Summary
ITC es una herramienta poderosa para el estudio de la unión de un ligando a su anfitrión. En los sistemas complejos sin embargo, varios modelos pueden adaptarse bien a los datos. El método descrito aquí proporciona un medio para dilucidar el modelo de encuadernación adecuado para los sistemas complejos y extraer los parámetros termodinámicos correspondientes.
Abstract
Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se utiliza comúnmente para determinar los parámetros termodinámicos asociados a la unión de un ligando a una macromolécula de acogida. ITC tiene algunas ventajas sobre los enfoques comunes espectroscópicas para el estudio de host / ligando interacciones. Por ejemplo, el calor liberado o absorbido cuando los dos componentes interactúan se mide directamente y no requiere ningún periodista exógenos. Así, la entalpía de unión y de la constante de asociación (Ka) se obtienen directamente de los datos de ITC, y se puede utilizar para calcular la contribución entrópica. Además, la forma de la isoterma es dependiente de la c-valor y el modelo mecanicista involucrados. El valor de c se define como c = n [P] ATR, donde [P] t es la concentración de proteínas, y n es el número de sitios de unión del ligando dentro del huésped. En muchos casos, múltiples sitios de unión de un ligando dado no son equivalentes y el CCI permite la caracterización de los parámetros termodinámicos de unión para cada sitio de unión individual. Sin embargo, esto requiere que el modelo de enlace correcto utilizar. Esta elección puede ser problemático si los diferentes modelos pueden ajustarse a los datos experimentales. Hemos demostrado que este problema puede evitarse mediante la realización de experimentos en varias c-valores. Las isotermas de múltiples obtenidos en los diferentes valores de c-se ajustan al mismo tiempo a los modelos por separado. El modelo correcto es el siguiente identificados en base a la bondad de ajuste en toda la variable c conjunto de datos. Este proceso se aplica aquí a los aminoglucósidos resistencia a aminoglucósidos causan la enzima N-acetil-6'-II (AAC (6 ')-II). A pesar de nuestra metodología es aplicable a cualquier sistema, la necesidad de esta estrategia se demuestra mejor con un sistema de macromolécula-ligando muestra allostery o cooperatividad, y cuando los diferentes modelos de unión proporciona se ajusta esencialmente idénticos a los mismos datos. Por lo que sabemos, no hay sistemas disponibles en el mercado. AAC (6 ')-II, es un homo-dímero con dos sitios activos, que muestra cooperatividad entre las dos subunidades. Sin embargo, los datos de ITC obtiene en un solo valor de c se puede estar en forma igual de bien que al menos dos modelos diferentes de un modelo de dos conjuntos de sitios independientes y de un modelo (cooperativa) de dos sitios secuencial. A través de la variación de la c-valor como se explicó anteriormente, se estableció que el modelo correcto de unión para AAC (6 ')-II es un modelo de dos sitios de unión secuencial. En este documento, se describen los pasos que se deben tomar cuando se realizan experimentos de ITC para obtener datos adecuados para la variable c-análisis.
Protocol
1. Preparación de soluciones madre
- Purificar la macromolécula de interés. (En este caso, aminoglucósidos N-6'-acetil-II (AAC6'-II), se encuentra aislada como se informa en otro lugar. 13)
- Preparar 4 litros de tampón de diálisis. (En este caso se utilizó 25 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, 238,3 MW g / mol), que contiene 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 292,2 MW), a pH 7,5.)
- Dializar la proteína de la AAC (6 ')-II muestra (5 ml a 400 M) deben ser dializados en el tampón de diálisis (3 x 1,3 L). La solución final de diálisis se reduce al lavado de la máquina y para diluir las muestras.
- Filtrar la solución final de diálisis a través de un filtro de 0,45 micras de celulosa, y se almacenan a 4 ° C. Se conoce como 'buffer corriente "
- Solución de proteína filtra a través de un filtro de 0,2 micras jeringa que ha sido lavada a fondo con buffer en funcionamiento. Medir la concentración final de la proteína utilizando un ensayo estándar (Bradford, Lowry, etc) o de absorción UV. Tienda de la proteína para maximizar la estabilidad a largo plazo. (En el caso de la AAC (6 ')-II, este medio de almacenamiento a 4 ° C. AAC (6')-II no retiene la actividad después de la congelación y descongelación).
- Prepare 200μL de solución madre 25 mM de acetil coenzima A (AcCoA, el ligando, 809,57 MW) mediante la disolución de 4,0 mg en la gestión de buffer. Se congelan a -78 º C hasta su utilización.
- Todas las muestras de proteínas y ligandos deben proceder de las soluciones misma población, para minimizar la muestra aleatoria de la muestra de las fluctuaciones en la concentración. Un factor de corrección único para la concentración de proteínas en todo el conjunto de datos c variable se ajusta en el análisis 10.
2. Preparación de muestras de ITC
- Diluir la solución de la enzima a un valor de c de 64 años con un volumen final de 2 ml. (En el caso de la AAC (6 ')-II, lo que corresponde a 192 M).
- Rápido deshielo del ligando (AcCoA) solución de reserva de agua helada.
- Preparar 0.5 mL de una solución AcCoA 10 veces más concentrado y luego el número de sitios de unión de la proteína, en este caso 4 mM, mediante la dilución de 80 l de la solución madre AcCoA en 420 l de funcionamiento de amortiguación. Transferir a un tubo de llenado de la pipeta. Rápido retorno de la solución madre AcCoA a -78 ° C.
- Degas la proteína y las soluciones al vacío durante 5 minutos a una temperatura de 1 ° C por debajo de la temperatura deseada en funcionamiento (19 ° C).
3. La creación de la jeringa 14
- Inserte la jeringa a través de soporte de jeringa hasta que la abrazadera jeringa montada es a la misma altura que el titular.
- Alimentar a la pinza de segunda jeringa en la jeringa hasta que se presiona firmemente contra la parte inferior del soporte de jeringa. Apriete suavemente la pinza con la proporcionada 0.050 "Drive bola hexagonal Point.
- Coloque la jeringa titular en el soporte de la pipeta.
- Deslice con cuidado la pipeta en el inyector de jeringa de inyección. Asegúrese de que el émbolo se introduce directamente en el agujero de la jeringa. Una vez insertado, el tornillo del collar de bloqueo del titular de la jeringa en el inyector de la pipeta.
4. Carga de la célula de la muestra 14
- Lave la celda de muestra con un mínimo de 50 ml de funcionamiento de amortiguación, y eliminar todo el líquido restante con una larga aguja 2,5 ml jeringa de vidrio.
- Poco a poco sacar un mínimo de 1,8 ml de solución de proteína en la muestra limpia y seca de larga aguja jeringa de 2,5 ml. Tenga cuidado de no introducir burbujas.
- Con cuidado, inserte la aguja en la celda de la muestra y tocar suavemente la parte inferior de la celda. Levante la punta ligeramente (~ 1 mm) e inyectar suavemente AAC (6 ')-Ii solución en la celda hasta que el exceso de líquido es visible por encima de la parte superior de la celda de muestra.
- Lentamente levante la aguja aproximadamente 1 cm garantizando al mismo tiempo permanece en estado líquido en el desbordamiento. Retirar rápidamente y se inyecta una pequeña cantidad de solución (~ 0,25 ml) para eliminar las burbujas atrapadas en la celda de muestra.
- Eliminar todos los desbordamiento de solución. Esto se logra haciendo deslizar suavemente la aguja al lado de desbordamiento en la celda de muestra. La punta de la jeringa se golpeó un saliente, éste es el deseo de la altura de la solución en ejecución. Eliminar todo el líquido que se encuentra encima de esta línea.
5. Cargando jeringa de inyección y el inicio de ejecución 14
- Conecte la jeringa del tubo de carga de plástico en el puerto de llenado.
- Émbolo menor de punta a la parte superior del puerto de llenado.
- Ponga la solución en el tubo de AcCoA pipeta de llenado en la parte inferior del titular de la pipeta. La punta de la jeringa no debe tocar el fondo del tubo de llenado.
- Dibujar lentamente la solución en la jeringa hasta que una pequeña cantidad entra en el tubo de la jeringa de carga.
- Cerca del puerto de llenado mediante la reducción de la punta del émbolo y haga clic en el botón Cerrar puerto de llenado. Purgar y rellenar, haciendo clic en la Purga-> botón de recarga, 3 veces para eliminar cualquier burbuja de aire que puedan haberse atrapado durante la carga.
- Retire el tubo de llenado del titular de la pipeta y frote suavemente la punta de la jeringa.
- Tome la Asamblea pipeta y jeringa suavemente más bajo en la celda de muestra. Proceder lentamente a medida que la jeringa se puede doblar fácilmente, por lo que se necesita gran cuidado. Asegúrese de que la jeringa se inserta por completo, presionando en la base del anillo de fijación.
- Ajuste la temperatura deseada en ejecución (en este caso 20 ° C), y seleccione una potencia de referencia que es ligeramente mayor que la de inyección de flujo de calor máximo que se prevé (en este caso 20μcal/sec).
- Programa de los volúmenes de inyección deseada y retrasos. (En este caso, 28 inyecciones fueron empleados. La primera inyección con un volumen de 2 l con un retraso de 60 s. Todas las inyecciones posteriores tuvieron un volumen de 10 l con retrasos en 330 s).
6. Ejecuta posterior
- En todas las ejecuciones posteriores, repita los pasos 2-5, mientras que la disminución AAC (6 ')-II y las concentraciones de AcCoA en un factor de 2,4,8,16, y 32.
7. Análisis de Datos
- Utilizar un procedimiento de ajuste que a nivel mundial para todos de las isotermas de un único conjunto de parámetros de enlace, como se describió previamente 10.
8. Resultados representante
Los datos representativos se muestran en la Figura 1. Las formas de las isotermas debe variar con la concentración. Más nítidas las transiciones que se espera para un mayor c-valores (es decir, la proteína más alta y las concentraciones de ligando) (Figura 2).
En el caso de la AAC (6 ')-II, el modelo secuencial de dos sitios le da un mejor ajuste de una descripción de dos conjuntos de sitios idénticos e independientes con estequiometría ajustable.
Figura 1. Isotermas producido por la titulación de AcCoA (3,86 mm) en AAC (6 ')-II (192 M). A) Raw rastro ITC. B) Los valores integrados para la determinación de parámetros de enlace (cuadrados) con un ajuste de 2 sitio secuencial (-).
Figura 2. Isotermas de ITC para AcCoA titulada en AAC (6 ')-II en varias concentraciones. Los datos experimentales (círculos) se ajustaron a un modelo de 2 conjuntos de sitios independientes (magenta discontinua) y un modelo de 2 sitio secuencial (color azul). El modelo de 2 sitio sequentional da claramente un acuerdo mejor en general. Las concentraciones empleadas fueron A) 6 M, 0,25 mm, B) 12 m, 0,25 mm, C) 24 mM, 0,5 mM, D) 48 mM, 1,0 mM, E) 96 mM, 1,9 mM, y F) 196 M, 3,86 mM, para AAC (6 ')-II y AcCoA respectivamente.
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Discussion
Esta porción de análisis de la variable de ajuste-c se ha descrito anteriormente en detalle 10. Aquí mostramos los aspectos prácticos de la recolección variable c conjuntos de datos adecuados para este enfoque. Es esencial que todas las proteínas y las muestras de ligando se han extraído de las soluciones madre misma. Por lo tanto, es importante que la solución de un stock suficiente se preparó inicialmente para completar toda la serie de experimentos. Esto asegura que la proporción de AAC (6 ')-II y AcCoA es constante entre todos los experimentos, y reduce las fluctuaciones aleatorias en la concentración en base a una muestra a muestra.
En este caso, mucho cuidado se debe tomar en el manejo del ligando. AcCoA es químicamente inestable en solución por lo que es esencial que la solución madre permanece en estado líquido durante períodos muy cortos de tiempo. Una vez que la cantidad adecuada es alícuotas de la solución madre, la acción inmediata debe volver a congelar. Si esto no se hace, entonces el AcCoA puede degradarse con el tiempo y la concentración no será correcta en carreras posteriores. Una vez alícuotas, las muestras de AcCoA debe ser utilizado inmediatamente. En el caso de las proteínas que son inestables, las precauciones similares será necesario.
Este procedimiento se puede modificar fácilmente para estudiar otros sistemas complejos. 10 Las concentraciones utilizadas deben adaptarse a las constantes de unión del sistema específico. Una amplia gama de valores de c entre 1 y 1.000 8,10 se requiere de todo el conjunto de datos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC), y una beca de estudios de formación CIHR (a LF). Agradecemos al Prof. Gerard D. Wright (Universidad de McMaster, Canadá) para la AAC (6)-Ii plásmido de expresión.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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