Summary
ITC est un outil puissant pour étudier la liaison d'un ligand à son hôte. Dans les systèmes complexes cependant, plusieurs modèles peuvent ajuster les données aussi bien. La méthode décrite ici fournit un moyen d'élucider le modèle approprié contraignante pour les systèmes complexes et d'extraire les paramètres thermodynamiques correspondants.
Abstract
Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est couramment utilisé pour déterminer les paramètres thermodynamiques associés à la liaison d'un ligand à une macromolécule hôte. ITC a certains avantages sur des approches communes pour étudier par spectroscopie d'hôte / ligand interactions. Par exemple, la chaleur dégagée ou absorbée lorsque les deux composants interagissent est directement mesurée et ne nécessite aucune journalistes exogènes. Ainsi, l'enthalpie de liaison et la constante d'association (Ka) sont obtenues directement à partir de données CCI, et peut être utilisé pour calculer la contribution entropique. Par ailleurs, la forme de l'isotherme est dépendante de la Valeur-C et le modèle mécaniste impliqués. La Valeur-C est défini comme c = n [P] TKA, où [P] l est la concentration en protéines, et n est le nombre de sites de liaison au ligand au sein de l'hôte. Dans de nombreux cas, plusieurs sites de liaison pour un ligand donné ne sont pas équivalents et l'ITC permet la caractérisation des paramètres thermodynamiques de liaison pour chaque site individuel contraignant. Cela exige cependant que le modèle correct contraignante être utilisé. Ce choix peut être problématique si les différents modèles peuvent tenir les mêmes données expérimentales. Nous avons précédemment montré que ce problème peut être contourné en réalisant des expériences dans plusieurs C-valeurs. Les isothermes de multiples obtenues à différentes valeurs de c-sont aptes simultanément à des modèles séparés. Le modèle correct est ensuite identifié sur la base des qualité de l'ajustement sur l'ensemble de variables-c données. Ce processus est appliqué ici à l'aminoglycoside résistance provoquant aminoglycoside enzyme N-acétyl-6'-II (AAC (6 ')-II). Bien que notre méthodologie est applicable à tout système, la nécessité de cette stratégie est mieux démontrée avec un système ligand-macromolécule montrant allostérie ou coopérativité, et quand différents modèles de fixation s'adapte fournissent essentiellement identiques aux mêmes données. À notre connaissance, il n'existe pas de tels systèmes disponibles dans le commerce. AAC (6 ')-II, est un homo-dimère contenant deux sites actifs, en montrant la coopérativité entre les deux sous-unités. Toutefois, les données obtenues à l'ITC d'un seul c-valeur peut être adapté aussi bien à au moins deux modèles différents d'un modèle à deux ensembles de sites indépendants et une à deux sites séquentielle (coopérative) modèle. Grâce à varier le C-valeur comme expliqué ci-dessus, il a été établi que le modèle correct contraignante pour AAC (6 ')-II est un site de deux modèle séquentiel contraignant. Nous décrivons ici les étapes qui doivent être prises lors de la réalisation d'expériences CCI en vue d'obtenir des ensembles de données adapté à la variable c-analyses.
Protocol
1. Préparation des solutions mères
- Purifier la macromolécule d'intérêt. (Dans ce cas, aminoglycoside N-acétyl-6'-II (AAC6'-II), est isolé comme rapporté ailleurs. 13)
- Préparer 4 litres de tampon de dialyse. (Dans ce cas nous avons utilisé 25 mm 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES, MW 238,3 g / mol), contenant 2 mM d'acide éthylène diamine (EDTA, MW 292.2), à pH 7,5.)
- Dialyser la protéine L'AAC (6 ')-II de l'échantillon (5 ml à 400 uM) utilisés doivent être dialysées dans un tampon de dialyse (3 x 1,3 L). La solution de dialyse final est conservé pour rincer la machine et de diluer les échantillons.
- Filtrer la solution de dialyse final à travers un filtre de 0,45 um de cellulose, et conservés à 4 ° C. Sera dénommé «tampon courant"
- Solution de protéines Filtrer à travers un filtre de 0,2 um seringue qui a été rincé avec un tampon d'exécution. Mesurer la concentration finale de la protéine en utilisant un dosage standard (Bradford, Lowry, etc) ou absorbance UV. Magasin de la protéine afin de maximiser la stabilité à long terme. (Dans le cas de l'AAC (6 ')-II, ce moyen de stockage à 4 ° C. AAC (6')-II ne conservent leur activité après congélation et décongélation).
- Préparer 200 pl de 25 mM de solution stock acétyl-coenzyme A (AcCoA, le ligand, MW 809.57) en dissolvant 4,0 mg dans la gestion de la mémoire tampon. Gel à -78 ° C jusqu'au moment de servir.
- Toutes les protéines et les échantillons de ligand doivent provenir du même stock de solutions, afin de minimiser échantillon aléatoire de l'échantillon à des fluctuations dans la concentration. Un seul facteur de correction pour la concentration de protéines dans l'ensemble de variables-c données est ajusté dans l'analyse. 10
2. Préparation des échantillons CCI
- Diluer la solution enzymatique à un c-valeur de 64 avec un volume final de 2 ml. (Dans le cas de l'AAC (6 ')-II, ce qui correspond à 192 pM.)
- Vite dégeler la solution stock ligand (AcCoA) dans l'eau glacée.
- Préparer 0,5 mL d'une solution AcCoA 10 fois plus concentré, puis le nombre de sites de liaison sur la protéine, dans ce cas, 4 mM, en diluant 80 pl de la solution stock dans 420 uL AcCoA de courir tampon. Transférer dans un tube de la pipette de remplissage. Revenir rapidement la solution stock AcCoA à -78 ° C.
- Degas la protéine et des solutions sous vide pendant 5 min à une température de 1 ° C en dessous de la température désirée de fonctionnement (19 ° C).
3. Mise en place de la seringue 14
- Insérer la seringue d'injection à travers porte-seringue jusqu'à ce que l'attache de la seringue pré-monté est à la même hauteur que le titulaire.
- Feed the bride deuxième seringue au cours de la seringue jusqu'à ce qu'il soit fermement pressé contre le fond du porte-seringue. Serrer doucement la pince fournie avec les 0.050 "entraînement hexagonal à bille.
- Porte-seringue place dans le porte-pipette.
- Faites glisser doucement l'injecteur pipette dans la seringue. Assurez-vous que la pointe de piston est alimenté directement dans le trou de la seringue. Une fois entièrement inséré, visser la bague de blocage du titulaire dans l'injecteur pipette.
4. Chargement de la cellule 14 de l'échantillon
- Laver l'échantillon de cellules avec un minimum de 50 ml de tampon de course, et enlever toute trace de liquide en utilisant un long aiguilleté 2,5 ml seringue en verre.
- Lentement dessiner un minimum de 1,8 ml de solution échantillon de protéine dans le propre et sec à long aiguilleté 2,5 ml seringue. Attention à ne pas introduire de bulles.
- Insérez soigneusement l'aiguille dans la cellule de l'échantillon et doucement toucher le fond de la cellule. Soulever la pointe légèrement (~ 1 mm) et d'injecter délicatement AAC (6 ')-II de solution dans la cellule jusqu'à ce que l'excès de liquide est visible au-dessus du haut de la cellule de l'échantillon.
- Soulevez lentement l'aiguille d'environ 1 cm tout en assurant reste liquide dans le débordement. Retirer rapidement et injecter une petite quantité de solution (~ 0,25 ml) pour éliminer les bulles emprisonnées dans la cellule d'échantillon.
- Retirez tous les débordement de solution. Ce résultat est obtenu en faisant délicatement l'aiguille le long côté de déborder dans la cellule d'échantillon. Le bout de la seringue va frapper une corniche, c'est la hauteur désir de la solution fonctionne. Retirer tout le liquide qui se trouve au-dessus de cette ligne.
5. Chargement seringue d'injection et d'initier course de 14
- Fixer la seringue tube en plastique de chargement dans le port de remplissage.
- Pointe de la Basse piston pour le haut de l'orifice de remplissage.
- Placer la solution dans le tube AcCoA pipette de remplissage à bas de la porte-pipette. Le bout de la seringue ne doit pas toucher le fond du tube de remplissage.
- Aspirer lentement la solution dans la seringue jusqu'à ce qu'une petite quantité pénètre dans le tube de la seringue de chargement.
- Fermer l'orifice de remplissage en abaissant le piston et cliquez sur le bouton Fermer l'orifice de remplissage. Purge et recharge, en cliquant sur la Purge-> bouton Recharge, trois fois pour éliminer les bulles d'air qui peuvent avoir été piégés pendant le chargement.
- Retirez le tube de remplissage du porte-pipette et essuyez délicatement l'embout de la seringue.
- Prenez la pipette et l'assemblage de seringues abaisser doucement dans la cellule de l'échantillon. Procéder lentement que la seringue peut facilement plier, donc le plus grand soin est nécessaire. Assurer la seringue est complètement inséré en appuyant sur la base du blocage col.
- Régler la température désirée de fonctionnement (dans ce cas 20 ° C), et sélectionnez une puissance de référence qui est légèrement supérieur au flux de chaleur d'injection maximale prévue (dans ce cas, 20μcal/sec).
- Programme des volumes d'injection désiré et les retards. (Dans ce cas, 28 injections ont été employées. La première injection a un volume de 2 pl avec un retard de 60 s. Toutes les injections suivantes ont des volumes de 10 ul avec des retards 330 s).
6. Des exécutions ultérieures
- Dans tous les exécutions ultérieures répétez les étapes 2-5, tout en diminuant les AAC (6 ')-II et les concentrations AcCoA par un facteur de 2,4,8,16 et 32.
7. Analyse des données
- Utilisez une procédure d'ajustement qui correspond globalement l'ensemble des isothermes d'un ensemble unique de paramètres de liaison, comme décrit précédemment 10.
8. Les résultats représentatifs
Des données représentatives sont présentées dans la figure 1. Les formes des isothermes devrait varier avec la concentration. Sharper transitions sont attendus pour plus c-valeurs (ie protéines élevé et les concentrations de ligand) (figure 2).
Dans le cas de l'AAC (6 ')-II, le modèle à deux sites séquentielle donne un meilleur choix que celui décrivant deux ensembles de produits identiques, avec des sites indépendants stoechiométries réglable.
Isothermes Figure 1. Produite par un titrage des AcCoA (3,86 mM) en AAC (6 ')-II (192 pM). A) trace premières CCI. B) des valeurs intégrées utilisées pour déterminer des paramètres obligatoires (places) avec un ajustement 2 place séquentielle (-).
Figure 2. Isothermes CCI pour AcCoA titré en AAC (6 ')-II à des concentrations variables. Les données expérimentales (cercles ouverts) ont été adaptés à un modèle 2-ensembles-de-sites indépendants (magenta pointillés) et un modèle 2-place séquentielle (solide bleu). Le modèle 2-site sequentional donne clairement un accord globalement meilleure. Les concentrations utilisées étaient de type A) 6 uM, 0,25 mm, B) 12 uM, 0,25 mm, C) 24 uM, 0,5 mM, D) 48 uM, 1,0 mM, E) 96 uM, 1,9 mM, et F) 196 uM, 3,86 mM, pour AAC (6 ')-II et AcCoA respectivement.
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Discussion
Cette partie analytique de variable c montage a été précédemment décrit en détail 10. Nous rapportons ici les aspects pratiques de la collecte variable c ensembles de données adapté à cette approche. Il est essentiel que toutes les protéines et les échantillons de ligand sont tirées des solutions même stock. Il est donc important que la solution stock suffisant est préparé initialement pour compléter la série entière d'expériences. Cela garantit le ratio de l'AAC (6 ')-II et AcCoA est constante entre toutes les expériences, et réduit les fluctuations aléatoires de la concentration sur la base d'un échantillon à échantillon.
Dans ce cas, beaucoup de soin doit être pris dans le traitement du ligand. AcCoA est chimiquement instable en solution de sorte qu'il est essentiel que la solution stock reste liquide pour des périodes de temps très court. Une fois le montant approprié est aliquoté de la solution, le stock doit immédiatement être recongelés. Si cela n'est pas fait, alors le AcCoA peuvent se dégrader avec le temps et la concentration ne sera pas correcte dans les courses plus tard. Une fois aliquotés échantillons AcCoA doit être utilisé immédiatement. Dans le cas des protéines qui sont instables, les mêmes précautions seront nécessaires.
Cette procédure peut être facilement modifié pour étudier d'autres systèmes complexes. 10 Les concentrations utilisées doivent être adaptés aux constantes de liaison du système spécifique. Une large gamme de valeurs c entre 1 et 1000 8,10 est requis à travers le jeu de données.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), en sciences naturelles et en génie (CRSNG), et une bourse d'études de formation des IRSC (pour LF). Nous remercions le professeur Gérard D. Wright (Université McMaster, Canada) pour l'AAC (6)-Ii plasmide d'expression.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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