceren. B) Geïntegreerde waarden die worden gebruikt voor het bepalen van binding parameters (vierkanten) met een 2-site sequentiële fit (-).
Figuur 2. ITC-isothermen AcCoA getitreerd in AAC (6 ')-Ii bij verschillende concentraties. De experimentele data (open cirkels) geschikt waren om een twee-sets-van-sites onafhankelijk model (gestreepte magenta) en een 2-site sequentiële model (blauw). De 2-site sequentional model geeft duidelijk een betere algemene overeenkomst. De gebruikte concentraties waren A) 6 uM, 0,25 mm, B) 12 uM, 0,25 mm, C) 24 uM, 0.5 mM, D) 48 uM, 1.0 mM, E) 96 uM, 1.9 mm, en F) 196 uM, 3,86 mm, voor AAC (6 ')-Ii en AcCoA respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit analytische deel van de variabele c fitting is eerder in detail beschreven 10. Hier melden wij de praktische aspecten van het verzamelen van een variabele-c datasets die geschikt zijn voor deze aanpak. Het is essentieel dat alle eiwit en ligand monsters zijn afkomstig uit dezelfde stam oplossingen. Daarom is het belangrijk dat er voldoende voorraad oplossing in eerste instantie is bereid om de hele reeks van experimenten af te ronden. Dit zorgt ervoor dat de verhouding van de AAC (6 ')-II en AcCoA is constant onder alle experimenten, en vermindert de toevallige schommelingen in de concentratie op een sample-to-sample basis.
In dit geval moet veel zorg worden genomen in de behandeling van de ligand. AcCoA is chemisch instabiele in oplossing, zodat is het essentieel dat de stockoplossing vloeibaar blijft voor zeer korte tijd. Zodra het juiste bedrag is gealiquoteerd uit de voorraad-oplossing, moet de voorraad onmiddellijk opnieuw worden ingevroren. Als dit niet gebeurt, dan is de AcCoA kan na verloop van tijd en de concentraties zullen niet correct worden in latere runs. Eenmaal hoeveelheden verdeeld, moet AcCoA monsters onmiddellijk worden gebruikt. In het geval van eiwitten die instabiel zijn, zullen dezelfde maatregelen nodig zijn.
Deze procedure kan eenvoudig worden aangepast om andere complexe systemen te bestuderen. 10 De gebruikte concentraties moeten worden aangepast aan de binding constanten van het specifieke systeem. Een breed scala van c-waarden tussen ongeveer 1 en 1000 8,10 is vereist over de dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC), en een CIHR training subsidie beurs (LV). Wij danken prof. dr. Gerard D. Wright (McMaster University, Canada) voor de AAC (6)-II expressie plasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. ksana, J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. ITC Data Analysis in Origin. , 7 edn, MicroCal. (2004).
